CN111235177A

CN111235177A - CRISPR/Cas9***敲除银白杨PDS基因及其应用

Info

Publication number: CN111235177A
Application number: CN202010083041.7A
Authority: CN
Inventors: 曾庆银; 刘妍婧; 姜鹏飞; 王晓霞; 韩学敏
Original assignee: CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-02-07
Also published as: CN111235177B

Abstract

本发明涉及CRISPR/Cas9***敲除银白杨PDS基因及其应用，属于分子育种技术领域。本发明所述银白杨八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述靶位点能够实现对PDS基因的定点编辑，靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明为木本模式植物的基因功能研究提供了新的方案，建立了我国本土树种银白杨分子育种平台，为定向培育适应我国经济发展需求的林木新品种提供了技术支持。

Description

CRISPR/Cas9***敲除银白杨PDS基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，具体涉及PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9***作为一种全新的基因编辑工具，正在被广泛地研究与应用。目前一部分模式树种已经实现了基因编辑，但是由于林木具有多年生、世代周期长、基因组杂合性高等特点，导致了在林木基因编辑过程中仍然存在遗传稳定性差、遗传转化效率低以及脱靶效应严重等问题。因此，需要针对林木继续开展基因组编辑体系的改造与优化。

发明内容

本发明的目的在于提供PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用。本发明所述靶位点能够实现对银白杨八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的定点编辑，获得具有PDS基因功能缺失的银白杨植株，通过对突变体植株性状的研究探讨PDS基因的功能。本发明能够促进对我国本土树种银白杨的基因功能研究，为定向培育适应我国经济发展需求的林木新品种提供技术支持。

本发明提供了PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用，所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述靶基因的靶位点，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

还提供了上述技术方案所述靶位点的接头引物，所述接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PDS-gRNA2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的PDS-gRNA2-R。

本发明还提供了基于上述技术方案所述靶位点或上述技术方案所述接头引物制备得到的gRNA表达盒。

本发明还提供了基于上述技术方案所述靶位点或上述技术方案所述接头引物或上述技术方案所述gRNA表达盒制备得到的CRISPR/Cas9***用载体。

本发明还提供了上述技术方案所述靶位点或上述技术方案所述接头引物或上述技术方案所述gRNA表达盒或上述技术方案所述CRISPR/Cas9载体在敲除银白杨PDS基因中的应用。

本发明提供了PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用。以银白杨PDS基因的序列为靶基因模板筛选得到靶位点，构建相应的Cas9载体，通过农杆菌介导转入银白杨植株，成功对PDS基因进行了敲除，获得白化阳性苗。通过对PDS基因的定点编辑，能够验证本发明***能够对银白杨基因进行有针对性的高效定点敲除，这将极大促进对我国本土树种银白杨的基因功能的研究，为定向培育适应我国经济发展需求的林木新品种提供技术支持。

附图说明

图1为本发明提供的银白杨遗传转化过程；

图2为本发明提供的野生型银白杨再生苗(左)和敲除PDS基因的银白杨再生苗(右)；

图3为本发明提供的鉴定银白杨白化苗中PDS基因靶位点处的序列。

具体实施方式

本发明提供了PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用，所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGAGTGCATTGAACTTGAGCTGGCATAGTAAATCATTAGACTCTCAAGTTGCCTTGAGATGTGGCGCTTATCCTACTTGTTCTCACCAAACGAATGCACTAGCTTTTAGAGGCAGTGAATCAATGGGCCATTCTTTGAAATTCCCATTTGGAAATTCTTCTGCTAAAACAAGACTAAGGAATCATATCCGCCCTCCTTTGCGGGTTGTCTGTATGGACTATCCAAGACCGGACCTTGATAACACGGTGAATTTCTTAGAGGCTGCCTTGTTATCTTCATCCTTTCGTTCTTCTCCGCGTCCAGCTAAACCATTAAATGTTGTCATTGCTGGTGCAGGTTTGGCGGGTTTATCGACTGCAAAATACTTGGCAGATGCGGGCCATAAGCCTATATTGCTTGAAGCAAGAGATGTTTTAGGTGGAAAGGTGGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGACTGGTACGAGACAGGCTTGCATATATTCTTTGGGGCATATCCAAATGTGCAGAATCTTTTTGGTGAACTTGGTATCAATGATAGGTTGCAATGGAAGGAGCATTCTATGATATTTGCAATGCCAAATAAGCCAGGAGAATTCAGTCGATTTGATTTTCCTGAAGTTCTCCCTGCACCATTAAATGGGATATTGGCCATTTTAAAGAACAATGAAATGCTGACTTGGCCAGAGAAAGTGAAGTTTGCAATTGGGCTACTTCCAGCAATTGTTGGTGGACAGGCTTATGTTGAGGCTCAAGATGGTTTAAGTGTTCAAGAGTGGATGAGAAAGCAGGGTGTACCTGATAGAGTGACTACTGAGGTGTTTATTGCCATGTCAAAGGCTCTAAACTTTATTAACCCAGATGAGCTTTCAATGCAATGCATTTTGATAGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAGATGGCTTTCTTGGATGGTAATCCCCCAGAGAGGCTCTGCATGCCAATTGTTGATCATATTCAGTCGCGTGGTGGTGAAGTCAAGCTTAATTCTCGGATAAAGAAGATTGAGCTAAATGATGATGGAACAGTGAAGAGTTTTTTACTAAATACTGGGGATGTGATTGAAGGGGATGTTTATGTGTTTGCCACTCCAGTTGATATCCTGAAGCTTCTTTTGCCTGATAACTGGAAAGAGATTCCTTACTTCAAGAAACTGGAGAAATTAGTTGGAGTTCCTGTTATTAATGTTCACATATGGTTTGACAGGAAACTGAAGAATACATACGATCACCTACTTTTCAGCAGGAGTCCTCTTCTCAGTGTGTATGCTGACATGTCTCTGACATGTAAGGAATATTATGACCCAAATAAATCCATGCTGGAGTTAGTTTTTGCGCCTGCTGAAGAATGGATTTCACGCAGTGACTCAGAGATTATTGATGCTACAATGGGGGAACTCGCAAAACTTTTTCCTGATGAAATATCCGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATCGTGAAGTATCATGTTGTTAAAACTCCAAGGTCGGTTTACAAGACTGTCCCAGATTGTGAACCTTGCCGTCCCTTGCAAAGATCTCCGATAGAGGGTTTCTATTTAGCTGGTGACTACACAAAACAAAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGTTCTATCAGGGAAGCTTTGTGCACAGGCAATTATACAGGATTACGAGTTCCTGGTTGCTCGGGGGCAAGGAAGCTTGACTGAGGCAACCATTAGTTAA。

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9***对银白杨基因进行定点编辑的方法。以PDS基因作为报告基因，获得具有PDS基因功能缺失的银白杨植株，通过对突变体植株性状的研究探讨PDS基因的功能。PDS参与类胡萝卜素的合成过程，使没有颜色的八氢番茄红素转化为有颜色的类胡萝卜素，PDS是类胡萝卜素合成过程中的关键酶，本发明提供的基因编辑体系，能够有效获得PDS基因功能缺失杨树植株，其表型直观，检测方法简单，用作基因编辑体系有效性的阳性对照，在基因编辑验证中起到了极为重要的作用。

本发明还提供了上述技术方案所述靶基因的靶位点，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CCAGAGAGGCTCTGCATGC。

本发明还提供了上述技术方案所述靶位点的接头引物，所述接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PDS-gRNA2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的PDS-gRNA2-R。本发明对所述引物的合成方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的引物常规合成公司进行合成即可。

本发明还提供了基于上述技术方案所述靶位点或上述技术方案所述接头引物制备得到的gRNA表达盒。本发明对所述gRNA表达盒的获得方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的gRNA表达盒制备方法即可。

本发明还提供了基于上述技术方案所述靶位点或上述技术方案所述接头引物或上述技术方案所述gRNA表达盒制备得到的CRISPR/Cas9***用载体。本发明对所述载体的类型和制备方法没有特殊限定，采用CRISPR/Cas9***常规载体进行常规制备即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

实验准备阶段：

植物材料：银白杨组培苗

菌体和载体：pYLsgRNA-AtU6-29；pYLCRISPR/Cas9-DH；DH10b大肠杆菌感受态；EHA105农杆菌。

实验试剂：植物RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA快速回收纯化试剂盒、pCloneEZ-Blunt-Kan/HCKit、金牌Mix、2xHeffTMPCRMasterMix、T4DNA连接酶、限制性内切酶BsaI、双蒸水(ddH2O)、蔗糖(Sucrose)、琼脂粉(Agar)、乙酰丁香酮(AS)、玉米素(ZT)、萘乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IBA)，头孢霉素(Cef)，潮霉素(Hyg)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、Woody Plant Basal Medium with Vitamins (WPM)、Luria-Bertani Culture(LB)Yeast Extract Mannitol Broth(YEB)、1/2MS Medium(1/2MS)

实验仪器：PCR仪、恒温培养箱、摇床、超净台、紫外分光光度计、离心机

准备工作：试管、试管塞、1.5mlEp管、250ml锥形瓶、剪刀、镊子、滤纸等提前灭菌。

靶位点接头引物设计

根据靶位点序列，设计接头引物：PDS-gRNA2-F:5’-ATTGGCATGCAGAGCCTCTCTGG-3’(SEQ ID NO.3)，PDS-gRNA2-R:5’-AAACCCAGAGAGGCTCTGCATGC-3’(SEQ ID NO.4)。将接头引物用TE溶解成100μM母液，各取1μl加入到98μl0.5×TE溶液中。然后各吸取25μl，90℃30s，移至室温退火，形成靶位点接头，待用。

gRNA表达盒制备

利用BsaI酶切pYLsgRNA-AtU6-29载体，酶切体系如下：pYLsgRNA-AtU6-29质粒：1μg；10X CutSmart Buffer：5μl；Bsa I：10units；补充Nuclease-free Water至50μl。37℃酶切反应30min，70℃5min失活酶。

利用T4 DNA连接酶，将4中靶位点接头连入pYLsgRNA-AtU6-29载体，连接体系如下：10x T4 DNA ligase buffer：1μl；pYLsgRNA-AtU6-29质粒：0.5μl；靶位点接头：1μl；T4DNA连接酶：0.5μl；补充ddH₂O至10μl，室温反应30min。

通过巢式PCR，扩增gRNA表达盒，具体过程如下：(1)以上述的T4连接产物为模板，分别利用UF/PDS-gRNA2-R和PDS-gRNA2-F/gRNA-R引物进行第一轮PCR扩增。引物序列如下：UF：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID NO.5)；gRNA-R：CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ IDNO.6)；PDS-gRNA2-F:ATTGGCATGCAGAGCCTCTCTGG(SEQ ID NO.3)；PDS-gRNA2-R:AAACCCAGAGAGGCTCTGCATGC(SEQ ID NO.4)。PCR扩增体系如下：金牌Mix：22.0μl；ForwardPrimer：1.0μl；ReversePrimer：1.0μl；连接产物：1μl。扩增程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸40s，28个循环；72℃延伸2min；25℃，End。(2)取第一轮PCR产物各1μl，用ddH2O稀释10倍，然后各取1μl混合为模板，利用引物CAS9-F：ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ ID NO.7)，CAS9-R：TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG(SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：混合模板：2μl；金牌Mix：22μl；CAS9-F：1μl；CAS9-R：1μl。扩增程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min；25℃，End。所得PCR产物，即为gRNA表达盒。

gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-DH连接

利用BsaI酶切pYLCRISPR/Cas9-DH载体，酶切体系如下：pYLCRISPR/Cas9-DH质粒：5μg；10XCutSmartBuffer：5μl；BsaI：1μl；补充Nuclease-freeWater至50μl。37℃酶切反应1h，70℃5min失活酶。利用SeamlessAssemblyCloningKit(中美泰和，北京)将gRNA表达盒连入pYLCRISPR/Cas9-DH载体，连接体系如下：gRNA表达盒：4μl；pYLCRISPR/Cas9-DH线性化载体：1μl；2×seamlessmastermix:5μl。50℃反应15min后冰浴，42℃热激转化DH10b。测序筛选阳性克隆，然后提取质粒，转化农杆菌EHA105，用于银白杨遗传转化。

银白杨遗传转化

取上述农杆菌菌液于28℃摇床振荡培养至OD₆₀₀≈0.8。取200μl菌液于200ml新鲜YEB无抗液体培养基中28℃震荡培养至OD₆₀₀≈0.8。4000rpm，4℃离心10min，收集管底菌体。使用WPM重悬液重悬菌体，28℃震荡培养1-2h(调整至OD₆₀₀≈0.4-0.6)，冰上暂存菌液，用于侵染。

银白杨的遗传转化过程如下：

选择4周左右的银白杨无菌组培苗的叶片和茎段，将叶片剪成边长为0.5cm的小块，茎段剪成长度为0.5cm的小段，浸泡在上一步制备好的菌液中侵染13min左右。

将侵染后的叶片和茎段用无菌滤纸吸干，将其平铺在CM1培养基上，25℃暗培养2d。

将暗培养后的叶片和茎段转移至CM2培养基中，25℃暗培养4～5周，在此期间每2周更换一次培养基。

当叶片和茎段的边缘出现淡黄色或白色的团状愈伤时，将其转移至CM3培养基上，培养条件为：光强2000lx，温度25℃，光周期16/8h。直至愈伤组织有不定芽形成时，转移到CM4培养基上，培养条件为：光强2000lx，温度25℃，光周期16/8h。

等到不定芽生长至2cm左右时，将其剪下转接到CM5培养基中诱导不定根。

培养基配方如表1所示：

表1培养基配方

所有培养基的pH值至5.80～6.00后加入琼脂粉，121℃灭菌20分钟。灭菌后加入抗生素和不耐高温激素。本发明中，获取银白杨再生植株的各阶段组织培养状况如图1所示，图1为银白杨遗传转化过程(其中，1、共培养；2、选择培养；3、生芽培养Ⅰ；4、CM4生芽培养Ⅱ，具体的，1、共培养阶段：侵染后的叶片在CM1培养基上暗培养2天；2、选择培养阶段：叶片转移至CM2培养基上暗培养5周左右后，出现淡黄色或白色的团状愈伤；3、生芽培养Ⅰ阶段：愈伤组织转移至CM3培养基上光照培养4周左右后有不定芽形成；4、CM4生芽培养Ⅱ阶段：带有不定芽的愈伤组织转移至CM4培养基上光照培养，3周左右后不定芽继续发育)。

银白杨PDS基因敲除植株的鉴定

PDS基因敲除后将导致植株出现白化表型。在本发明中，银白杨外植体经组织培养后，分化出的再生苗与野生型相比出现白化现象(图2，野生型银白杨再生苗(左)和敲除PDS基因的银白杨再生苗(右))，表明PDS基因在银白杨体内已不能正常行使功能。提取白化植株的基因组DNA作为模板，利用引物PDS-JC1:TCCGAAGCACCTAACTCA(SEQ ID NO.9)和PDS-JC:3:TCTTTCCAGTTATCAGGCAAA(SEQ ID NO.10)对靶位点序列进行PCR扩增，扩增产物连接pCloneEZ-Blunt载体，转化大肠杆菌DH10b，挑选单克隆进行测序，测序结果显示，转基因植株的PDS基因在靶点处缺失了两个碱基(图3，鉴定银白杨白化苗中PDS基因靶位点处的序列)，银白杨白化苗的PDS基因在靶位点处发生了两个碱基的缺失，导致PDS基因发生移码突变，表明PDS基因在银白杨体内已被成功敲除。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院

<120> CRISPR/Cas9***敲除银白杨PDS基因及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtgcat tgaacttgag ctggcatagt aaatcattag actctcaagt tgccttgaga 60

tgtggcgctt atcctacttg ttctcaccaa acgaatgcac tagcttttag aggcagtgaa 120

tcaatgggcc attctttgaa attcccattt ggaaattctt ctgctaaaac aagactaagg 180

aatcatatcc gccctccttt gcgggttgtc tgtatggact atccaagacc ggaccttgat 240

aacacggtga atttcttaga ggctgccttg ttatcttcat cctttcgttc ttctccgcgt 300

ccagctaaac cattaaatgt tgtcattgct ggtgcaggtt tggcgggttt atcgactgca 360

aaatacttgg cagatgcggg ccataagcct atattgcttg aagcaagaga tgttttaggt 420

ggaaaggtgg ctgcatggaa agatgatgat ggagactggt acgagacagg cttgcatata 480

ttctttgggg catatccaaa tgtgcagaat ctttttggtg aacttggtat caatgatagg 540

ttgcaatgga aggagcattc tatgatattt gcaatgccaa ataagccagg agaattcagt 600

cgatttgatt ttcctgaagt tctccctgca ccattaaatg ggatattggc cattttaaag 660

aacaatgaaa tgctgacttg gccagagaaa gtgaagtttg caattgggct acttccagca 720

attgttggtg gacaggctta tgttgaggct caagatggtt taagtgttca agagtggatg 780

agaaagcagg gtgtacctga tagagtgact actgaggtgt ttattgccat gtcaaaggct 840

ctaaacttta ttaacccaga tgagctttca atgcaatgca ttttgatagc tttgaacaga 900

tttcttcagg agaaacatgg ttcaaagatg gctttcttgg atggtaatcc cccagagagg 960

ctctgcatgc caattgttga tcatattcag tcgcgtggtg gtgaagtcaa gcttaattct 1020

cggataaaga agattgagct aaatgatgat ggaacagtga agagtttttt actaaatact 1080

ggggatgtga ttgaagggga tgtttatgtg tttgccactc cagttgatat cctgaagctt 1140

cttttgcctg ataactggaa agagattcct tacttcaaga aactggagaa attagttgga 1200

gttcctgtta ttaatgttca catatggttt gacaggaaac tgaagaatac atacgatcac 1260

ctacttttca gcaggagtcc tcttctcagt gtgtatgctg acatgtctct gacatgtaag 1320

gaatattatg acccaaataa atccatgctg gagttagttt ttgcgcctgc tgaagaatgg 1380

atttcacgca gtgactcaga gattattgat gctacaatgg gggaactcgc aaaacttttt 1440

cctgatgaaa tatccgcaga tcaaagcaaa gcaaaaatcg tgaagtatca tgttgttaaa 1500

actccaaggt cggtttacaa gactgtccca gattgtgaac cttgccgtcc cttgcaaaga 1560

tctccgatag agggtttcta tttagctggt gactacacaa aacaaaagta cttggcttca 1620

atggaaggtg ctgttctatc agggaagctt tgtgcacagg caattataca ggattacgag 1680

ttcctggttg ctcgggggca aggaagcttg actgaggcaa ccattagtta a 1731

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagagaggc tctgcatgc 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attggcatgc agagcctctc tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacccagag aggctctgca tgc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accggtaagg cgcgccgtag tgctcgacta gtggaatcgg cagcaaagg 49

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagctcgaga ggcgcgccaa tgataccgac gcgtccatcc actccaagct cttg 54

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccgaagcac ctaactca 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctttccagt tatcaggcaa a 21

Claims

1.PDS基因作为靶基因，在通过CRISPR/Cas9***敲除银白杨内源基因实现银白杨定向分子育种中的应用，所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述靶基因的靶位点，其特征在于，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求2所述靶位点的接头引物，其特征在于，所述接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PDS-gRNA2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的PDS-gRNA2-R。

4.基于权利要求2所述靶位点或权利要求3所述接头引物制备得到的gRNA表达盒。

5.基于权利要求2所述靶位点或权利要求3所述接头引物或权利要求4所述gRNA表达盒制备得到的CRISPR/Cas9***用载体。

6.权利要求2所述靶位点或权利要求3所述接头引物或权利要求4所述gRNA表达盒或权利要求5所述CRISPR/Cas9载体在敲除银白杨PDS基因中的应用。