CN110964674B - 高产纳米硒的光合细菌及其纳米硒活菌制剂的制备方法 - Google Patents

高产纳米硒的光合细菌及其纳米硒活菌制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产纳米硒的光合细菌及及其纳米硒活菌制剂的制备方法，具体公开了一株能耐受较高浓度（25 g/L）的***钠的桃红荚硫菌，创造性的利用烟酸来修饰高浓度的生物纳米硒，大大提高了纳米硒在液体中存贮的稳定性，同时，具有90%以上的纳米硒的转化率，从而纳米硒发酵液可不进行离心纯化，可以直接得到一个纳米硒含量较高的还含有活菌的保存时间长的液体纳米硒制剂，本发明方法克服了传统微生物制备高浓度生物纳米硒不能液体长期贮存易转化黑色单质硒的问题，能耗高，污染大的缺点，由于本发明纳米硒活菌制剂生产工艺简单，成本低廉，对设备要求低，无三废排出，环境友好，具有广阔的市场推广价值。

Description

高产纳米硒的光合细菌及其纳米硒活菌制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及纳米生物材料领域，具体涉及一种高产纳米硒的光合细菌及一个无三废排放的，含高浓度纳米硒，纳米硒高转化率的，且活菌含量高的，能长时间稳定保存的一种液体纳米硒制剂的制备方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，作为营养元素的硒在人体内能清除过剩的活性氧自由基，参与25种含硒蛋白合成，如谷胱甘肽过氧化物酶等。许多疾病的发生均与缺硒有关，人们一直在探求安全、经济的补充硒营养的方法，最普通的做法就是通过富硒农产品来补充，富硒农产品中的生物硒是人体利用硒的重要来源。农业应用中多以***钠作为农产品中外加源硒的硒源，但因***钠使用的安全性等问题，科技工作者们寻找到了另一种有活性的、低毒的单质硒—红色纳米硒。红色纳米硒能够提高机体抗氧化能力、增强免疫力、抑制肿瘤、改善畜禽肉品质，具有比***钠低的毒性及高的生物利用率等特点。因纳米体系的庞大表面积，使键态严重失配，出现许多活性中心，表面出现非化学平衡，可以导致硒的性质特异性变化。与其他形式的硒相比，纳米硒具有较高的生物活性、安全性、抗氧化性和较高的吸收率等特点。纳米硒吸收利用率高，排入环境中硒的量较低，可减轻环境污染，无论在动物或植物上的应用都具有良好的前景。目前，纳米硒的合成主要通过化学反应，结晶技术，反向胶束法等技术生成。但这些技术会受到高温、高压、催化剂等条件限制，而且容易对环境造成危害，而且在液相中，出于减小表面积和降低能量的自我需要，纳米粒子很容易发生团聚而引起沉淀。为了有效防止纳米硒粒子的这种聚沉，对纳米硒的表面进行修饰。郑文杰等发现，在蔗糖水溶液中，纳米硒的形成和聚集受到糖分子的调控，浓度为1-43μmol/L的纳米硒粒径被控制在20-80nm范围，蔗糖修饰的纳米硒(粒子稳定在液相中保存2个月不发生进一步聚集而沉淀析出，但较高浓度也同样不稳定，会转变为黑色硒。在降解裙带菜多糖(DUP)水溶液中，单质硒微粒的形成和聚集受到糖分子的调控当Se0浓度为0.0507-3.245mmol/L时，DUP表面修饰的纳米硒的平均粒径稳定地保持在24-64nm，呈球状，在4℃条件下，可稳定地保存在水溶液中1个月以上的时间。最近有报道壳聚糖、***胶、纤维素等多糖可以作为模板用合成纳米硒。所谓的“模板”实际上就是Se0粒子的表面修饰剂，和蔗糖、降解多糖分子一样，通过控制Se0的生成速度以及对Se0粒子表面修饰而达到纳米硒粒径调控和稳定作用。
实质上，生产的较高浓度纳米硒在就算有保护剂存在的条件下，在液体中也容易团聚，理化性质不稳定，常温下就容易失去生物活性，而转变成灰黑色晶型的单质硒。因此，生产上函需一种清洁，无毒，环保的方法来生产稳定的纳米硒。
微生物在硒的自然界中的循环发挥着重要作用。已发现许多细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、红螺菌(RhodospirillumMolisch)、固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等可将氧化态硒还原为无毒、高效的红色纳米硒，而且合成的生物纳米硒性质稳定，活性高，故利用细菌合成生物纳米硒，是硒的高效生物转化方式，也是降低硒环境风险的解决方式之一。但是，目前报道和应用的细菌，对***钠的耐受性普遍不高，纳米硒转化率不高，导致其应用于实际生产中时受到一定限制。如彭锋等在专利号2016100145476中公开了一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法，包括斜面种子培养、一级种子培养、二级种子培养和发酵生产。选用的地衣芽孢杆菌，能耐高浓度的***盐，最高能耐2000mg/L的***钠，且转化***钠成红色活性纳米硒的效率仅仅达80％左右。因此，筛选可以耐受更高浓度***钠或硒酸钠的微生物，并利用该微生物生产生物纳米硒，对于推进生物纳米硒合成产业的发展，具有重要意义。
生物合成的纳米硒具有安全、廉价、环境友好等优点，更为重要的是，微生物在合成纳米硒的同时，会在纳米硒颗粒的表面包裹一层蛋白质或者多糖等有机大分子，从而使得合成的纳米硒的耐高温能力和稳定性都得到增强，且合成的纳米硒具有特定的粒径和特殊的形貌，能有效的防止纳米硒随时间推移出现团聚的现象。但高浓度液体生物纳米硒也不能长时间存放，存放久了也会有黑色单质硒，因此，如何找到一种高浓度液体生物纳米硒的保护剂也是具有重要意义。另外，现有的微生物纳米硒的生产过程中，都要经过多次离心分离或纯化，如吴丽芳等在申请号201811338802.8中公开了一种可耐受高深度***钠的芽孢杆菌Se8，利用Se8合成生物纳米硒，通过加入谷胱甘肽等诱导剂，后将转化后的发酵液进行离心收集菌体，将菌体沉淀重悬于TE缓部液中，加溶菌酶水浴后利用超声波破碎残留菌体，再离心收集菌体，后再重溶于TE缓冲液中，即为生物纳米硒初提物，此工艺会产生大量含***钠的废水，且工艺复杂。
杨辉等在申请号2019101982522中公开了一种纳米硒益生菌冻干粉及其制备方法，首先分别将嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌及双歧杆菌厌氧培养、活化；然后将活化后的上述三种菌种分别接种含有***钠的MRS液体培养基中厌氧培养，得到三种菌种的发酵醪液；接着将三种菌种的发酵醪液混合后离心分离，得到益生菌沉淀，洗涤、离心、冻干处理后得到纳米硒益生菌冻干粉；此发明中由于菌体对***钠的转化不完全，同样需要洗涤与离心，从而会产生大量污水，而且进行冻干，其所需能耗较高。
其要时行离心分离而不是液体保存，其主要原因是较高浓度的纳米硒在发酵液中就算是利用蛋白质或氨基酸等进行包裹(相对于化学法而言会稳定些)，其也会聚合在一起而转变成为黑色单质硒，而失去了红色纳米硒的功效。因此其一般进行离心纯化，现有技术还没有公开过一个无三废排放的，能含高浓度纳米硒，高转化率，且活菌含量高的，能长时间稳定保存的一种液体纳米硒制剂的制备方法。
发明内容
本发明解决的技术问题在于现有微生物耐受更***钠浓度低，其纳米硒转化率低的问题，更为重要的是现有纳米硒生产技术基本上会通过离心纯化，会有废水排出，而且高浓度液体生物纳米硒在长期存放理化性质不稳定，活菌含量低，使其应用与生产受到限制。
本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供一株高产纳米硒的光合细菌，其分类命名为桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)，由本发明人保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.10344。保藏日期为2015年1月12日。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供了利用该高产纳米硒的光合细菌制备的纳米硒活菌制剂的制备方法，采用桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)菌种按以下步骤进行培养：
(1)、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
(2)、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
(3)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4-1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：2000-6000lux，搅拌速度为120转/分钟，培养至第5-6天，检测其纳米硒的转化率≥88％，活菌含量≥20亿cfu/ml；开始补加烟酸至总浓度为0.1-18g/L，继续培养2-3天，待检测其纳米硒含量≥1g/L，纳米硒转化率≥90％，即可放罐，灌装，包装成品。
其中，所述的半固体光合细菌培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-4g/L，碳酸氢钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，酵母膏0.1-1g/L，微量元素1mL，琼脂8-10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化
镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-4g/L，碳酸氢钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，酵母膏0.1-1g/L，烟酸0.05-0.1g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。
其中，所述的发酵培养基为：氯化铵0.8-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠3-8g/L，碳酸氢钠3-8g/L，酵母膏0.1-1g/L，红糖0.1-1g/L，***钠0.5-25g/L，氯化钠4-10g/L，烟酸0.05-0.1g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2。
其中，所述的微量元素为：七水硫酸亚铁0.2g，四水氯化锰0.1g，硼酸0.1g，六水氯化钴0.1g，氯化锌0.1g，二水钼酸钠0.02g，二水氯化铜0.01g，蒸馏水1000mL。
其中，采用桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)菌种按以下步骤进行培养：
(1)、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
(2)、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
(3)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：2000-6000lux，搅拌速度为120转/分钟，培养至第5天，检测其纳米硒的转化率为88.2％，活菌含量为21.8亿cfu/ml；开始补加烟酸至总浓度为1.07g/L，继续培养2天，待检测其单质纳米硒含量2.080g/L，即转化率为91.1％，即可放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的半固体光合细菌培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.5g/L，微量元素1mL，琼脂8-10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.6g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，酵母膏0.8g/L，红糖0.4g/L，***钠6.25g/L，氯化钠4g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，所述的微量元素为：七水硫酸亚铁0.2g，四水氯化锰0.1g，硼酸0.1g，六水氯化钴0.1g，氯化锌0.1g，二水钼酸钠0.02g，二水氯化铜0.01g，蒸馏水1000mL。
本发明的纳米硒活菌制剂主要应用于富硒种植与畜禽水产养殖上的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明分离筛选的桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)能耐受较高浓度(25g/L)的***钠，同时其可以达到较高的纳米硒的转化率，本发明方法对设备要求低，工艺简单，成本低，无三废排出，环境友好，克服了传统微生物制备高浓度生物纳米硒不能液体长期贮存的问题(易转化黑色单质硒)，能耗高，产物粒径分布不均匀的缺点，具有广阔的推广价值。
创造性的利用烟酸来修饰高浓度的生物纳米硒，大大提高了纳米硒在液体中存贮的稳定性，同时，具有90％以上的纳米硒的转化率，从而纳米硒发酵液可不进行离心纯化，可以直接得到一个纳米硒含量较高的还含有活菌的液体纳米硒制剂，现有技术还没有公开过一个无三废排放的，能高浓度纳米硒(纳米单质硒大于2g/L)，高转化率(大于90％)，且活菌含量高的，能长时间稳定保存的一种液体纳米硒制剂的制备方法，填补了这一空白。
由于本发明纳米硒活菌制剂生产工艺简单，无污染，市场销售价不高于20元/L。
附图说明
图1是实施8中制备的纳米硒扫描电镜图。
具体实施方式
为了使对本发明所达成的功效有更进一步的了解与其认识，用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1生物纳米硒产生菌的筛选
(1)初筛：将本发明人公司实验室中保葳的常用的115株芽孢杆菌，32株乳酸菌，22株光合细菌，采用含有***钠的选择性培养基培养，菌液呈现红色表示有纳米硒的生成，初步筛选出能还原***钠生成纳米硒菌株。
初筛过程如下：
芽孢杆菌：在灭菌的500毫升三角瓶中，加入含0.5g/L***钠的LB液体培养基中，同时按照1％(v/v)接种量依次加入活化好的各菌种子液，30℃180r/min振荡培养2d-5d.。
乳酸菌：在灭菌的500毫升三角瓶中，加入含0.5g/L***钠的MRS液体培养基中，同时按照1％(v/v)接种量依次加入活化好的各菌种子液，37℃静置培养2d-5d.。
光合细菌：在灭菌的500毫升三角瓶中，加入含0.5g/L***钠的相应光合细菌液体培养基中，同时按照20％(v/v)接种量依次加入活化好的各菌种子液，30℃光照厌氧培养3d-7d.。其中，光合细菌液体培养基为：氯化铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，酵母膏0.6g/L，红糖0.5g/L，氯化钠4g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2。
结果：由于***盐的还原伴随着红色单质硒的生成，因此，本实验采用肉眼观察法对产硒菌株进行初步的定性判定。如在培养基中观察到红色出现，表明发生了还原反应，认定为阳性+，产硒色较深用++，最深的用+++。未出现红色，表明未发生还原反应，认定为阴性，用-表示。总共考察了本实验室常用的115株芽孢杆菌，32株乳酸菌，22株光合细菌，如表1发现其中有18株芽孢杆菌，6株乳酸菌，8株光合细菌能产生红色硒。
表1初筛结果
(2)复筛
在上述初筛的基础上将***钠的浓度提高到5g/L***钠，进行试验，结果仅仅只有JCD-1(桃红荚硫菌Thiocapsa roseopersicina)和YHSH-P7(未鉴定)两株光合细菌能快速产生红色硒，其他的在培养5天都没有明显红色硒出现。将上面两株菌在含有10g/L***钠，15g/L***钠，20g/L***钠，25g/L***钠，30g/L***钠进行30℃光照厌氧培养10d.考察其纳米硒转化情况。结果如表2所示，JCD-1菌株更具有更高的耐受性。JCD-1菌株已经鉴定为桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)，并由本发明人保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.10344。保藏日期为2015年1月12日。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
表2光合细菌不同***钠耐受性
10 15 20 25 30
JCD-1 +++ ++ ++ + -
YHSH-P7 ++ + - - -
实施例2考察不同浓度***钠对JCD-1菌的影响及纳米硒的转化率
考察不同浓度***钠对JCD-1桃红荚硫菌的影响及纳米硒的转化率，利用实施例1中的光合细菌液体培养基，只是改变***钠的浓度。所有样品中硒含量的测定，使用流动注射氢化物--原子吸收光谱法。取含菌体的培养液在4℃，10000rpm离心后测上清液中含硒量。转化率＝(A-B)/A×100％。式中A为光合细菌培养基中初始的硒含量；B为培养之后培养基中剩余的硒含量。
从表3可以看出，在较低浓度(0.5-2g/L)时，随着***钠浓度增高，是促进JCD-1桃红荚硫菌的生长的，其菌数也变得更高，但其纳米硒的转化率在变低，但在较高浓度(2-25g/L)时，随着***钠浓度增高，是抑制JCD-1桃红荚硫菌的生长的，其菌数也变得更低，越高的其对桃红荚硫菌的抑制越严重，纳米硒的转化率也越低。在***钠浓度2g/L时，其纳米硒转化率还能达到95％以上，暂时以***钠2g/L进行下面试验。
表3不同浓度***钠对JCD-1菌的影响及纳米硒的转化率
***钠浓度 0.5 1 2 3 4 5 10 15 20 25 30
菌数 24.5 26.8 29.8 22.4 19.7 16.8 10.2 7.3 6.2 5.8
转化率(％) 98.9 98.4 95.3 91.4 96.8 79.8 52.1 31.5 29.1 8.7
实施例3考察不同物质对本发明纳米硒的稳定性试验
由于本公司在广东地区，生产的部分纳米硒发酵液在夏季时，其室温存放不超过30天，就出现黑色硒的情况，因此进行了下面的试验，将JCD-1菌在2g/L***钠(11.567mmol/L)浓度的光合细菌培养基中发酵7天后，检测其转化率为95.5％，活菌数为29.5亿，各取500mL放置三角瓶中，分别加入46.28mmol/L的各种氨基酸(部分氨基酸溶解度过低，如酪氨酸采用的是其盐酸盐)，烟酸，12g/L大豆分离蛋白，12g/L蔗糖，12g/L奶粉，12g/L聚葡萄调pH至7.0，三组平行试验，在45℃恒温箱中(为了节约试验时间，适当提高温度，可以较快速的了解纳米硒在不同保护剂下的试验效果)，记录产生黑色硒的时间。
从表4中可以看出，在45℃下，不加任何保护剂与修饰剂，纳米硒在光合细菌发酵液中高温保存时间不到10天即产生黑色硒，同时各种氨基酸修饰的纳米硒与保护剂在高温对纳米硒具有明显的保护，其可以明显延长纳米硒保存时间，但长时间下也是不稳定的，最长时间都没有超过30天，就会形成黑色硒，特别意外的是，加入烟酸的光合细菌发酵液中在45℃恒温箱中放置60天，都没有发现黑色硒的出现，说明其可以作为常温保存纳米硒的保护剂。
表4，不同保护剂对纳米硒保护效查
实施例4考察了不同烟酸浓度对纳米硒的保护效果
将JCD-1菌在2g/L***钠(11.567mmol/L)浓度的光合细菌培养基中发酵7天后，各取500mL放置三角瓶中，分别加入不同浓度的烟酸，pH至7.0，在45℃恒温箱中，记录产生黑色硒的时间。
如表5所示，发现烟酸的摩尔浓度与***钠的摩尔浓度低于0.3：1即会产生黑色硒，而高于0.3：1的量在60天，没有出现黑色单质硒。
表5烟酸对纳米硒的保护效果
烟酸与***钠摩尔比 变黑时间(天)
0.1:1 15-18
0.2:1 30-33
0.3:1 未变色
0.5:1 未变色
1:1 未变色
2:1 未变色
3:1 未变色
实施例5考察不同浓度烟酸对光合细菌的的影响
烟酸作为纳米硒保护剂是在光合细菌完全将***钠转化成纳米硒完成后，才加入烟
酸的，但是若在培养基中就加入烟酸，会不会影响光合细菌的生长，则进一步进行了试验，将在2g/L***钠(11.567mmol/L)浓度的光合细菌培养基中再加入不同浓度的烟酸，再接种JCD-1菌，光照培养7天，检测菌数及纳米硒转化率。
试验结果如表6，从表6中可以看出，在培养基中加入不同浓度的烟酸对光合细菌的生长有明显影响的，在低于0.05g/L时，随着烟酸浓度增加是可以促进光合细菌的生长，而且可以提高纳米硒的转化率的，但在高于0.05g/L时，随着初始烟酸浓度增加是可以抑制光合细菌的生长，同时降低纳米硒的转化率。因此前其培养基中加入的烟酸适合用量为0.05g/L，
表6不同浓度烟酸对培养光合细菌的效果
烟酸浓度(g/L) 纳米硒转化率(％) 活菌数(cfu/mL)
0.01 96.7 28.4
0.05 97.7 30.1
0.1 97.4 29.3
0.2 96.4 27.3
0.5 94.6 24.2
1 91.9 22.1
3 86.4 18.3
实施例6考察加入烟酸的光合细菌液体培养基中不同浓度***钠对JCD-1菌的影响及纳米硒的转化率
利用新的光合细菌液体培养基：氯化铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，酵母膏0.6g/L，红糖0.5g/L，烟酸0.05g/L，氯化钠4g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；只是改变***钠的浓度，接种JCD-1菌，光照厌氧培养7天，检测活菌与纳米硒转化率。从表7可以看出，在培养基中，加入了烟酸，能明显增加纳米硒的转化率与高浓度亚硒钠的光合细菌菌数(这是出乎意料的)。以***钠5g/L为例，在没有加烟酸时，从表3中可以看出纳米硒的转化率仅仅79.8％，而加入烟酸时，其纳米硒转化率达到了91.6％，提高了14.78％，且光合细菌的菌数也提高了30.3％。
表7加入烟酸的光合细菌液体培养基中不同浓度***钠对JCD-1菌及纳米硒的转化率的影响
实施例7利用该高产纳米硒的光合细菌制备的纳米硒活菌制剂采用桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)菌种按以下步骤进行培养：
(1)、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
(2)、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：
1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
(3)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：2000-6000lux，搅拌速度为120转/分钟，培养至第5天，检测其纳米硒的转化率为93.2％，活菌含量为23.4亿cfu/ml；开始补加烟酸至总浓度为0.64g/L，继续培养2天，检测其纳米硒单质含量为1.303g/L，计算纳米硒转化率为95.1％，即可放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的半固体光合细菌培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.5g/L，微量元素1mL，琼脂8-10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.6g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，酵母膏0.8g/L，红糖0.4g/L，***钠3.75g/L，氯化钠4g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，所述的微量元素为：七水硫酸亚铁0.2g，四水氯化锰0.1g，硼酸0.1g，六水氯化钴0.1g，氯化锌0.1g，二水钼酸钠0.02g，二水氯化铜0.01g，蒸馏水1000mL。
对其常温下贮，保存时间为一年，未产生黑色单质硒，纳米硒活菌的色泽未发生改变，进行检测，其纳米硒的含量为1.315g/L，纳米硒的含量还有所提高，活菌含量为18.5亿cfu/ml；菌数损失不大(比常规光合细菌常温保存活菌损失还少)，可能是纳米硒与烟酸结合后，减少了对菌的损伤，或者对菌还有一定的保护作用。
实施例8利用该高产纳米硒的光合细菌制备的纳米硒活菌制剂
采用桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)菌种按以下步骤进行培养：
(1)、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
(2)、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：
1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
(3)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：2000-6000lux，搅拌速度为120转/分钟，培养至第5天，检测其纳米硒的转化率为88.2％，活菌含量为21.8亿cfu/ml；开始补加烟酸至总浓度为1.07g/L，继续培养2天，待检测其单质纳米硒含量2.080g/L，即转化率为91.1％，即可放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的半固体光合细菌培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.5g/L，微量元素1mL，琼脂8-10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.6g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，酵母膏0.8g/L，红糖0.4g/L，***钠6.25g/L，氯化钠4g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，所述的微量元素为：七水硫酸亚铁0.2g，四水氯化锰0.1g，硼酸0.1g，六水氯化钴0.1g，氯化锌0.1g，二水钼酸钠0.02g，二水氯化铜0.01g，蒸馏水1000mL；
培养结束后，采用扫描电子显微镜(SEM)观察所产生的纳米硒，如图1所示，观察到粒径为50-300nm的纳米颗粒。对其常温下贮，保存时间为一年，未产生黑色单质硒，纳米硒活菌的色泽未发生改变，采用扫描电子显微镜(SEM)，观察到粒径为50-300nm的纳米颗粒，说明其纳米硒保存过程中未发生凝聚现像。进行检测，其纳米硒的含量为2.165g/L，纳米硒的含量还有所提高，活菌含量为15.2亿cfu/ml；光合细菌的损失较常规不加***钠与烟酸的菌数的损失还小，是我们意想不到的。
实施例9本发明的液体纳米硒活菌制剂在金银花作物田间试验的使用情况
1、材料和方法
1)试验地概况
试验在湖南省邵阳市隆回县的司门前镇某种植户。金银花供试材料为当地四年生普栽品种。
2)试验设计
采用田间小区对比试验。试验设四个处理：
空白对照组：以叶面喷施清水30公斤；
光合细菌组：以叶面喷施加入了本发明所述的纯光合细菌50毫升的30公斤水；
***钠组：以叶面喷施加入了5g/L的***钠光合细菌发酵培养基溶液50毫升的30公斤水；
纳米硒活菌制剂灭活组(实施例8制备的)：将纳米硒活菌制剂中的光合细菌进行灭活(加入适量杀菌剂)后，取其50毫升，溶于30公斤水进行叶面喷施；
纳米硒活菌制剂组(实施例8制备的)：以叶面喷施加入了本发明所述液体纳米硒活菌制剂50毫升的30公斤；
设3组平行，每组平行的小区面积为667m2。其他管理均与大田栽培相同，仅控制叶面喷施液体一个单一变量。第一次叶面喷施肥时间为2019年5月10日；第二次叶面喷施时间为2019年6月1日，总共施两次；
3)产量指标的测定
花蕾测定：于2019年6-7月进行，所测指标：金银花硒含量，花蕾长度，百蕾重(干花)。
2、结果与分析
从表8中可以看出施用本发明的液体纳米硒活菌制剂后，金银花新生枝条上的花芽分化能力明显增强，着花数量更多；其中花蕾长，花蕾单重都明显比对照组有差异，金银花的产量有明显提高，增产率达到了33.32％。其金银花有机硒含量显著增高，较空白对照组高2.16倍，从表8中可以看出，仅仅施用光合细菌对富硒增产率仅仅只有提高6.7％，但从产量上，可以明显提高金银花的产量，可提高15.86％，本发明中的纳米硒活菌制剂中的光合细菌对金银花具有一定增产作用。而喷施了含***钠光合细菌发酵培养基的金银花，对于其增产的效果不显著，仅仅增产了4.54％，但对金银花的有机硒含量增加明显，增加了1.06倍。
喷施了含有活菌的纳米硒活菌制剂组比灭活的纳米硒活菌制剂的金银花，其明显更增产且富硒效果更佳。主要是活的光合细菌能明显促进金银花新生枝条上的花芽分化能力明显增强，着花数量更多，活菌能在叶面上定植，能促进叶面原著微生微的生长，从而促进其提高产量，纳米硒与活菌相结合更加促进金银花对硒的吸收转化。而灭菌的纳米硒对于其增产效果还不如光合细菌组，但比***钠组效果好，但富硒效果也比***钠组效果显著。
表8液体纳米硒微生物菌剂对金银花产量与富硒的影响
实施例10液体纳米硒活菌制剂在茄子上的应用效果
1.试验地点：湖南省隆回县滩头镇
2.采用田间小区对比试验。试验设四个处理：
空白对照组：以叶面喷施清水3公斤/小区；
光合细菌组：以叶面喷施加入了本发明所述的纯光合细菌10毫升的3公斤水；
***钠组：以叶面喷施加入了3g/L的***钠光合细菌发酵培养基溶液10毫升的3公斤水；
纳米硒活菌制剂灭活组(实施例7制备的)：将纳米硒活菌制剂中的光合细菌进行灭活(加入适量杀菌剂)后，取其10毫升，溶于3公斤水进行叶面喷施；
纳米硒活菌制剂组(实施例7制备的)：以叶面喷施加入了本发明所述液体纳米硒活菌制剂10毫升的3公斤；
设3组平行，每组平行的小区面积为66.7m2。其他管理均与大田栽培相同，仅控制叶面喷施液体一个单一变量。在茄子幼果期，膨大期分别叶面喷施一次，总共施两次；
3.试验结果：从表9可以看出，纳米硒活菌制剂组的茄子有机硒含量是空白对照组的6倍，也比***钠组高1.81倍，比纳米硒菌灭活组高53.69％，显然，本发明纳米硒活菌制剂对茄子的富硒的效果非常显著，同样，纳米硒活菌制剂组比空白对照组增产15.28％，市价以1元/斤计算，亩净增收益达986元，而本纳米硒活菌制剂市场价不高于20元/L，性价比特别好。最重要的是应用了纳米硒活菌制剂后，植株的病害减少了，在整个应用过程中没有使用农药，大大降低了种植成本。
表9液体纳米硒活菌制剂对茄子产量与富硒的影响
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (3)

1.利用高产纳米硒光合细菌制备纳米硒活菌制剂的制备方法，其特征在于：
高产纳米硒光合细菌采用桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)菌种，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.10344，保藏日期为2015年1月12日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，按以下步骤进行培养：
(1)、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即为活化的菌种；
(2)、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：
1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
(3)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4-1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：2000-6000lux，搅拌速度为120转/分钟，培养至第5-6天，检测其纳米硒的转化率≥88％，活菌含量≥20亿cfu/ml；开始补加烟酸至烟酸总浓度为0.64-1.07g/L，继续培养2-3天，待检测其纳米硒含量≥1g/L，纳米硒转化率≥90％，即可放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的半固体光合细菌培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-4g/L，碳酸氢钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，酵母膏0.1-1g/L，微量元素1mL，琼脂8-10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.4-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-4g/L，碳酸氢钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，酵母膏0.1-1g/L，烟酸0.05-0.1g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基为：氯化铵0.8-1.2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠3-8g/L，碳酸氢钠3-8g/L，酵母膏0.1-1g/L，红糖0.1-1g/L，***钠0.5-25g/L，氯化钠4-10g/L，烟酸0.05-0.1g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，所述的微量元素为：七水硫酸亚铁0.2g，四水氯化锰0.1g，硼酸0.1g，六水氯化钴0.1g，氯化锌0.1g，二水钼酸钠0.02g，二水氯化铜0.01g，蒸馏水1000mL。
2.如权利要求1所述的纳米硒活菌制剂的制备方法，其特征在于，采用桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)菌种按以下步骤进行培养：
(1)、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即为活化的菌种；
(2)、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：
1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
(3)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：2000-6000lux，搅拌速度为120转/分钟，培养至第5天，检测其纳米硒的转化率为88.2％，活菌含量为21.8亿cfu/ml；开始补加烟酸至总浓度为1.07g/L，继续培养2天，待检测其单质纳米硒含量2.080g/L，即转化率为91.1％，即可放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的半固体光合细菌培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.5g/L，微量元素1mL，琼脂8-10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，九水硫化钠0.1g/L，酵母膏0.6g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠4g/L，酵母膏0.8g/L，红糖0.4g/L，***钠6.25g/L，氯化钠4g/L，烟酸0.05g/L，微量元素1mL，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，所述的微量元素为：七水硫酸亚铁0.2g，四水氯化锰0.1g，硼酸0.1g，六水氯化钴0.1g，氯化锌0.1g，二水钼酸钠0.02g，二水氯化铜0.01g，蒸馏水1000mL。
3.如权利要求1或2所述制备方法所制备的纳米硒活菌制剂应用于富硒种植。
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