CN109164100B

CN109164100B - 一种快速检测农药的试纸条

Info

Publication number: CN109164100B
Application number: CN201811274435.XA
Authority: CN
Inventors: 韩磊; 吴加慧
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: CN109164100A

Abstract

本发明涉及纳米催化、环境保护、分析化学领域，具体包括一种快速检测农药的试纸条。在试纸条上原位生成具有仿过氧化物酶活性的四氧化三铁纳米粒子并修饰上乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶，当有机磷农药存在时，会不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱水解生成的胆碱的量降低，导致通过级联反应生成的过氧化氢减少，显色底物显色变浅。而且，通过试纸的层析现象可排除样品中其他物质的干扰。通过手机拍照及手机软件分析可实现对乙酰胆碱的便捷定量检测。本发明可用于农药残留分析、生物医药、环境监测等领域。

Description

一种快速检测农药的试纸条

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体包括一种快速检测农药的试纸条。

技术背景

有机磷农药（Organophosphorus Pesticide, OP）是使用最广泛的农业杀虫剂，在提高农业生产力与防止病虫害等方面发挥着重要作用。但有机磷农药会抑制人体内乙酰胆碱酯酶的活性从而导致人类多种疾病，如老年痴呆症、帕金森氏病和中风等。同时，由于有机磷农药的高残留特性及在农业生产上存在严重的过度使用或不规范操作，导致农产品上农药的高含量残留，严重威胁生态环境平衡。因此，构建高灵敏检测平台，实现农药的简便、快速、高灵敏检测具有重要的实际应用价值。

迄今，许多方法已成功应用于有机磷农药的传感检测，如高效液相色谱，气质联用，电化学分析等。但是，这些方法往往具有较长的样品前处理时间，通常需要3-4天、需要特殊的专业人员、并且依赖于昂贵的大型仪器等缺点，这些缺点严重限制了上述方法在农药残留检测领域中的大规模应用。

纳米酶是一种新型的模拟酶，由于其优异的催化活性和在生物传感、食品工艺、环境保护等方面有潜在应用价值而成为人们关注的焦点。纳米酶克服了天然酶的许多缺点，如价格昂贵、易失活和储存条件要求苛刻等，对生物传感、免疫分析、癌症诊断和治疗等领域产生了巨大影响。目前已报道四氧化三铁纳米酶具有仿过氧化物酶活性，可催化氧化过氧化氢（H₂O₂）氧化有机显色底物而产生颜色变化。目前，关于纸上原位生成纳米酶的报道还很少见。

试纸条相对于其他的检测方式，具有体积小，储存方便，测试简单携带方便等优点而广受人们欢迎。目前，一些尿糖试纸、HIV试纸、毒品检测试纸均有人进行报道，但关于原位生成纳米酶并与智能手机相结合用于农药检测的试纸条的报道还很少见。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测农药的试纸条。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速检测农药的试纸条，所述的试纸条可对农药进行定性定量分析。

优选的是，所述一种快速检测农药的试纸条，其制备过程如下：

（1）将滤膜使用裁纸机裁剪成尺寸为0.2×2.5 cm的滤膜条；

（2）使用夹子固定上述滤膜条的两端，并在滤膜条的下沿1-2 cm处留一条2 mm的缝隙；

（3）将10%的牛血清蛋白（BSA）溶液、1 mmol/L的羟基丁二酰亚胺（NHS）、0.5 mmol/L的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）等体积混合液滴加到上述滤膜缝隙中，室温下孵育30 min后，水洗并干燥；

（4）将4 mmol/L的氯化铁溶液（FeCl₃）、2 mmol/L的氯化亚铁溶液（FeCl₂）和16mmol/L的氨水等体积按顺序依次均匀分散到上步中所得到的滤膜缝隙中，室温下孵育1 h后，水洗并干燥，此滤膜缝隙即为检测条带；

（5）将一定浓度的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶分别滴加到上述的滤膜缝隙上，孵育1 h后，水洗并干燥，即可得检测农药的试纸条。

进一步优选的是所述试纸可以为尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚四氟乙烯膜。

再一步优选的是，使用过程如下：

（1）将农药样品、乙酰胆碱和有机显色剂（2, 2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）或3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺（TMB））均匀分散在溶液中，将试纸条下沿（液面距离试纸条下边缘小于1 cm）浸入到混合溶液中作为实验组，将试纸条下沿浸入到仅含乙酰胆碱和有机显色剂而不含农药样品的溶液中作为对照组；

（2）2-5分钟后，取出试纸条，观察试纸条检测条带的颜色，若实验组颜色比对照组颜色浅，则含有农药；

（3）在LED灯的照射下，使用智能手机拍照，使用颜色识别器读取检测试纸条上的RGB值，并将其具体数值代入到标准曲线方程中，对农药进行定量检测。

再更一步优选的是，所述的农药可以为有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药。

本发明的效果是：

1. 本发明制备了可快速、现场检测农药的定性定量试纸条；

2. 本发明通过在纸上原位生成Fe₃O₄仿酶材料，而简化试纸条制备步骤；

3. 本发明利用原位生成Fe₃O₄仿酶材料上的BSA实现两种生物酶的快速固定，提高了天然酶的稳定性，并可改变天然酶的活性pH范围，使两种生物酶与仿酶材料同时发挥活性；

4. 本发明所制备的试纸条可通过层析策略排除真实样品中色素剂及其他杂质的干扰。

附图说明

图1为本发明实施例提供的试纸条检测农药示意图；

图2为本发明实施例提供的试纸条活性农药抑制效果图；

图3为本发明实施例提供的试纸条检测照片；

图4为本发明实施例提供的农药检测工作曲线。

具体实施方式

为了更清楚更深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例1

农药检测试纸条的制备

（1）将滤膜使用裁纸机裁剪成尺寸为0.2×2.5 cm的滤膜条；

（2）使用夹子固定滤膜条的两端，并在滤膜条的下沿1-2 cm处留一条2 mm的缝隙，用于后续试纸条的制备；

（3）将10%的牛血清蛋白（BSA）溶液、1 mmol/L的NHS、0.5 mmol/L的EDC等体积混合液滴加到上述试纸条缝隙中（BSA用于提高尼龙滤膜的吸附能力并作为下一步反应的模板，EDC/NHS则是为了活化BSA是上的羧基），室温下孵育30 min后，水洗并干燥；

（4）将4 mmol/L的FeCl₃、2 mmol/L的FeCl₂和16 mmol/L的氨水等体积按顺序依次均匀分散到上步中所得到的滤膜缝隙中，用以原位生成以BSA为模板的四氧化三铁仿酶材料（Fe₃O₄@BSA），室温下孵育1 h后，水洗并干燥；

（5）将一定浓度的AchE和ChOx分别滴加到上述的滤膜缝隙上，从而将Fe₃O₄@BSA 上的羧基与酶上的氨基通过酰胺反应连接到一起，水洗掉未连接的酶后在室温下晾干，将夹子移除即可得到农药检测试纸条。

实施例2

该试纸条中的检测区域在弱酸性条件下具有AchE、ChOx与仿过氧化物酶的活性，AchE可催化Ach生成胆碱，ChOx则可催化胆碱生成H₂O₂，仿过氧化物酶则催化H₂O₂和有机显色剂发生显色反应，当农药存在时，会不可逆的抑制AchE的活性，从而导致级联反应生成的H₂O₂减少，有机显色剂的颜色变浅，检测示意图见说明书附图1。

试纸条活性农药抑制效果验证：

实验体系a：催化反应体系为包含Ach的样品溶液（0.1 mmol/L）、实施例1获得的检测试纸条碎片、有机显色剂TMB（0.5 mmol/L）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0，100 mmol/L）。在室温（25 ℃）下将检测条带浸入含Ach和TMB的缓冲溶液中反应5 min后，离心将检测试纸条移除，利用紫外分光光度计检测上清液在500-800 nm内的吸光值。

另做三个不同的实验体系：反应体系b为催化反应体系a中不加检测试纸条，在与上述实验体系同样条件下反应5分钟后检测吸光值；催化反应体系c仅为检测试纸条浸入醋酸盐缓冲液（pH 4.0，100 mmol/L）中，在与上述实验体系同样条件下静置5分钟后检测吸光值；反应体系d为实验体系a中加入30 μmol/L的OP后，其他实验条件与上述实验体系同样条件下反应5分钟后检测吸光值。

如说明书附图2所示，实验体系a在650 nm附近显示出明显的峰，说明检测试纸条在pH 4.0处具有明显的三酶的活性；试验体系b无明显的峰，说明若无检测条带作催化剂将无明显反应；试验体系c在650 nm附近无明显的峰，说明实验体系a的峰不是检测试纸条自身的响应峰；实验体系d显示出的峰比曲线a要低，说明检测试纸条在加入OP后其活性遭到了抑制，证明了本实验方案的可行性。

实施例3

OP的定性分析

具体体系：准备两张前面制备好的试纸条，其中一张试纸条下沿浸入到含有Ach（1mM）和TMB（0.5 mmol/L）的弱酸性溶液，另一张试纸条则浸入到含有OP（50 pmol/L）、Ach（1 mmol/L）和TMB（0.5 mmol/L）的弱酸性溶液，2-5 min 后，观测两检测试纸的颜色。如说明书附图3所示，无OP的试纸条颜色要比有OP的颜色深，说明本方案所制备的试纸条可实验对OP进行定性检测。

实施例4

OP的定量检测

检测体系包括：乙酰胆碱（1 mM）、配置不同浓度的有机磷农药（0-500 pM）、TMB（0.5 mM）,将前面所制备的试纸条分别浸入到含有不同浓度OP的溶液中，并按检测浓度从小到大的顺序将试纸条进行排序，2 min后在LED灯的照射下用智能手机拍照，使用颜色识别器读取具体的RGB值，并由RGB值计算其标准工作曲线。经处理后取B_N为最终参数，且B_N=B/(R+G+B)，具体工作曲线如图4所示，线性范围为0-300 pM，方程为: y=-0.0027x+0.89（R²=0.9983），说明所制备的试纸条可以定量检测OP。

Claims

1.一种快速检测农药的试纸条的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

(1)将滤膜用裁纸机裁剪成尺寸为0.2×2.5 cm的滤膜条；

(2)使用夹子固定上述滤膜条的两端,并在滤膜条的下沿1-2 cm处留一条2 mm的缝隙；(3)将10%的牛血清蛋白(BSA)溶液、1 mmol/L的羟基丁二酰亚胺(NHS)、0.5 mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)等体积混合液滴加到上述滤膜缝隙中，室温下孵育30 min后，水洗并干燥；

(4)将4 mmo1/L的氯化铁溶液(FeCl₃)、2 mmol/L的氯化亚铁溶液(FeC1₂)和16 mmol/L的氨水等体积按顺序依次均匀分散到上步中所得到的滤膜缝隙中，室温下孵育l h后，水洗并干燥，此滤膜缝隙即为检测条带；

(5)将乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的溶液分别滴加到上述的滤膜缝隙上，孵育l h后，水洗并干燥，即可得检测农药的试纸条。

2.根据权利要求l所述的一种快速检测农药的试纸条的制备方法，其特征在于：所述滤膜为尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚四氟乙烯膜其中之一。

3.根据权利要求1所述的制备方法制备的快速检测农药的试纸条的应用，其特征在于其应用过程如下：

(1)将试纸条下沿浸入到含有农药样品、乙酰胆碱和有机显色剂的溶液中，作为实验组；将试纸条下沿浸入到仅含乙酰胆碱和有机显色剂而不含农药样品的溶液中，作为对照组；所述有机显色剂为2，2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐或3，3'，5，5'-四甲基联苯胺；

(2)2-5分钟后，取出试纸条，观察试纸条检测条带的颜色，若实验组颜色比对照组颜色浅,则含有农药；

(3)在LED灯的照射下，使用智能手机拍照，使用颜色识别器读取检测试纸条上的RGB值，并将其具体数值代入到标准曲线方程中，对农药进行定量检测。