KR101491493B1

KR101491493B1 - 감귤 과피 및 구아바 추출물을 포함하는 항염증 약학 조성물

Info

Publication number: KR101491493B1
Application number: KR20130037024A
Authority: KR
Inventors: 김종찬; 정승원; 정진웅; 장미; 김소미; 안광석
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2013-04-04
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2015-02-09
Also published as: KR20140120756A

Abstract

본 발명은 염증 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로서, 감귤 과피 추출물 (바람직하게는 팔삭 과피 추출물) 및 구아바 잎 추출물을 유효성분으로 함께 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 염증 치료 또는 예방 효과를 달성하는데 있어 시너지적 효과를 발휘하는 상기 감귤 과피 추출물 (바람직하게는 팔삭 과피 추출물) 및 구아바 잎 추출물의 혼합 중량비를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 추출물에 인진호 추출물이 실질적으로 포함될 경우 항염증 효과가 줄어드는 사실에 기초한다.

Description

감귤 과피 및 구아바 추출물을 포함하는 항염증 약학 조성물{Anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising tangerine pericarp and Psidium guajava extract}

본 발명은 항염증 활성을 가진 약학 조성물에 관한 것으로서, 복수의 유효성분이 포함되어 항염증 활성이 시너지적으로 증진된 복합(combination) 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 복수의 유효성분들이 시너지적인 효과를 발휘하기 위한 혼합비에 관한 것이다.

염증반응은 활성화된 면역세포에 의해 필연적으로 일어나는 일련의 면역반응이다. 면역세포가 세균, 바이러스 등을 포함한 미생물 및 생체의 이물질 등 외부물질에 노출되면 면역세포가 활성화되고, 활성화된 면역세포에서 염증반응을 가속시킨다. 세균성 염증유발물질인 지질다당류(LPS, lipopolysaccharide)에 의한 염증반응이 일어나면 여러 가지 염증인자들(pro-inflammatory mediators)이 만들어지는데, 염증인자에는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS, inducible nitric oxide synthase)에 의해 만들어지는 산화 질소(NO, nitric oxide)와 사이클로옥시게나제(COX-2, cyclooxygenase)에 의해서 만들어지는 프로스타글란딘 E₂(PGE₂, prostaglandin E₂) 등이 있다.

NO는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로서 산화질소 합성효소 (NOS)에 의해 L-아르기닌으로부터 생성된다. NO는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데 특히 대식세포가 지질다당류 (LPS)와 인터페론-γ(IFN-γ)로 자극될 때 유도성 산화질소 합성효소 (iNOS)가 발현되어 많은 양의 NO를 생성하게 된다. 이렇게 생성된 많은 양의 NO는 염증반응 매개물질의 역할을 하게 된다.

PGE₂는 주요 염증매개 인자로서 대식세포에서 사이토카인, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 및 지질다당류(LPS)와 같은 자극에 의해 염증반응의 전사인자인 핵산 인자-κB(NF-κB)를 활성화시켜 그 결과 사이클로옥시게나제-2 (COX-2)가 발현될 때 과량으로 생성된다. PGE₂는 혈관 투과성을 증가시켜 염증부위의 열, 부종과 통증을 유발할 수 있다. PGE₂의 합성은 비스테로이드성 진통소염제 (non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)에 의해 억제되고 이는 해열, 진통, 항염 작용 등에 응용되며 항염증제로 류마티즘성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염 같은 근육 골격질환에 사용된다.

NO 및 PGE₂의 생성을 억제하여 항염증 효과를 갖는 약학 조성물을 개발하기 위해 많은 노력이 이루어지고 있으며, 그 중 천연 식물성 유효성분을 포함하는 염증 치료 또는 예방용 약학 조성물에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다.

한편 감귤(tangerine)은 일본, 한국 및 중국에 공통된 원예학상 용어로 특정 과실의 명칭이다. 감귤에 함유되는 성분은 품종에 따라 다소 함유량이 다르지만, 주요 성분으로서 비타민 C가 과육 속에 많이 함유되어 있다. 비타민A는 카로텐 함량으로 조생온주는 60mg/100g, 보통 온주는 12mg/100g 정도이며, 기타 비타민 P의 효력을 가지는 헤스페리딘이나 비타민E 등의 성분이 함유되어 있다. 감귤에는 플라보노이드(flavonoid)류, 카로테노이드(carotenoid)류, 쿠마린(coumarin)류, 페닐프로파노이드(phenylpropanoid)류, 리모노이드(limonoid)류 등의 많은 생리활성물질이 있다. 제주 자생 재래감귤인 팔삭(Citrus hassaku)은 감귤속(Citrus)에 속하는 종(種)명이고 각종 질환의 치료와 예방에 효능을 갖는 것으로 나타나 현재 많은 연구가 이루어지고 있다.

감귤 과피에는 나린진(naringin)과 헤스페리딘(hesperidin)의 함량이 과육보다 더 높으며 총 식이섬유소 함량 또한 과육 부분보다 과피 부분에서 더 높은 것으로 알려져 있다. 감귤 과피에는 풍부한 카르테노이드(carotenoid), 바이오플라보노이드(bioflavonoid), 터핀(terpenes)가 있어 고혈압 예방, 혈중 LDL 콜레스테롤 저하작용 및 HDL 콜레스테롤함량을 높이며 순환계 질환의 예방 및 개선효과 등 다양한 생리적 작용이 보고되고 있다. 감귤의 전체, 과피 및 과육 세 가지 감귤시료 중에서 과피분말에서 플라보노이드, 항산화, 비타민, 식이섬유 함량이 가장 높았으며 또한 항산화능 증진과 체중감소 효과도 보고된 바 있다.

구아바는 도금양과(Myrtaceae과) Psidium 속의 미국산 열대성 식물로서, 화분식물은 물론 잎, 나무껍질, 열매 등을 건강식 및 약용으로 이용할 수 있는 약용식물이다. 구아바에는 비타민 C, 마그네슘, 칼륨, 칼슘 등 비타민과 미네랄이 많이 함유되어 있으며, 과산화변이억제 작용(암예방), 과산화수소 소거 작용(노화방지), 활성산소발생억제작용(미백효과), 항비만 작용(아밀라제 억제), 항당뇨증작용 (당흡수억제), 항 알레르기 작용(히스타민류 억제) 등이 보고되어 있다.

쑥은 우리나라 전역에 자생하는 식용식물로 단백질, 지방질, 섬유질, 당질 칼슘, 인, 비타민 A, B, C가 풍부한 식품자원이다. 예로부터 나물, 쑥국, 죽 및 쑥떡 등의 음식으로 널리 섭취되어 왔다. 이 중 인진(茵蔯)쑥은 국화과 쑥속에 속하는 다년생 초본형 낙엽관목으로, 생당쑥, 애당쑥, 사철쑥(Artemisia capillaries THUNB.), 인진초, 더위지기(Artemisia iwayomogi), 흰산쑥(Artemisa sacrorum subsp. Kitamura), 털산쑥(Artemisa sacrorum subsp. manshuria var. vestita Kitamura) 등으로 불리며 특히, 어린잎을 인진 또는 더위지기라 부르는데 그 특유의 향기와 약효로 인하여 전통적으로 민간에서 식용, 약용, 단방약으로 애용하여 왔다. 인진쑥은 국화과의 여러해살이풀 사철쑥의 어린 싹이며, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간암 등에 널리 사용되고 있으며, 눗, 담낭결석 등의 질환에도 사용되고 있다. 약리작용으로는 담즙분비촉진작용, 간 기능 보호작용, 특히 간세포의 재생작용이 탁월하다. 지질의 분해작용, 관상동맥 확장 작용과 혈압 강하 작용이 나타나고, 해열, 이뇨, 항균작용도 보인다.

한편, 한국 등록특허공보 제 10-0642744호는 생리활성을 갖는 진지향(감귤) 과피 추출액과 이를 이용한 식품에서 항염증 용도를 개시한 바 있으며, 한국 등록특허공보 제 10-0847103호는 구아바 발효 조성물 및 그 항염증 용도를 개시한 바 있으며, 한국 등록특허공보 제 10-0792613호는 항염증 효과를 갖는 인진호 내 쿠마린 및 스코폴레틴의 함량을 증가시키는 방법을 개시하였다.

본 발명자들은 상기 각각의 천연 추출물들의 항염증 효과가 아직까지 만족할 만한 수준에 도달하지 못하다는 것을 파악하고, 이러한 천연 추출물의 항염증 효과를 높일 수 있는 방법에 대해 꾸준한 연구를 수행하였다.

즉, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 염증의 치료 또는 예방 효과가 향상된 약학 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 유효성분으로 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 염증의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명 조성물의 복합 유효성분들은 NO 및 PGE₂ 생성을 시너지적으로 억제하여, 결과적으로 각각의 추출물보다 항염증 효과가 증진된 복합 조성물을 제공한다.

즉, 본 발명은 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 동시에 포함하는 조성물의 경우 각각의 단독으로 투여할 때보다 항염증 효과가 매우 급격히 증진된다는 놀라운 사실에 기초한다.

본 발명에 있어 감귤은 온주밀감(Citrus unshue), 팔삭(Citrus hassaku), 진지향(Citrus sinensis x reticulata), Citrus sinensis, Citrus reticulata, 감귤(Citrus aurantium L), 귤(Citrus unshiu S.Marcov.), 광귤(Citrus aurantium L.), 금귤(Fortunella margarita) 등 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 감귤로 명명되는 Citrus 속 식물의 과실을 말한다. 다만, 바람직하게는, 본 발명의 항염증이라는 목적상 제주도 재래 감귤인 팔삭(Citrus hassaku)이 본 발명의 감귤로 바람직하다.

보다 구체적으로, 본 발명의 감귤은 서귀포를 중심으로 한 제주도 일부에서 생산된 감귤뿐만 아니라 해발고도 200m 이하의 제주도 일원과 남부지방의 통영, 고흥, 완도, 거제, 남해 또는 금산 등지에서 수확된 감귤이 사용될 수 있다. 본 발명의 감귤 과피는 우리나라에서 유통되는 전체 감귤 중 20~25%를 차지하는 가공용 감귤의 부산물로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에 따른 구아바(Psidium guajava) 잎은 원예 농업에서 발생하는 농산물 부산물로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에 따른 "추출물"은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 추출방법을 이용하여 제조될 수 있다. 즉, 감귤 과피 또는 구아바 잎을 음건하여 분쇄한 후, 추출용매를 감귤 과피 또는 구아바 잎 분쇄물의 1 내지 20배 부피량 만큼 가하여 추출하고 나서, 선택적으로 (감압)농축, 건조 또는 정제 과정을 거쳐 제조할 수 있다.

추출 용매로는 정제수; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들은 혼합 용매를 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 전술한 방법과 같이 추출용매를 가하여 유효성분물질을 추출하되 (a) 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 내지 100℃의 온도 조건에서 1 내지 20시간 가열하여 추출하거나, (b) 5 내지 37℃의 온도 조건에서 1 내지 15일간 침적시켜 유효성분을 추출할 수 있다. 즉, 교반 추출, 환류 냉각 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 추출방법을 사용하여 제조할 수 있다.

바람직하게, 본 발명은 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 함유하는 항염증용 조성물에 있어, 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 87 : 13 내지 62 : 38 중량비, 더욱 바람직하게는 80 : 20 내지 70 : 30 중량비, 가장 바람직하게는 75 : 25 중량비 (감귤 과피 추출물 : 구아바 잎 추출물)로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어 상기 중량비는 건조된 상태의 추출물들의 중량비를 의미한다.

본 발명은 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 상기 중량 혼합비로 포함할 경우에 다른 혼합비로 포함하는 조성물에 비해 항염증 효과가 놀라울 정도로 높아진다는 또 다른 사실에 기초한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 함유하는 본 발명에 따른 항염증용 조성물에 있어서 생당쑥, 애당쑥, 사철쑥(인진호, Artemisia capillaries), 더위지기(Artemisia iwayomogi), 흰산쑥(Artemisa sacrorum subsp. Kitamura), 털산쑥(Artemisa sacrorum subsp. manshuria var. vestita Kitamura) 등의 쑥 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 염증의 개선 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 함유하는 항염증용 조성물에 쑥 추출물이 함께 포함될 경우 조성물의 전체적인 항염증 효과가 저하되었으며, 쑥 추출물의 항염증 효과가 높다고 알려진 사실을 고려할 때 이는 매우 특이적이다.

본 발명에 있어 "실질적으로 포함하지 않는다"는 것은 조성물 총 중량 대비 해당 쑥 추출물을 5 중량% 이하를 포함하는 것을 의미하며, 바람직하게는 3 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 1 중량% 이하, 가장 바람직하게는 0.5 중량% 이하를 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 치료 또는 예방용 약학 조성물은 (S1) 감귤 과피 및/또는 구아바 잎으로부터 물 또는 알콜성 수용액을 추출 용매로 하여 추출물을 추출하는 단계; 및 (S2) 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 80 : 20 내지 70 : 30 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 혼합비로 제조된 염증 치료 또는 예방용 조성물은 의약품의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 의약품은 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 추출물 혼합물은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.

본 발명의 추출물 혼합물을 포함하는 의약품은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 특정 혼합비로 제조된 감귤 과피 추출물과 구아바 잎 추출물의 혼합물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 추출물 혼합물; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 추출물 혼합물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.

염증 개선이라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물의 혼합물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 감귤 과피 추출물, 구아바 잎 추출물 속의 유효성분들의 혼합물로써 향상된 항염증 효과를 발생시켜 염증의 치료 또는 예방 용도를 제공한다. 특히, 최적의 혼합비로 구성된 약학 조성물은 시너지적으로 증진된 항염증 효과를 발생시켜 염증의 치료 또는 예방에 탁월하다.

도 1은 혼합물 설계를 위한 심플렉스 설계 구성이다.
도 2는 LPS-유도된 RAW 264.7 cells에서 NO 생성에 대한 회귀 분석 및 분산 분석 결과이다.
도 3의 (A)는 LPS-유도된 RAW 264.7 cells에서 팔삭 과피 (X1), 구아바 (X2), 및 인진호 (X3)의 NO 생성에 대한 효과를 나타내는 삼각 차원의 등고선 도표이다. 등고선은 NO 생성%를 나타낸다. 도 3의 (B)는 LPS-유도된 RAW 264.7 cells에서 NO 생성에 대하여 팔삭 과피, 구아바 및 인진호 추출물의 서로 다른 혼합비들의 효과를 보여주는 반응 표면이다.
도 4는 LPS-유도된 RAW 264.7 cells에서 PGE₂생성에 대한 회귀 분석 및 분산 분석 결과이다.
도 5의 (A)는 LPS-유도된 RAW 264.7 cells에서 팔삭 과피 (X1), 구아바 (X2), 및 인진호 (X3)의 PGE₂생성에 대한 효과를 나타내는 삼각 차원의 등고선 도표이다. 등고선은 PGE₂ 생성%를 나타낸다. 도 5의 (B)는 LPS-유도된 RAW 264.7 cells에서 PGE₂ 생성에 대하여 팔삭 과피, 구아바, 및 인진호 추출물의 서로 다른 혼합비들의 효과를 보여주는 반응 표면이다.
도 6은 NO 및 PGE₂ 생성량이 최소인 팔삭 과피, 구아바 및 인진호의 혼합 비율을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

구아바 잎 추출물의 제조

구아바(Psidium guajava)는 제주대학교로부터 입수한 구아바 잎을 건조하고 분쇄기를 사용하여 마쇄한 후 20 mesh 체를 통과시켜 사용하였다.

상기 분쇄된 구아바 잎을 구아바 잎의 20배 중량의 55% 에탄올 수용액을 사용하여 추출온도 47℃에서 4.5시간 동안 환류추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압농축기(rotary vacuum evaporator)로 45℃이하에서 농축하여 동결 건조하였다.

인진호 추출물의 제조

인진쑥(Artemisia capillaris Thumb)는 제주대학교로부터 입수한 인진쑥 잎을 건조하고 분쇄기를 사용하여 마쇄한 후 20 mesh 체를 통과시켜 사용하였다.

상기 분쇄된 인진쑥 잎을 인진쑥 잎의 20배 중량의 54% 에탄올 수용액을 사용하여 추출온도 63℃에서 6.5시간 동안 환류추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압농축기(rotary vacuum evaporator)로 45℃이하에서 농축하여 동결 건조하였다.

팔삭 과피 추출물의 제조

초임계 이산화탄소 추출장비를 이용하여 팔삭 과피 추출을 진행하였다

1) 팔삭 과피를 가정용 믹서기로 분쇄하여 531.3g을 칭량한 뒤 3L 초임계 추출조에 넣고 추출기를 밀봉하였다.

2) 추출조의 하부로부터 이산화탄소를 고압기체 펌프(Haskel Gas Booster, Model No.: AGT-30/75)를 이용하여 300기압까지 주입한다. 추출조의 내부 온도는 50℃를 유지한다.

3) 추출기 상부에 도출 밸브를 열어 추출물을 회수조를 통해서 받고 내부압력과 온도가 300기압과 50℃를 유지하도록 고압기체 펌프를 조절하였다.

4) 총 3시간 추출을 진행하여 더 이상 추출물이 생성되지 않음을 확인하였고 이때 사용된 CO₂의 양은 19Kg(유속: 분당 0.1Kg) 이었다.

5) 수분이 함유된 crude 추출물 19.77g을 수득하였다.

재료 혼합비율의 최적화를 위한 실험 설계

각 추출물은 MTT assay를 통하여 세포독성이 나타나지 않는 농도로 희석하여 혼합물 실험계획에 사용하였다.

실험의 설계, 데이터 분석 및 최적화는 통계소프트웨어인 미니탭 (MINITAB ver. 18)을 사용하였고, 실험계획법 중 혼합물 설계(mixture design)에 따라 설계하였다. 독립변수로는 팔삭의 과피 초임계추출물, 구아바 잎 추출물, 인진호 추출물로 설정하였으며 혼합물 실험에서 팔삭의 과피 추출물이 적어도 50%이상 되어야 한다는 혼합비율에 대한 하한제약을 설정하였다. 이와 같이 제약조건을 갖는 시료의 성분비에 따라 혼합물 설계 중 심플렉스 중심 설계(Simplex Centroid Design)를 사용하였고, 전체설계의 설정 반복은 1회로 한정하였다. 혼합물 총량을 1로 두었을 때 각 성분별 한계를 다음 식(1)과 같이 제약하였다.

식(1)

X1 + X2 + X3 = 1

0 = X1 = 0.5

0 = X2 = 1.0

0 = X3 = 1.0

여기서, 식(1)에서 X1은 팔삭 과피의 초임계추출물을 X2는 구아바 잎 추출물을, X3는 인진호 추출물을 각각 나타낸다. 미니탭의 혼합물 설계를 이용하여 각 설정된 범위를 입력하였을 때 축과 중심으로 10개의 실험점이 설정되었으며(도 1) 실험점의 재료 혼합비율은 표 1과 같고, 모든 실험순서는 구획에 따른 오차를 없애기 위하여 무작위로 실행하였다.

상기 팔삭 과피의 초임계추출물과 분쇄된 구아바 잎 및 인진호를 하기 표 1에 나타난 바와 같은 혼합비로 혼합하였다.

실시예	팔삭 과피 추출물	구아바 잎 추출물	인진호 추출물
1	1.0000	0.0000	0.0000
2	0.5000	0.5000	0.0000
3	0.5000	0.0000	0.5000
4	0.7500	0.2500	0.0000
5	0.7500	0.0000	0.2500
6	0.5000	0.2500	0.2500
7	0.6667	0.1667	0.1667
8	0.8333	0.0833	0.0833
9	0.5833	0.3333	0.0833
10	0.5833	0.0833	0.3333

NO 생성량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 니트라이트 농도를 Griess regent를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 cells를 1x10⁵cells/well로 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 배양한 후 각 혼합물로 전처리하고 2시간 후 지질다당류(LPS, lipopolysaccharide)(1 ug/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100 uL를 96 웰 플레이트에 취하고, 여기에 동량의 Griess regent를 넣어 10분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.

각 실시예 1 내지 10에서의 혼합비에 따른 NO 생성량 (%)를 측정한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같이 36.00~47.58%의 범위로 측정되었다. 이는 구아바 잎 및 인진호의 최적 추출물의 NO 생성량인 45.81 ± 0.62%, 57.79 ± 0.82% 보다 낮아 혼합 추출물이 NO 생성을 더 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났다.

하기 표 2에서 보듯이, 실시예 2와 3, 실시예 4와 5를 각각 비교하면 팔삭 과피와 인진호의 혼합물보다 팔삭 과피와 구아바 잎의 혼합물이 NO 생성을 보다 억제하는 것으로 나타났다. 실시예 2와 4를 비교하면 팔삭 과피와 구아바 잎의 혼합비가 1 : 1인 것보다 3 : 1인 것이 NO 생성을 보다 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 NO 생성량은 혼합물 내 인진호의 양이 적을수록, 팔삭 과피와 구아바 잎의 비율이 3 : 1에 가까울수록 NO 생성량이 낮아짐을 알 수 있다.

PGE ₂ 생성량 측정

PGE₂ 양을 측정하기 위해 우선 RAW 264.7 cells를 6 웰 플레이트에 1x10⁶cells/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 새로운 RPMI 1640배지로 교환 후 각 혼합물로 세포에 전처리하고 2시간동안 배양한 후 LPS(1 ug/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양액을 5,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 PGE₂ 효소 면역 분석 (EIA) 키트 (R&D Systems, Abington, UK)을 사용하여 PGE₂ 양을 측정하였다.

각 실시예 1 내지 10에서의 혼합비에 따른 PGE₂의 생성량 (%)은 표 2과 같이 49.73~67.08%의 범위로 측정되었다.

하기 표 2에서 보듯이, 실시예 2와 3, 실시예 4와 5를 각각 비교하면 팔삭 과피와 인진호의 혼합물보다 팔삭 과피와 구아바 잎의 혼합물이 PGE₂ 생성을 보다 억제하는 것으로 나타났다. 실시예 2와 4를 비교하면 팔삭 과피와 구아바 잎의 혼합비가 1 : 1인 것보다 3 : 1인 것이 PGE₂ 생성을 보다 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 PGE₂ 생성량은 혼합물 내 인진호의 양이 적을수록, 팔삭 과피와 구아바 잎의 비율이 3 : 1에 가까울수록 PGE₂ 생성량이 낮아짐을 알 수 있다.

실시예	RAW 264.7 세포에서 LPS-유도된 NO 생성량	RAW 264.7 세포에서 LPS-유도된 PGE₂ 생성량
1	43.12	63.61
2	40.60	63.98
3	45.35	67.08
4	36.00	49.73
5	46.39	63.98
6	39.78	49.83
7	47.58	52.26
8	38.97	58.16
9	36.29	56.80
10	37.56	57.48

상기 표 2에 나타낸 실험결과를 근거로 하여 항염증 활성 증진효과를 위한 NO 생성량 및 PGE₂ 생성량을 최소화할 수 있는 팔삭 과피 추출물, 구아바 잎 추출물, 및 인진호 추출물의 혼합비를 평가하였다.

회귀 분석

미니탭의 혼합물 설계 분석을 이용하여 실험 결과에 대한 분석을 실시하였다. 팔삭 과피, 구아바 및 인진호 혼합물의 NO 생성량에 대한 혼합물 분석 결과와 등고선도 및 표면도는 도 2과 도 3에 나타내었다. 도 3 (A)는 선형회귀 함수식으로부터 계산된 독립변수와 종속변수간의 관계를 시각적으로 보여주는 등고선도이며 이러한 등고선도 및 표면도(B)를 통해 유의성분과 반응인자 간의 관계를 파악하고 도출하고자 하는 최적조건의 위치를 개괄적으로 알 수 있다. 도 2에서 팔삭*구아바의 p 값이 0.045이었으며 구아바*인진호의 p 값은 0.050로 나타나 5% 이내에서 유의성을 보였다. 도 3 (A)에서는 팔삭과 구아바의 양이 많을수록 인진호의 양이 적을수록 NO 생성량이 낮아짐을 알 수 있었다. 회귀분석 결과를 보면 선형모형의 데이터 적합도가 R-제곱 = 90.04%로써 데이터가 선형모형에 다소 유의하며 회귀분석 결과 p = 0.039와 선형계수도 p = 0.078로 비교적 유의한 수준을 보였다.

팔삭 과피, 구아바 잎 및 인진호 혼합 추출물의 PGE₂ 생성량에 대한 혼합물 분석 결과와 표면도는 도 4와 도 5에 나타내었다. 도 4에서 팔삭*구아바의 p 값이 0.011이었으며 구아바*인진호의 p 값은 0.006으로 나타나 5% 이내에서 높은 유의성을 보였다. 도 5 (A)에서 세 가지 성분 중에서 두 가지를 혼합한 추출물이 반응인자에 유의한 영향을 미치며 팔삭*구아바, 구아바*인진호의 경우에는 두 성분의 성분비에 따라 반응인자가 달라지는 것으로 나타났다. 회귀분석 결과를 보면 선형모형의 데이터 적합도가 R-제곱 = 93.07%로써 높은 신뢰성을 보이며 회귀분석 결과 p = 0.020 으로 비교적 유의한 수준을 보였다.

반응의 최적화

혼합물 설계에서 독립인자들의 최적 수준을 찾아내기 위한 최적화 기법 (Optimization Technique)은 매 단계에서 실험점에 대한 반응변수 값을 구한 후 점점 최적화되는 방향으로 이동하면서 인자들의 최적수준을 찾는 방법이다.

NO 및 PGE₂ 생성량을 최소화할 수 있는 팔삭, 구아바 및 인진호의 최적 혼합비율을 예측하기 위하여 미니탭 소프트웨어의 반응 최적화 도구를 이용하여 혼합비를 탐색하였다. 먼저 NO 생성량의 최소화의 경우에는 도 3 (A)와 표 2의 결과를 근거로 하여 망소 특성의 목표 값을 35.0으로 설정하였으며 허용 가능한 최대 반응 값인 상한 값은 48.0으로 설정하였다. PGE₂ 생성량의 최소화의 경우에도 도 5 (A)와 표 2의 결과를 근거로 하여 망소 특성의 목표 값을 48.0으로 허용 가능한 최대 반응 값인 상한 값을 68.0으로 정하였다. NO 및 PGE₂ 생성량의 가중치는 1로 설정하여 목표값과 한계값에 동등한 중요도를 부여하였고 NO 및 PGE₂ 생성량의 중요도의 경우 모든 반응이 똑같이 중요하기 때문에 각 반응의 중요도는 기본값 1로 설정하였다.

상기 조건을 이용하여 반응 최적화 도구를 실행한 결과, 최적 조건은 팔삭과피의 초임계 추출물(X₁), 구아바 잎 추출물(X₂), 인진호 추출물(X₃)이 각각 75.9%, 24.1%, 0.0%로 나타났다. 이 혼합조건에서 혼합 추출물의 NO 및 PGE₂ 생성량은 각각 35.1%, 51.7%로 나타났다(도 6). NO 생성량의 개별 만족도(d)는 0.99로 나타났으며 NO 생성량의 개별 만족도 0.81로 개별만족도를 결합한 종합만족도(D)는 0.90으로 높은 만족도를 나타냈다.

Claims

감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 유효성분으로 포함하며,
상기 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 87 : 13 내지 62 : 38 중량비(감귤 과피 추출물 : 구아바 잎 추출물)로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감귤은 팔삭(Citrus hassaku)인 것을 특징으로 하는 염증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 감귤 과피 추출물 및 구아바 잎 추출물을 80 : 20 내지 70 : 30 중량비(감귤 과피 추출물 : 구아바 잎 추출물)로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물 총 중량 대비 쑥 추출물을 5 중량% 이하로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 쑥 추출물은 인진호 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.