CN110006885A - 一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双酶‑无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法。所述方法包括将醇氧化酶(AOX)、辣根过氧化物酶(HRP)、CaCl2溶液加入磷酸盐缓冲溶液中，室温静置反应，得到双酶‑无机纳米花复合材料(AOHNF)。反应条件简单，得到的材料酶活性和稳定性均显著增强。再利用AOX催化氧化溶液中酒精发生反应生成H2O2，HRP催化TMB与H2O2反应使溶液呈现蓝色，测定吸收波长在650nm处的吸光度，从而得出溶液中酒精浓度的大小。分析方法操作简单，检测结果灵敏度高。本发明所述的基于双酶‑无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等特点，发展前景良好。
Description
技术领域
本发明属于定量分析领域，具体涉及一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法。
背景技术
随着时代的发展，高灵敏度、高选择性和高准确度的醇类化合物的检测在许多不同的领域应用广泛，快速、灵敏、选择和定量地检测醇类物质对于执法、化工、制药和发酵等行业也具有重要意义，其中精确和快速测定乙醇含量在临床和法医分析中非常重要。此外，简单、快速和经济的酒精分析方法也在纸浆、食品和饮料行业中被用来控制发酵过程及其产品的质量。在交通执法、法医、临床分析等过程中，常用的酒精检测技术为呼气检测法、唾液检测法、尿液血液检测法。呼气法是一种非侵入式、便捷且快速诊断的方法，一般使用呼气式酒精检测仪来进行测定，通常口气中的酒精含量不稳定，易受被测者呼气量、口腔残留有未吸收酒精等的影响，造成测定结果出现错误；唾液法则主要是使用酶试纸条进行测定，这种方法快速、便宜且易操作，一般在急诊科室中较常应用；尿液检测法是指通过提取当事人的尿液进行尿液酒精浓度检测，血液检测法主要是提取血液中的乙醇来检测其含量，通常在处理一些事故并将其作为依据时使用这种方法。利用酶法进行血、尿酒精浓度的检测具有很好的精准性、重复性和特异性，但无法现场检测，只能交由专业机构室内测试，若送检不及时会出现较大的误差。
近年来，已经报道了很多用于酒精测定的方法，如比色法、色谱法、氧化还原滴定法、折射率法等，其中比色法和色谱法是应用相对较多的方法。传统比色法主要是使用重铬酸钾进行测定，但其有一个缺点是不符合“比尔定律”，其中的一种氧化产物铬离子为绿色，它以不同的浓度与正在测量的黄色重铬酸根离子混合，使比色结果出现误差，导致测定结果失去稳定性。色谱法用于血液或体液中酒精的检测，现常用顶空采样和直接样品注射两项技术来代替以前的溶剂提取或蒸馏的方法，自动化高，测定结果稳定可靠，但该方法的测定过程较复杂，容易对注射口、柱子等造成污染，且耗费时间较长，无法满足对酒精进行快速定量测定的要求。为了克服这些缺点，出现了基于NAD+依赖性醇脱氢酶或醇氧化酶的各种醇生物传感器对酒精进行分析测试，这些方法主要是利用生物酶对醇类物质的催化活性，目前也已成功的运用在监控刑事司法中的酒精犯罪者、医疗监护以及发酵过程中酒精的测定。这类传感器具有高选择性，但是其相关的使用费用很高，且无法充分解决酒精检测的缺点，例如低灵敏度、低稳定性和在实际应用中的狭窄的线性操作范围。生物酶稳定性低，不容易长期保存，易失活，这给以上通过生物酶来进行酒精检测的方法带来了一定的局限性。
酶作为多功能工具，由于其独特的性质，如高反应特异性、高催化活性和低毒性而被广泛研究，但天然游离酶存在一些固有的缺点，如制备和纯化成本高、操作稳定性低、催化活性对环境条件敏感以及难以回收。为了克服这些缺点，已经报道提出了将酶固定化的概念，将酶嵌入纳米材料成为近年来研究的热点。研究表明，固定在纳米材料上的酶具有比天然酶更宽的pH和温度适应范围以及更高的热稳定性的特点。由于三维结构的纳米材料在表面积、反应活性、稳定性等方面优于其他纳米材料，因此三维纳米材料成为近年来研究酶固定的热点。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法。该方法主要是利用酶与无机材料形成花状的纳米结构，构建双酶-无机纳米花来对酒精进行测定。该反应体系涉及到了醇氧化酶和辣根过氧化物酶两种酶，属于多酶级联反应，其主要优点在于酶的活性位点在纳米材料中彼此靠近，缩小酶与反应物之间的距离，使反应中酶中间体的扩散最小化，增大酶周围的反应物浓度，由此增强总的反应效率和特异性。本发明选择无机磷酸盐为载体来固定醇氧化酶AOX和辣根过氧化物酶HRP，从而实现多酶共固定反应体系。这种双酶-无机纳米花与游离酶相比，酶活性和稳定性均显著增强。从而提高了酒精检测的灵敏度。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，包括以下步骤：
步骤1)先将醇氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液加入磷酸盐缓冲溶液中，然后加入CaCl2溶液，混合，静置，反应结束后离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，即制得双酶-无机纳米花复合材料；
步骤2)将步骤1)制得的双酶-无机纳米花复合材料与一系列不同酒精浓度的样品溶液混合，加入显色剂，进行紫外-可见分光光谱扫描，记录吸光度值，以酒精浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到标准曲线；
步骤3)根据标准曲线法，即可得到所测样品的酒精浓度。
优选地，步骤1)所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM。
优选地，步骤1)所述CaCl2溶液的浓度为100mM。
优选地，步骤1)所述反应的温度为30℃，反应时长48h。
优选地，步骤2)所述显色剂为TMB溶液。
本发明提供的基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，通过将醇氧化酶和辣根过氧化物酶共固定在无机磷酸盐骨架上形成纳米花状结构，有效地增大了反应的接触面积，最大限度的防止中间产物的流失，同时又维持了较大的酶活性，用于酒精定量分析检测，提高了检测的灵敏度，同时，操作方法简单、快速，稳定性高。更具体的说，本发明的有益效果如下：
(1)多酶联合的无机纳米花复合材料制备在常温常压下，不需任何有机试剂，操作简单，材料形貌特殊，具有高的比表面积，大大提高了酶的活性和稳定性。
(2)检测酒精只需通过紫外-可见分光光度计即可完成，不需要复杂操作，不需要大型仪器，更加方便实用。
(3)实验测得酒精定量分析的线性范围为0.1～2.5mg/mL，在我国，体内酒精浓度≥0.2mg/mL时被判定为酒驾，体内酒精浓度≥0.8mg/mL时被判定为醉驾，此方法可很好地应用于酒驾的准确定量判断。
附图说明
图1为双酶-无机纳米花复合材料(AOHNF)的制备方法图；
图2为双酶-无机纳米花复合材料的SEM图；
图3为酒精定量分析检测得到的可见分光光谱图；
图4为酒精定量分析方法所测得的650nm处吸光度值随酒精浓度的变化关系图。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，包括以下步骤：
(1)制备双酶-无机纳米花复合材料：如图1所示，将醇氧化酶(AOX)溶液1.0mg/mL、辣根过氧化物酶(HRP)1.0mg/mL各15μL加入到1.41mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，再将168μL 100mM的CaCl2溶液加入以上溶液中，混合均匀后静置，于30℃下温育48h后拿出，然后以10000r/min的转速离心15min，去除上清液，再加入150μL的PBS，混合均匀，即可得到实验所需的双酶-无机纳米花复合材料(AOHNF)。
如图2所示，双酶-无机纳米花复合材料通过SEM表征，双酶-无机纳米花复合材料为均匀的纳米花状球，平均直径约为6μm，分布均匀，形貌均一，具有良好的分散性和多层三维结构。
(2)酒精定量检测：首先配制不同浓度的酒精溶液(0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2、1.5、1.75、2.0、2.2、2.5，单位均为mg/mL)，将5μL的AOHNF分别与100μL不同浓度的酒精溶液混合均匀，置于恒温培养箱中，37℃温育5min后，加入100μL的TMB溶液，再次置于恒温培养箱中，37℃温育5min。通过紫外-可见分光光度计，利用350μL的微量比色皿测定反应后溶液的吸收峰光谱图。
在醇氧化酶氧化分解酒精的过程中，产生了H2O2，双酶-无机纳米花复合材料中的另一种酶——HRP利用H2O2并将TMB作为其底物进行催化反应，最终生成蓝色物质，且溶液颜色随酒精浓度的升高而逐渐加深。而不同浓度的酒精溶液与AOHNF反应后在波长为650nm处的吸光度也不同，图3为酒精浓度与波长在650nm处吸光度的关系，随着酒精浓度从0mg/mL升高到2.5mg/mL，吸光度也逐渐增大，增长幅度在酒精浓度为0.1～2.0mg/mL间最为明显。因此该检测方法的检测范围为0.1～2.5mg/mL。
不同浓度的酒精与AOHNF反应后在波长为650nm处的吸光度与酒精浓度成正比，如图4所示，其线性回归方程为Y＝0.08974X+0.06762，X表示酒精的浓度(mg/mL)，Y表示对应的吸光度。因此当我们得到一个未知浓度的酒精溶液时，只需要测定其反应后的吸光度，然后从线性关系找出其对应的酒精浓度，即可得知原酒精溶液的浓度。与国家行业标准规定的顶空气相色谱方法相比，标准中的酒精样品需在顶空进样器或恒温加热器中70℃加热15min待测，而本方法只需要10min来制备待测样品，与标准方法所需时间相比更省时，并且在标准方法中，制备好的待检样品还需进入气相色谱仪，通过记录检材和添加检材中的乙醇和叔丁醇峰面面积，来对待测样品进行最终的定量测试，而本方法只需要测定制备好的待检样品的吸光度即可测定原溶液的酒精浓度，检测流程更加便捷。
Claims (5)
1.一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)先将醇氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液加入磷酸盐缓冲溶液中，然后加入CaCl2溶液，混合，静置，反应结束后离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，即制得双酶-无机纳米花复合材料；
步骤2)将步骤1)制得的双酶-无机纳米花复合材料与一系列不同酒精浓度的样品溶液混合，加入显色剂，进行紫外-可见分光光谱扫描，记录吸光度值，以酒精浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到标准曲线；
步骤3)根据标准曲线法，即可得到所测样品的酒精浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，其特征在于，步骤1)所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM。
3.根据权利要求1所述的一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，其特征在于，步骤1)所述CaCl2溶液的浓度为100mM。
4.根据权利要求1所述的一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，其特征在于，步骤1)所述反应的温度为30℃，反应时长48h。
5.根据权利要求1所述的一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法，其特征在于，步骤2)所述显色剂为TMB溶液。
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