CN111235066A - 一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh及其制备农用纳米硒片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh及其制备农用纳米硒片的方法。该贝莱斯芽孢杆菌Lxh的保藏编号为：CCTCC M 2019691，于2019年9月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有以无机硒为原料转化有机硒和纳米硒的能力。本发明以贝莱斯芽孢杆菌Lxh作为转化菌株，在无机硒培养基中进行好氧转化，转化液按照一定比例加入固体辅料，烘干后进行造粒、压片。利用本发明方法所制备的纳米硒片在水中极易分散，制备工艺简单、成本低，携带方便，可与其它液体肥料协同使用，可用于土壤补硒及各类富硒农作物的种植。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh及其制备农用纳米硒片的方法

技术领域

本发明属于微生物应用技术及纳米硒制备领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh及其制备农用纳米硒片的方法。

背景技术

硒是生态***中非常重要得微量营养元素，有着“生命元素”之称，但在以前由于限于研究技术手段的落后，硒一直不被人们所关注，而近年来，由于各种缺硒疾病的出现和对硒元素功能的深入研究，发现硒在人体代谢中起到非常重要的作用。大量的研究已经表明，硒参与了人体的抗氧化和免疫***等多个生物学代谢过程，缺硒会引起或诱发克山病、骨骼肌坏死、心脑血管等多种疾病。自然界中硒的形式主要分为两类，一类是以硒矿和硒盐为主的无机硒，另一类是存在于生物体内的有机硒。硒矿中的硒多以与其它金属元素碲和形式存在，无法被植物所利用，硒盐具有剧毒性，被列为第六类国家管制剧毒品，从而导致我国大部分地区土壤都属于严重缺硒的地区。而近年来，纳米硒成为研究的热点。

纳米硒是指通过化学法或微生物法将硒酸盐或***盐还原为纳米形态的硒单质。化学法还原生成的纳米硒单质稳定性较差，粒径不均一，生物活性较低，而通过生物法转化而成的纳米硒稳定性较好，颗粒大小较为均一，并能够通过微生物在纳米硒表面的修饰，使得微生物所制备的纳米硒性质更稳定，生物活性更高。同时，根据急性毒性数据(LD₅₀)显示，无机硒LD₅₀为15mg/kg,有机硒LD₅₀为30～40mg/kg，微生物纳米硒LD₅₀为113mg/kg，由此可见，微生物纳米硒的急毒性是最低的。而在慢毒性方面，通过给小鼠饲喂不同形态的硒源发现，微生物纳米硒的毒性也是最低的。

国家实行补硒计划，主要形式是以富硒农产品的推行为主，而增加土壤硒含量是提高农产品中硒含量的主要方法，而纳米硒是未来硒肥的主要形式。生物合成纳米硒主要利用微生物还原硒酸盐或***盐产生，随着研究的不断深入，能够合成纳米硒的微生物涵盖的种属极其丰富，但并未见利用贝莱斯芽孢杆菌进行纳米硒转化的报道，且对于农户而言，低成本、操作简便且能与其它肥混用的农用纳米硒片并未出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh及其制备农用纳米硒片的方法，该菌株具有纳米硒的高转化能力，其制备的硒片可用于土壤补硒或富硒作物的标准化栽培，解决了现有富硒农业生产中所存在的成本高、操作复杂、无机硒过度使用等问题。

本发明采用的技术方案是：

一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh，该贝莱斯芽孢杆菌的保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌Lxh(Bacillus velezensis)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年9月6日，保藏编号为CCTCC NO:M2019691。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株为杆状大小为0.5μm×1.5～3μm，菌落圆形乳白色，表面褶皱，中央凹陷呈火山口状，革兰氏阳性菌。

进一步的，当无机硒含量低于10mg/L时，所述贝莱斯芽孢杆菌可将硒转化为有机硒；当无机硒含量在100～8000mg/L时，所述贝莱斯芽孢杆菌可将硒转化为纳米硒，纳米硒尺寸为100～200nm。

一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh制备农用纳米硒片的方法，包含以下步骤：

S1.利用贝莱斯芽孢杆菌Lxh发酵制备纳米硒：将所述贝莱斯芽孢杆菌Lxh菌株活化后，接种到含无机硒的胰酪胨大豆肉汤或普通肉汤培养液中，通氧培养18h-96h，即得纳米硒转化液；

S2.将固体辅料粉末与纳米硒转化液按预先设计比例混合，40～80℃烘干，粉碎过筛后直接压片或采用造粒压片，可制成预先设计硒浓度的纳米硒片。

进一步的，S1中利用贝莱斯芽孢杆菌Lxh发酵制备纳米硒的条件为温度25～42℃、pH控制6.0～8.0、通气量为0.3～0.5vvm。

进一步的，S1中所述的无机硒为硒盐，可选***盐、硒酸盐中的一种或几种组合，硒含量质量体积比为100～8000mg/L。

进一步的，S2中所述的固体辅料粉末为改性淀粉类、葡聚糖类、羧甲基纤维素类、海藻酸钠等可溶性粉末中的一中或几种组合。

进一步的，S2中所述的粉碎后粒径为大于或等于100目。

进一步的，S2中所述的造粒压片方法为普通干法造粒压片法或普通湿法造粒压片法。

本发明具备以下优点：

1.本发明贝莱斯芽孢杆菌Bacillus Velezensis Lxh具有硒转化微生物特性，可进行有机硒转化、微生物纳米硒合成、矿石硒的微生物活化、富硒微生物肥料等潜在的应用价值。

2.本发明利用贝莱斯芽孢杆菌Lxh制备农用纳米硒片的方法简单、成本低，利用本发明方法所制备的纳米硒片在水中极易分散，其携带方便，可与其它液体肥料协同使用，可用于土壤补硒及各类富硒农作物的种植。

附图说明

图1为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh的菌落形态；

图2为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh的菌体电镜形态；

图3为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh的硒耐受图；

图4为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh生产的纳米硒图片；

图5为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh生产的纳米硒的扫描电镜图片，分辨率为100nm；

图6为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh的***进化树。

图7为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh的生理生化特性；

图8为本发明所述方法制备的农用纳米硒片图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Lxh，该贝莱斯芽孢杆菌是从中国湖北恩施硒矿区土壤中分离纯化具有硒转化特征的细菌菌株，该菌株的保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌Lxh(Bacillus velezensis Lxh)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌路珈山，邮编430072，保藏编号CCTCC M 2019691，保藏日期2019年9月6日.

该贝莱斯芽孢杆菌的菌种菌学特征描述如下：

形态特征：该贝莱斯芽孢杆菌在30℃的LB培养基中培养24h为圆形、乳白色，表面褶皱，培养48h后菌落中央凹陷呈火山口状(参见附图1)；菌株为杆状，大小为0.5μm×1.5～2μm(参见附图2)，该菌株为革兰氏阳性菌。

硒转化特性：将该贝莱斯芽孢杆菌依次分别接入到含硒(以***钠配置)0、10、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000mg/L的LB培养液中，结果显示(参见附图3)，在硒浓度≤10mg/L情况下，溶液中无纳米硒产生，溶液颜色不变红；在硒浓度100-8000mg/L范围内，菌株生长且产生了红色纳米硒，说明该贝莱斯芽孢杆菌能够耐受8000mg/L的硒环境。在9000mg/L的环境下，该菌株未见生长，该菌株所产生的纳米硒经过离心后于培养皿(参见附图4)和进行扫面电镜(参见附图5)，结果显示所产生的纳米硒颗粒较为均一，直径约为100～200nm。

16S rDNA基因序列分析：从本发明利用总DNA试剂盒从纯化的培养皿菌落中提取菌株的基因组总DNA，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增和测序，利用PCR产物进行试剂盒纯化后进行测序，测序后利用DNAMAN5.0进行片段拼接，将获得菌株的保守序列并在GENbank进行16S rDNA BLAST比对，进一步通过CLUSTAL X软件和Mega 5.0软件以Neighbour-joining方法构建***进化树(参见附图6)，结果显示，该菌株Lxh与Bacillusvelezensis序列相似性达到99％。由此确定了Lxz-41为解淀粉芽孢杆菌，定名为Bacillusvelezensis Lxh，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M 2019691。

生理生化特点：将贝莱斯芽孢杆菌Lxh接种于LB固体培养基中，30℃培养16h，刮取2环菌落接种于LB液体培养基中，30℃培养18h，用移液枪将培养液加入到IF增菌液中，控制浊度为90-98％T，然后带有不同C源和敏感因子的96孔板中，30℃恒温静止培养48h，通过微生物生化分析仪读取显色反应情况(参见附图7)。结果显示，此贝莱斯芽孢杆菌Lxh能够利用多种碳源，特别是对有机酸类表现了较好的利用特性。

本发明的菌株筛选按照下列步骤进行：

(1)初筛：样品采集于中国湖北恩施州硒矿区土壤，取5g置于250mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，30℃条件下150r/min摇床震荡30min，静置30秒后取1mL菌液梯队稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，然后取100μL均匀涂布于分离培养基上(分离培养基组成：含硒500mg/L的TSA，硒源为***钠)，每一处理设置3组重复。常温下培养3天，挑取形态典型的单一红色菌落进行点接纯化2-3次得到纯培养物。

(2)复筛：将(1)中得到的纯培养物依次接入含硒(以***钠配置)5000mg/L的TSB培养液中，选择菌株生长且变红的菌株，表明该纯培养物具有高耐硒能力，将该纯培养物命名为Lxh，保藏于保藏培养基中。

分子生物学鉴定：该贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus Velezensis)Lxh的16srDNA序列如下所示：

CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAA

下面通过几个实施例介绍本发明利用贝莱斯芽孢杆菌Lxh制备农用纳米硒片(参见附图8)的方法。

实施例1：

将本发明所述微生物Lxh菌株接种到含硒(***钠配置)100mg/L的TSB(pH＝6.0)培养液中，25℃、通氧量为0.3vvm，培养18小时，溶液出现明显的红色、浑浊。按照1：1加入可溶性淀粉，然后40℃烘干，粉碎后过100目筛，直接压片，每片10g。按照国家标准GB5009.93-2017对纳米硒片进行硒含量检测，硒含量为98.13±0.53mg/Kg。

实施例2：

将本发明所述微生物Lxh菌株接种到含硒(***钠配置)8000mg/L的TSB(pH＝8.0)培养液中，42℃、通氧量为0.5vvm，培养96小时，溶液出现明显的红色、浑浊。按照1：10加入糊精，然后80℃烘干，粉碎后过180目筛，普通干法造粒压片，每片1g。按照国家标准GB5009.93-2017对纳米硒片进行硒含量检测，硒含量为789.62±3.42mg/Kg。

实施例3：

将本发明所述微生物Lxh菌株接种到含硒(***钠配置)5000mg/L的TSB(pH＝7.0)培养液中，37℃、通氧量为0.4vvm，培养72小时，溶液出现明显的红色、浑浊。按照1：5加入葡甘聚糖，然后60℃烘干，粉碎后过150目筛，普通湿法造粒压片，每片5g。按照国家标准GB 5009.93-2017对纳米硒片进行硒含量检测，硒含量为1000±3.42mg/Kg。

实施例4：

将本发明所述微生物Lxh菌株接种到含硒(***钠配置)5000mg/L的TSB(pH＝7.0)培养液中，37℃、通氧量为0.4vvm，培养72小时，溶液出现明显的红色、浑浊。按照1：1加入羧甲基纤维素钠，然后80℃烘干，粉碎后过150目筛，普通湿法造粒压片，每片3g。按照国家标准GB 5009.93-2017对纳米硒片进行硒含量检测，硒含量为4970±13.12mg/Kg。

实施例5：

将本发明所述微生物Lxh菌株接种到含硒(***钠配置)2000mg/L的TSB(pH＝7.0)培养液中，30℃、通氧量为0.3vvm，培养36小时，溶液出现明显的红色、浑浊。按照1：1加入海藻酸钠，然后80℃烘干，粉碎后过120目筛，普通湿法造粒压片，每片3g。按照国家标准GB 5009.93-2017对纳米硒片进行硒含量检测，硒含量为1893±15.77mg/Kg。

通过本发明方法制备的纳米硒片使用方法和使用效果如下：

1.作为固体基肥/追肥混施

根据基肥和追肥方式不同，将纳米硒片与有机肥混匀后，做基肥或追肥采用条/沟施、穴施、撒施等方法施在植株的根系附近，控制一亩地硒用量为1-1.5g。

2.拌种

将适量纳米硒片(含硒1g)用100kg水溶解，搅匀。将非包衣种子与稀释液混拌均匀，或用稀释后的液体喷湿种子，待种子阴干后播种。

3.混施

将纳米硒片压碎，与与种子混合后，及时播种，控制一亩地硒含量为1g左右。

4.喷施、冲施、灌根

将适量纳米硒片(含硒1g)用100kg水溶解，搅匀。采用灌根、喷施或冲施的方法对作物进行施用，控制一亩地硒含量为1-1.5g。

5.不同作物施用时段

水稻、玉米、小麦：在齐穗期或灌浆期施用1次

块茎类：在块茎膨大期施用1-2次

瓜果类：在果实膨大期施用1-2次

茶叶：在生长旺盛期喷施1次，采后重新喷洒

蔬菜类：长叶期施用1次

药材类：生长期施用1-2次

施用效果

在安康南宫山富硒水稻基地进行纳米硒片应用实验，在水稻灌浆期进行喷施，每亩地喷施1次，用量为0.3kg(100片)纳米硒片。水稻成熟后对稻米粒脱壳后按照国家标准GB5009.93-2017进行检测，结果为0.179±0.021mg/Kg，符合GB/T 22499-2008(0.04-0.3mg/Kg)关于富硒水稻的标准要求。

在淳化富硒苹果基地进行纳米硒片应用实验，采用滴灌形式，在果实膨大期，每亩用量0.6kg(200片)纳米硒片。苹果成熟采摘后按照国家标准GB 5009.93-2017进行检测，结果为0.4±0.036mg/Kg，符合陕西DB61/T556-2018和湖北DBS42/002-2014关于富硒水果的标准要求。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (9)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh，其特征在于：该贝莱斯芽孢杆菌的保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌Lxh(Bacillus velezensis)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年9月6日，保藏编号为CCTCC NO:M2019691。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌菌株为杆状大小为0.5μm×1.5～3μm，菌落圆形乳白色，表面褶皱，中央凹陷呈火山口状，革兰氏阳性菌。

3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Lxh，其特征在于：当无机硒含量低于10mg/L时，所述贝莱斯芽孢杆菌可将硒转化为有机硒；当无机硒含量在100～8000mg/L时，所述贝莱斯芽孢杆菌可将硒转化为纳米硒，纳米硒尺寸为100～200nm。

4.一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh制备农用纳米硒片的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.利用贝莱斯芽孢杆菌Lxh发酵制备纳米硒：将所述贝莱斯芽孢杆菌Lxh菌株活化后，接种到含无机硒的胰酪胨大豆肉汤或普通肉汤培养液中，通氧培养18h-96h，即得纳米硒转化液；

S2.将固体辅料粉末与纳米硒转化液按预先设计比例混合，40～80℃烘干，粉碎过筛后直接压片或采用造粒压片，可制成预先设计硒浓度的纳米硒片。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：S1中利用贝莱斯芽孢杆菌Lxh发酵制备纳米硒的条件为温度25～42℃、pH控制6.0～8.0、通气量为0.3～0.5vvm。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：S1中所述的无机硒为硒盐，可选***盐、硒酸盐中的一种或几种组合，硒含量质量体积比为100～8000mg/L。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：S2中所述的固体辅料粉末为改性淀粉类、葡聚糖类、羧甲基纤维素类、海藻酸钠等可溶性粉末中的一中或几种组合。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：S2中所述的粉碎后粒径为大于或等于100目。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：S2中所述的造粒压片方法为普通干法造粒压片法或普通湿法造粒压片法。

Images