본 발명은 낙석등(Trachelospermi Caulis)과 녹제초(Pyrola japonica) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 복합 생약제를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 낙석등과 녹제초를 적정 비율로 혼합하여, 추출 정제함으로써, 소정량의 범위로 최적화시켜 단방 추출한 것에 비하여 진통효과, 급성 및 만성염증 억제작용, 염증유발관련 효소분비 억제, 및 NO, iNOs 생성억제 등이 보다 우수한 염증성 질환 예방 및 치료에 유용한 복합 생약제에 관한 것이다.
이와 같은 낙석등과 녹제초의 복합 생약 조성물은 물 또는 알콜 수용액으로 추출하여 생약제를 제조함에 있어서 다음과 같은 방법을 사용하였다.
낙석등과 녹제초의 생약을 잘게 썰어 1 : 1 ~ 15의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 1 ~ 5의 중량비로 혼합하고, 이 혼합 생약 중량에 10 ~ 15배의 물, 알콜 또는 알콜 수용액을 첨가하여 추출한다. 상기 추출 단계에서 얻어진 여액을 층분리하여 알콜층을 60 ~ 80℃로 감암 농축하고, 상기 농축단계에서는 얻어진 엑기스를 물로 공비농축하고 동결 건조하여 분말 엑기스를 제조하는 단계를 거쳐 제조한다.
이를 상세하게 설명하면, 낙석등과 녹제초 원 생약을 1 : 1 ~ 15의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 1 ~ 5의 중량비로 혼합하고 여기에 물, 알콜 또는 알콜 수용액을 가하고 2 ~ 3 시간, 2 ~ 5 회 반복하여 추출하며, 상온에서 서서히 냉각시킨 후 원심분리 등의 방법으로 여과하여 잔사와 분리한다. 상기 생약의 혼합비율이 상기 범위에 벗어나면 약효문제가 있다. 상기 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 10 ~ 15 배량의 물, 알콜 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과하는데 상기와 같이 잔사에 물 또는 알콜 수용액을 가하여 재추출 및 여과함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 이때, 추출에 사용되는 물, 알콜 또는 알콜 수용액의 사용량이 10 배량 미만 시 너무 적으면 추출물의 용해도가 나빠져서 추출효율이 떨어지고, 사용량이 15배량 초과 시 층 분리에 사용하는 알콜 수용액의 사용량이 증가하고, 감압 농축 시간이 오래 걸리는 등의 경제적이지 못하거나 취급상의 문제가 생길 수 있다.
상기 알콜은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 지방족, 방향족 알콜이 모두 사용 가능하며, 바람직하기로는 지방족 알콜, 보다 바람직하기로는 탄소수 1 ~ 6의 저급 알콜을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약 추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출 효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ~ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 판단된다.
상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 동량의 알콜 수용액을 용매로 사용량 2 ~ 5 회 층 분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제한다.
상기 알콜로는 탄소수 1 ~ 6개의 알콜이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올 수용액을 사용하는데, 저급 알콜 수용액 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층 분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성성분의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.
상기 층 분리한 추출액은 60 ~ 80 ℃에서 감압 농축하여 잔존하는 용매를 제거하며, 이렇게 얻어진 농축물에 상기 감압 농축 시 회수된 알콜을 가한 후 500 ~ 1000 rpm으로 원심 분리한 여액을 가하여 농축물을 혼탁 시킨 다음 재차 감압 농축시킨다. 상기 감압 농축 온도가 60 ℃ 미만 시 용매를 100% 제거하기 어렵고, 80 ℃ 초과 시 농축물의 안정성에 문제점이 발생하며, 상기 원심분리가 500 rpm 미만 시 농축물과 알콜의 분리가 어려워지고, 1000 rpm 초과 시 농축물의 안정성에 문제점이 발생한다.
이렇게 얻어진 농축물을 60 ~ 80 ℃에서 0.08 ~ 0.3 pa로 진공 건조시킨 후 30 ~ 80 메쉬로 분쇄 및 멸균하여 분말상의 낙석등과 녹제초의 혼합 추출물을 얻는데, 이러한 낙석등과 녹제초의 혼합 추출물은 각각 보다 복방 처방함으로써 소염 및 진통작용이 더 우수하여, 이 추출물을 포함하는 약제는 염증성 질환 예방 및 치료용 약제로서 매우 유용하리라 기대된다.
이러한, 본 발명에서 얻어진 복합 생약제의 원산지는 낙석등과 녹제초의 경우, 하남성 장사시에서 채취한 것으로 사용하고, 낙석등의 주성분인 악틴(Arctiin)이 0.5 ~ 1.1 중량% 함유되어 있어 악틴을 기준 물질로 한다. 상기 악틴(Arctiin)의 분자식은 C27H34O11 이다. 또한, 본 발명은 상기에서 제조된 분말 엑기스를 유효성분으로 함유한 약제를 퇴행성 관절염 치료제 및 소염 진통제에 사용하는 방법도 포함한다. 상기와 같은 방법으로 낙석등, 녹제초를 주재로 한 복합제로부터 추출된 엑기스의 유효 생리활성 물질을 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 낙석등의 주성분인 악틴(Arctiin)과 악티제닌(arctigenin)이 함유되어 있음이 밝혀졌고, 악틴(Arctiin)과 악티제닌(arctigenin)은 TNF-α를 억제하는 효과가 있는 걸로 연구되어 있다[Int Immunopharmacol. 2004 Oct;4(10-11):1419-29, Arctigenin, a phenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan, inhibits MAP kinases and AP-1 activation via potent MKK inhibition: the role in TNF-alpha inhibition].
녹제초의 경우 주성분인 알부틴(arbutin)은 염증 유발 인자인 NF-kB를 억제하는 연구가 이루워져 있다[J Dermatol Sci. 2003 May;31(3):193-201. Downregulation of NF-kB activation in human keratinocytes by melanogenic inhibitors].
본 발명의 항염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 경우 상기 지표물질인 악틴(Arctiin)의 함량이 약제에 사용된 낙석등, 녹제초 추출물 중 0.5 ~ 1.1 중량% 함유되어 있을 때 목적하는 약효를 얻을 수 있었다. 이때, 상기 악틴(Arctiin)의 함량이 0.5 중량% 미만인 경우 관절염 등의 치료에 상대적으로 저조한 결과를 얻게 된다. 또한, 본 발명에서 상기 악틴(Arctiin) 함량의 상한 범위에 대해 특별한 제한은 두지 않으나, 다만 일정수준 이상을 초과하여 함유되면 효과가 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않으므로 0.8 ~ 1.0 중량% 정도 사용되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 상기 지표물질로 선정한 악틴(Arctiin)은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 중요한 성분이며, 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서 얻은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 유효성분으로서 상기 성분 이외의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.
본 발명에 따른 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료에 유효한 약제의 제조방법을 간단하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 낙석등과 녹제초 복합 추출물을 통상의 제조방법으로 제형화하여 정제, 캅셀제 주사제 등을 제조하는데, 이들 중 정제 제조 시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 낙석등과 녹제초의 복합 추출물을 1 : 1 ~ 15의 중량비율로 사용하면 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.
이러한 의약물로 제조 시에는 혼합 추출물 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(dilute)등과 혼합하여 분말, 과립, 캅셀 또는 주사제 등으로 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 낙석등과 녹제초 복합 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 낙석등과 녹제초 복합 추출물은 체중 1 kg당 10 ∼ 1000 mg 정도를 투여하는 것이 바람직하며, 체중 1 kg당 50 ~ 500 mg이 더욱 바람직하다.
따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 약제는 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
참조예 1 : 낙석등 추출물의 제조
깨끗한 정제수로 세척하고 잘 건조시킨 후 낙석등을 30 % 에탄올 수용액을 상기 생약 중량의 5 ~ 8 배량 가해 잘 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕 추출하였다. 상기 추출 물질을 상온으로 서서히 냉각한 후 원심 여과하여 찌꺼기를 제거 후 여액을 병합하여 60 ~ 80 ℃에서 감압 농축 하였다.
상기 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가한 뒤 농축물을 충분히 현탁시킨 후 1000 rpm으로 원심 여과한 여액을 다시 감압 농축한 다음 60 ℃, 0.08 pa 조건으로 진공 건조시킨 후 80 메쉬로 분쇄 과정을 거쳐 멸균시켜 분말 상태의 낙석등 엑기스를 얻었다.
이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 낙석등 엑기스를 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 정제한 낙석등 추출물 중 악틴의 함량은 3.0 ~ 6.0 중량% 이였다.
참조예 2: 녹제초 추출물의 제조
정제수로 세척하고 잘 건조시킨 후 녹제초를 30% 에탄올 수용액을 상기 생약 중량의 5 ~ 8 배량 가해 잘 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕 추출하였다. 상기 추출 물질을 상온으로 서서히 냉각한 후 원심 여과하여 찌꺼기를 제거 후 여액을 병합하여 60 ∼ 80 ℃에서 감압 농축하였다.
상기 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가한 뒤 농축물을 충분히 현탁시킨 후 5000 rpm으로 원심 여과한 여액을 다시 감압 농축한 다음 60 ℃, 0.08 pa 조건으로 진공 건조시킨 후 80 메쉬로 분쇄 과정을 거쳐 멸균시켜 분말 상태의 녹제초 엑기스를 얻었다.
이상과 같은 방법으로 추출, 정제한 녹제초 엑기스를 HPLC에 의한 방법으로 분석한 결과 정제한 녹제초 추출물 중 알부틴(arbutin)의 함량은 0.1 ∼ 1.0 중량% 이였다.
참조예 3 : 혼합 생약 추출물의 제조
깨끗한 정제수로 세척하고 잘 건조시킨 동량의 낙석등과 녹제초(1:1 중량비)를 30% 에탄올 수용액을 상기 혼합 생약 중량의 5 ~ 8 배량 가해 잘 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕 추출하였다. 상기 추출 물질을 상온으로 서서히 냉각한 후 원심 여과하여 찌꺼기를 제거 후 여액을 병합하여 60 ~ 80 ℃에서 감압 농축하였다.
상기 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가한 후 농축물을 충분히 현탁시킨 뒤 1000 rpm으로 원심 여과한 여액을 다시 감압 농축한 다음 60 ℃, 0.08 pa 조건으로 진공 건조시킨 후 80 메쉬로 분쇄 과정을 거쳐 멸균시켰다. 상기한 방법으로 추출, 정제한 복합 생약 조성물 중 악틴(Arctiin) 함량은 약 0.5 ~ 1.1 중량%이었다. 또한, 상기 방법으로 얻어진 복합 생약 조성물은 다음 표 1과 같은 조건으로 HPLC 분석하였고, 분석한 결과는 도 1과 같다.
실시예 1 : TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 TPA 유도 귀부종 억제 테스트(TPA-induced mouse ear edema.)를 실시하였고, 6㎜ 펀치를 이용한 귀의 무게를 그 결과 값으로 하여 다음 표 2 에 나타낸 바와 같다.
[실험방법]
7주령 된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 SK제약 Joins 정을 400, 200 ㎎/㎏, 낙석등 추출물 400, 200 ㎎/㎏, 녹제초 추출물 400, 200 ㎎/㎏, 혼합 생약 추출물 400, 200, 20, 2 ㎎/㎏을 각각 경구 투여 후 1 시간 뒤 기염제인 TPA를 2.5 ㎍/20 ㎕의 농도로 아세톤에 녹인 후, 생쥐의 오른쪽 귀에 고루 발라 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 4 시간 후 마우스를 경추 탈골법으로 도태 시킨 뒤, 6 ㎜ 펀치를 이용하여 부종의 무게를 측정하였다.
상기 표 2 에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 혼합 생약 추출물을 사용한 경우 TPA 유도 귀부종 억제효과가 우수하며, 특히 혼합생약 추출물 400 mg/kg 농도일 경우, 부종 무게에서 염증 유발 억제율이 54 %로 가장 낮은 TPA 유도 귀 부종 억제율임을 알 수 있다.
실시예 2 : 아라키돈산 유도 귀 부종억제 테스트(Arachidonic acid- induced mouse ear edema assay)
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 아라키돈산 유도 귀 부종억제 테스트를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같다.
[실험방법]
7주령 된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 SK 제약 Joins정 400, 200 mg/Kg, 낙석등 추출물 400, 200 ㎎/㎏, 녹제초 추출물 400, 200 ㎎/㎏, 복합 생약 추출물 400, 200, 20, 2 mg/Kg을 각각 경구 투여 후 1 시간 뒤 기염제 아라키돈산은 아세톤(2 mg/20 ㎕)에 녹여 주어 오른쪽 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫(micro pipette)을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 1 시간 후 마우스를 경추 탈골법으로 도태시킨 뒤, 마이크로미터를 이용하여, 귀 두께를 측정하였고, 6㎜ 펀치를 이용하여 부종의 무게를 측정하였다.
상기 표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 혼합 생약 추출물을 사용한 경우, 아라키돈산 유도 귀 부종 억제 효과가 우수하며, 특히 복합 생약 조성물 400 mg/kg 농도일 경우, 부종 두께 및 부종 무게에서 부종 유발 억제율이 64%와, 56%로 가장 낮은 귀 부종 억제율임을 알 수 있다.
실시예 3 : 급성 염증 억제 테스트(λ Carrageenan -induced rats paw edema.)
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 급성 관절염 치료효과 검정을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 5 및 도 2에 나타낸 바와 같다.
[실험방법]
수컷 SD계 레트(200 g 내외)에 미리 조제한 SK Joins정을 400 mg/Kg, 낙석등 추출물 200, 400 ㎎/㎏, 녹제초 추출물 200, 400 ㎎/㎏, 혼합 생약 추출물 2, 20, 200, 400 mg/Kg을 1 ml 경구 투여하고 1% 카라지난(carrageenan) 생리식염수 100 ㎕를 좌측 족저부에 주사하여 족부 부종을 유도하였다. 부종은 플레시스모미터(plethysmometer, Ugo Basile 7140)를 이용하여 4 시간 후의 발 용적을 측정하였다(N=7).
표 5 및 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 혼합 생약 추출물을 사용한 경우 급성 관절염 치료 효과가 우수하며, 특히 혼합 생약 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 급성 관절염 치료 효과가 가장 바람직함을 알 수 있다.
실시예 4 : 만성 염증 억제 테스트(FCA-Induced arthritis in rats.)
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 만성 관절염 치료효과 검정을 실시하였고, 그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같다.
[실험방법]
7주령된 SD 랫트를 각 그룹별로 선별한 다음, 경구 투여를 위한 무게를 측정하였다. 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)가 1 ㎎/㎖의 농도로 함유된 컴플리트 프렌즈 보조시약(Complete Freund's adjuvant reagent) 0.1 ㎖/paw (In SIGMA)을 29G 시린지(Syringe)를 이용하여, 오른쪽 뒷발 족저 중심부에 피내 주입하였다. 시험 물질은 애쥬번트(adjuvant) 투여 후 21일 동안 1일 1회 동일 시간대에 경구 투여하고, 3일에 한번씩 족 부종 정도를 플레시스모미터(plethysmometer, Ugo Basile, Italy)로 측정하여, λ 카라지난(Carrageenan)에 의한 족부종법과 동일하게 부종 증가율로 산출하여 대조군과 비교하였다. 양성 대조 약물로는 디클로페낙(Diclofenac) 5 ㎎/㎏을 사용하였다
실시예 5 : 모세혈관 투과도 억제실험(Acetic acid-induced vascular permeability in mice)
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 모세혈관 투과도 억제 실험을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 6에 나타낸 바와 같다.
[실험방법]
낙석등 추출물 20, 200 ㎎/㎏, 녹제초 추출물 20, 200 ㎎/㎏, 낙석등과 녹제초의 혼합 생약 추출물을 2, 20 및 200 ㎎/kg b.wt.의 3개 용량으로 각각 증류수에 녹여(0.1 ㎖/10 g b.wt.) 경구투여 바늘(sonde)을 사용하여 경구로 강제 투여하였다. 투여 부피는 투여 당일에 측정된 체중에 따라 산출하였고, 대조군은 조제용매인 증류수만을 투여하였다(0.1 ㎖/10 g b.wt.). 페닐부타존(Phenylbutazone)은 50 ㎎/kg b.wt.의 용량으로 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 경구로 투여하였다. 인도메타신(Indomethacin)은 1 ㎎/kg b.wt.의 용량으로 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 경구로 투여하였다.
Whittle (1964)의 방법에 따라, 시험 전 12시간을 절식시킨 ICR계 웅성 마우스에 시험물질을 경구로 투여하였다. 투여 30분 후, 2.5% 에반스 블루 용액(Evans blue solution, 0.1 ㎖/10g b. wt.)을 꼬리 정맥을 통하여 투여하였다. 에반스 블루 투여 20분 후 0.6%의 생리 식염수에 녹인 초산(acetic acid saline)을 0.1 ㎖/10 g b. wt.의 용량으로 복강 내 주사하여 혈관 투과성의 항진을 유도하였다. 초산 투여 20분 후, 마우스를 경추 탈골로 치사시켜 5 ㎖의 생리식염수를 복강에 가하여 복부를 가볍게 흔들어준 후, 복강으로부터 세척액을 취하였다. 취한 세척액을 2,000 rpm에서 10분간 원심분리 후, 상층액을 취하여 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 630 nm에서 흡광도를 측정함으로써 복강 내로 유출된 에반스 블루의 양을 산출하였다. 양성 대조군으로는 페닐부타존(50 ㎎/㎏ b.wt.)과 인도메타신(1 ㎎/㎏ b.wt.)을 사용하였다.
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 혼합 생약 추출물을 사용한 경우 다른 대조약에 비해 월등히 억제 확인할 수 있고, 특히 혼합 생약 추출물 200 mg/kg 농도일 경우 대조군에 비해 용량-의존적으로 초산으로 유도된 혈관투과성항진을 억제하였다. 특히, 200 mg/kg 용량에서는 양성대조군인 페닐부타존 및 인도메타신에 비해 우수한 초산 유도 혈관투과성 항진 억제 작용을 나타내었다.
실시예 6 : 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트(Acetic acid-induced writhing response in mice.)
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 진통 테스트를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 7에 나타낸 바와 같다.
[실험방법]
7주령된 ICR 마우스를 각 후보별로 분리한 후 SK 제약 Joins 정을 400, 200 mg/Kg, 낙석등 추출물 200, 400 ㎎/㎏, 녹제초 추출물 200, 400 ㎎/㎏, 혼합 생약 추출물 2, 20, 200, 400 mg/Kg을 경구 투여 1시간 후 0.7% 아세트산을 복강 내 투여 (0.1 ml/10 g)하였다. 10분 후 10분 동안 마우스의 스트레칭(writhing :등을 쭉펴거나 뒷다리를 완전히 뻗어 제치는 현상)을 관찰하여 통각 지표로 사용하였다.
상기 표 7에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 혼합 생약 추출물을 사용한 경우 비틀림 수가 대조약에 비해 적음을 확인할 수 있고, 특히 혼합 생약 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 진통효과가 가장 우수함을 알 수 있다.
실시예 7 : NO , iNOS 및 TNF-α 생성에 미치는 영향
상기 참조예 3에 의해 제조된 혼합 생약 추출물에 대한 염증 관련 인자 치료효과 검정을 실시하였다.
[실험방법]
마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 ㎍/ml)로 처리한 후 24시간 경과 후에 배양액을 모아 효소법 및 라디칼 크로마토그래피(radical chromatography)법을 이용하고 LPS 처리 후 4시간 경과 후 세포를 용해(Lysis)시키고 iNOS 항체를 이용한 웨스턴 블랏(western blot)법을 이용해서 체내 염증유발 분자인 산화질소(nitric oxide, NO), 유발형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 TNF-α의 생성량에 미치는 낙석등, 녹제초 혼합 생약추출물의 영향을 검색하였다. NO는 24시간 배양액 100 ㎕를 취하고 그리스(Griess)시액을 100 ㎕ 씩 혼합하여 OD 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. iNOS, TNF-α는 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 ㎍/ml)로 처리한 후 4시간 경과 뒤에 용해(Lysis)시켜 모은 총 단백질(total protein)들을 전기영동과 전환(Transfer)한 다음, iNOS, TNF-α항체를 가지고 웨스턴 블랏(western blot)을 이용하여 측정하였다.
도 4에서 보는 바와 같이 iNOS 발현을 억제하였고, 도 5에서는 LPS에 의한 대식세포의 NO 생성을 억제를 확인하였으며, 도 6에서 TNF-α의 발현억제 효과를 볼 수 있으므로 우수한 항염증 효과를 확인하였다.
실시예 8 : 독성시험
참조예 3에서 제조된 낙석등과 녹제초의 혼합 추출물 1 g에 대한 반복 투여 독성을 측정하기 위하여, 16시간 절식시킨 4 ~ 5주령 ICR 마우스(군당 5마리)를 실험 대상 동물로 선정하여 실험하였다. 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)에 녹인 상기 혼합 추출물 1 g을 5일간 경구로 반복 투여한 결과, 폐사 개체가 없었으며, 장기 손상 등의 이상 소견을 보이지 않았다.
제조예 1 : 정제의 제조
본 발명의 혼합 생약 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.
[조성]
낙석등과 녹제초의 혼합 생약 추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 유당 101 mg, 포비돈 12 mg, 무수에탄올 적량.
제조예 2 : 연고제의 제조
본 발명의 혼합 생약 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.
[조성]
낙석등과 녹제초의 혼합 생약 추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알코올 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량.
제조예 3 : 주사제의 제조
본 발명의 혼합 생약 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.
[조성]
낙석등과 녹제초의 혼합 생약 추출물 100mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 정제수 2974 mg
제조예 4 : 경피제의 제조
본 발명의 혼합 생약 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경피제를 제조하였다.
[조성]
낙석등과 녹제초의 혼합 생약 추출물 0.4 g, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화알루미늄 0.004 g, 메틸파라벤 0.2 g, 아크릴계 점착용액 14 ml.