CN111239124A - 一种利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用二硫化铂的过氧化氢比色检测方法，利用二硫化铂为模拟酶催化过氧化氢与显色剂的显色反应来检测过氧化氢，可解决现有技术中对过氧化氢检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、检测快速、操作方便、能够实现可视化快速检测过氧化氢的浓度，有极大的应用价值，市场前景广阔。

Description

一种利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法
技术领域
本发明属于过氧化氢检测技术领域，具体涉及一种利用二硫化铂的过氧化氢比色检测方法。
背景技术
过氧化氢俗称双氧水，其化学式为H2O2，生物体在进行呼吸代谢的过程中会产生过氧化氢。过氧化氢也是一种无机绿色精细化工产品，被广泛应用于纺织、造纸、化工、电子、环保、食品、化妆品、医药、矿冶和军工等领域。然而，长时间暴露在高浓度的过氧化氢环境中、长期食用残留有过氧化氢的食品或使用过氧化氢含量超标的产品，将严重损害人体健康。在目前已经公布的过氧化氢快速检测相关专利中，电化学的方法(专利申请号：CN201210079336.2、专利申请号：CN200810002293.1、专利申请号：CN201410178346.0、专利申请号：CN201611086229.7)、原子吸收光谱法(专利号：CN200810073667.9)、高效液相色谱法(专利申请号：CN201310684303.5)、荧光光谱法(专利申请号：CN201910384908.X)等大都需凭借昂贵的专业仪器并且在专业技术人员的操作下才能完成对过氧化氢的检测。而过氧化氢快速测定的相关仪器(CN200520016811.7)因其构造复杂，制作过程繁琐，在实际应用中也受到很大的限制。
酶是一种重要的生物催化剂，天然酶通常由蛋白质和RNA分子组成；因此，它们不可避免地存在一些固有的缺点，如提取分离成本高，催化反应条件苛刻，蛋白质易变性、稳定性差，限制了它们的广泛应用。在过去的二十年里，人们做了很多努力来开发新的模拟酶来代替天然酶。模拟酶在苛刻的反应条件下表现出较高的稳定性，具有制备成本低、贮存成本低、结构设计灵活、催化活性可调等优点。比色法由于其简单、低成本和不需要任何精密仪器的优点，在便携式和廉价的日常应用中显示出巨大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用二硫化铂的过氧化氢比色检测方法，利用二硫化铂为模拟酶催化过氧化氢与显色剂的显色反应来检测过氧化氢，可解决现有技术中对过氧化氢检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、检测快速、操作方便、能够实现可视化快速检测过氧化氢的浓度，有极大的应用价值，市场前景广阔。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用二氧化铂的过氧化氢比色检测法，利用二硫化铂为模拟酶催化过氧化氢与显色剂的显色反应，检测过氧化氢。
上述利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，主要包括如下步骤：
步骤1，配制含有过氧化氢的样品溶液、二硫化铂溶液(10μg/mL)、显色剂溶液以及磷酸二氢钠缓冲溶液；
步骤2，将步骤1含有过氧化氢的样品溶液与二硫化铂溶液、显色剂溶液、缓冲溶液混合进行反应；
步骤3，通过目视比色法或者紫外-可见分光光度计法检测过氧化氢。
优选的，所述步骤3中，目视比色法是指，将反应完成后溶液的颜色与比色标准系列进行比较，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用目视比色法半定量测定过氧化氢的浓度；
其中，所述比色标准系列的制备是将已知的不同浓度的过氧化氢标准溶液与二硫化铂溶液、显色剂溶液、缓冲液混合进行显色反应，得到比色标准系列，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应得到比色标准系列。
优选的，所述步骤3中，紫外-可见分光光度计法是指，反应完成后采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线方程计算过氧化氢的含量；
所述标准曲线方程的建立是将已知的含有不同浓度的过氧化氢标准溶液与二硫化铂溶液、显色剂混合进行显色反应，然后直接采用紫外-可见分光光度计在652nm波长处测定吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计在450nm波长处测定吸光度，并以吸光度作为纵坐标，过氧化氢的浓度作为横坐标，绘制标准曲线并得出标准曲线方程。
优选的，所用缓冲溶液为磷酸氢二钠缓冲溶液，pH值在2-7，浓度为25mM。
更优选的，所述磷酸氢二钠缓冲溶液pH为5.0。
优选的，所用显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺。
优选的，所述显色反应的温度为20～70℃。
优选的，所述硫酸溶液的浓度为1mol/L。
有益效果
本发明提供的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)本方法通过二硫化铂催化显色剂显色，产生明显的颜色变化，以指示过氧化氢的不同浓度；过氧化氢浓度不同，则溶液颜色及颜色深浅均不同；通过肉眼观察即可判断过氧化氢是否超标，而不必借助任何仪器，因此检测成本低，操作简便；
(2)本方法所使用的二硫化铂无需进行修饰即可用于过氧化氢的检测，并且二硫化铂性质稳定、保存方便、生物安全性高；
(3)本方法利用紫外-可见分光光度法对过氧化氢的检测限可以达到0.33μM，线性范围为1μM到100μM(R2＝0.9991)；
(4)本方法的酶催化反应条件温和，检测时间短，且无需昂贵的检测仪器，操作简便，可实现过氧化氢可视化快速识别和检测。
附图说明
图1为本发明三个实施例中三种显色剂分别检测过氧化氢的溶液颜色变化；
图2为本发明实施案例1中二硫化铂的催化性能；
图3为本发明实施案例2中加入硫酸前后的溶液颜色变化；
图4为本发明实施例2中以过氧化氢浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
过氧化氢的检测：将50μL含过氧化氢的样品溶液与35μL含二硫化铂溶液、显色剂和磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 2-7)混合，反应后10min即可依据颜色变化通过目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-分光光度法在最大波长处测定吸光度进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，通过目视比色法进行半定量分析或利用紫外-分光光度法在最大波长处测定吸光度进行定量分析。
标准比色系列：将二硫化铂溶液，显色剂和磷酸氢二钠缓冲溶液，混匀后，再加入不同浓度的过氧化氢标准溶液，混合均匀，20～70℃下显色反应10min后直接作为比色标准系列，或通过加入硫酸溶液终止反应后再作为比色标准系列。
所用显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)或邻苯二胺(OPD)。
实施例1二硫化铂的催化性能
不同pH下的催化性能：将50μL过氧化氢样品溶液(600mM)与15μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)或15μL的辣根过氧化物酶溶液(HRP,160mM),15μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(41.6mM)和2920μL pH 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM)分别混合，常温下反应后4min都可产生明显颜色变化，利用紫外-分光光度法在652nm波长处测定吸光度进行分析，如图2(a)所示，二硫化铂催化该反应的最佳pH为5.0，与HRP相比，二硫化铂在pH为2.0和7.0时均具一定的催化活性；说明本申请的方法在pH 2-7范围内，催化性能稳定。
不同温度下的催化性能：将50μL过氧化氢样品溶液(600mM)与15μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)或15μL的辣根过氧化物酶溶液(HRP,160mM),15μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(41.6mM)和2920μL的磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)分别混合，立即放入不同温度的水浴锅中，温度依次为20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,70℃,反应后4min都可产生明显颜色变化利用紫外-分光光度法在652nm波长处测定吸光度进行分析，如图2(b)所示，二硫化铂催化该反应的最佳温度为40℃，二硫化铂在温度范围为20-70℃时催化活性均比HRP的高；说明本申请的方法在20-70℃范围内，催化性能稳定。
不同过氧化氢浓度下的催化性能：将50μL 0-500mM的过氧化氢样品溶液与15μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)或15μL的辣根过氧化物酶溶液(HRP,160mM),15μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(41.6mM)和2920μL的磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)分别混合，常温下反应后4min都可产生明显颜色变化，利用紫外-分光光度法在652nm波长处测定吸光度进行分析，如图2(c)所示，与HRP在较高浓度的过氧化氢存在下，催化活性受到抑制相比，二硫化铂在0-500mM的过氧化氢存在下，都能保持很高的催化活性，说明本申请的方法在0-500mM的过氧化氢浓度下，催化性能稳定。
实施例2
对水溶液中过氧化氢的检测：将50μL过氧化氢样品溶液与35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),17.5μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(41.6mM)和2897.5μL磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)混合，反应后10min即可产生明显颜色变化，如图3(左)所示，可依据颜色变化通过目视比色法进行半定量分析，或加入500μL硫酸(1mol/L)后，如图3(右)所示，利用紫外-分光光度法在450nm波长处测定吸光度进行定量分析。
标准比色系列：将35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)，17.5μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(41.6mM)和2897.5μL磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)，混匀后，再加入50μL不同浓度的过氧化氢标准溶液，其浓度依次为0μM，1μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM混合均匀，40℃下显色反应10min后，通过目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-分光光度法在652nm波长处测定吸光度进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，通过目视比色法进行半定量分析或利用紫外-分光光度法在450nm波长处测定吸光度进行定量分析。
结果显示，随着过氧化氢浓度的增加，溶液颜色由浅黄色到浅绿色再到深蓝色。加入硫酸终止反应后，溶液在450nm处的吸光度逐渐增大，溶液颜色由浅黄色到深黄色，线性方程Y＝0.1846+0.0021X，R2＝0.9991，以此颜色变化作为比色标准系列。
实施例3
对水溶液中过氧化氢的检测：将50μL过氧化氢样品溶液与35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),100μL的邻苯二胺(0.5M)和2815μL磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)混合，反应后10min即可产生明显颜色变化，可依据颜色变化通过目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-分光光度法在450nm波长处测定吸光度进行定量分析。
标准比色系列：将35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)，100μL的邻苯二胺(0.5M)和2815μL磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)，混匀后，再加入50μL不同浓度的过氧化氢标准溶液，其浓度依次为0μM，1μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM混合均匀，70℃下显色反应10min后，后直接作为比色标准系列。
实施例4
对水溶液中过氧化氢的检测：将50μL过氧化氢样品溶液与35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),100μL的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(20mM)和2815μL磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)混合，反应后10min即可产生明显颜色变化，可依据颜色变化通过目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-分光光度法在405nm波长处测定吸光度进行定量分析。
标准比色系列：将35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)，100μL的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(20mM)和2815μL磷酸氢二钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)，混匀后，再加入50μL不同浓度的过氧化氢标准溶液，其浓度依次为0μM，1μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM混合均匀，20℃下显色反应10min后，后直接作为比色标准系列。
本发明利用二硫化铂为模拟酶催化过氧化氢与显色剂的显色反应来检测过氧化氢，本方法通过二硫化铂催化显色剂显色产生明显的颜色变化来指示不同浓度的过氧化氢。随着过氧化氢浓度的不同，溶液颜色不同或者颜色深浅不同；可以不必凭借任何仪器，通过肉眼观察即可判断过氧化氢是否超标，因此检测成本低，操作简便。而分光光度法对过氧化氢的检测限可以达到0.33μM，线性范围为1μM到100μM(R2＝0.9991)。本发明的酶催化反应条件温和，检测时间短，重现性好，操作简便。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，利用二氧化铂为模拟酶催化过氧化氢与显色剂的显色反应，检测过氧化氢。
2.根据权利要求1所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，主要包括如下步骤：
步骤1，配制含有过氧化氢的样品溶液、二硫化铂溶液、显色剂溶液以及缓冲溶液；
步骤2，将步骤1含有过氧化氢的样品溶液与二硫化铂溶液、显色剂溶液、缓冲溶液混合进行反应；
步骤3，通过目视比色法或者紫外-可见分光光度计法检测过氧化氢。
3.根据权利要求2所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所述步骤3中，目视比色法是指，将反应完成后溶液的颜色与比色标准系列进行比较，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用目视比色法半定量测定过氧化氢的浓度。
4.根据权利要求3所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所述比色标准系列的制备是将已知的不同浓度的过氧化氢标准溶液与二硫化铂溶液、显色剂溶液、缓冲溶液混合进行显色反应，得到比色标准系列，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应得到比色标准系列。
5.根据权利要求2所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所述步骤3中，紫外-可见分光光度计法是指，反应完成后采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线方程计算过氧化氢的含量。
6. 根据权利要求5所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立是将已知的含有不同浓度的过氧化氢标准溶液与二硫化铂溶液、显色剂混合进行显色反应，然后直接采用紫外-可见分光光度计在652 nm波长处测定吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计在450 nm波长处测定吸光度，并以吸光度作为纵坐标，过氧化氢的浓度作为横坐标，绘制标准曲线并得出标准曲线方程。
7. 根据权利要求2所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所用缓冲溶液为pH 2-7、25 mM的磷酸氢二钠缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所用显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺。
9. 根据权利要求1所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所述显色反应的温度为20 ~70℃。
10. 根据权利要求3或5所述的利用二硫化铂的过氧化氢比色检测法，其特征在于，所述硫酸溶液的浓度为1 mol/L。
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