CN111116720B

CN111116720B - 一种猪瘟病毒重组e2蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111116720B
Application number: CN202010112369.7A
Authority: CN
Inventors: 李玲; 张彤; 张欣; 李静; 张艳宾; 肖进; 齐鹏; 刘新月; 张蕾; 董春娜; 宋芳; 张国栋
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-02-24
Also published as: CN111116720A

Abstract

本发明公开了一种杆状病毒表达猪瘟E2重组亚单位疫苗的制备方法与应用。所述猪瘟E2重组亚单位疫苗包含猪瘟病毒重组E2蛋白以及药学上可接受的佐剂。所述猪瘟病毒重组E2蛋白，其氨基酸序列为自序列表中序列3的氨基端第1‑339位所示的氨基酸序列、序列表中序列3所示的氨基酸序列、自序列表中序列4的氨基端第1‑339位所示的氨基酸序列、或者序列表中序列4所示的氨基酸序列。本发明提供的猪瘟E2重组亚单位疫苗免疫猪后可诱导产生特异性抗体，具有免疫原性强、安全性好且与当前流行毒株相匹配的优点；同时能够通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，可用于猪瘟病毒的净化。

Description

一种猪瘟病毒重组E2蛋白及其应用

技术领域

发明涉及一种猪瘟病毒重组E2蛋白及其应用；具体涉及一种猪瘟病毒重组E2蛋白以及杆状病毒表达猪瘟病毒重组E2蛋白制备重组亚单位疫苗的方法与应用。本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSF Virus,CSFV)感染家猪和野猪引起的高度接触致死性疾病。猪瘟的暴发通常导致巨大的经济损失，被OIE列为A类传染病，是目前危害我国养猪业的主要疫病之一。

CSFV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。CSFV基因组长约12.3kb，编码一个大约3898个氨基酸的开放阅读框，在宿主细胞信号肽和病毒蛋白酶的作用下加工成为12种成熟的蛋白，包括四个结构蛋白(Core、E^rns、E1和E2)和八个非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中，结构蛋白E2是病毒主要的保护性抗原，诱导机体产生中和抗体并且能够抵抗致死CSFV强毒株的攻击，也是猪瘟基因工程疫苗研发的重要靶蛋白。

近年来，我国猪瘟流行持续下降，呈零星散发状态，其中母猪持续性带毒是主要传染源。从基因亚型来看，我们国家在2000年左右主要流行基因亚型为2.1、2.2、2.3和1.1型，2.2和2.3亚型逐步减少；2017年主要为2.1和1.1基因亚型，占比分别为97％和3％。

我国对猪瘟防控非常重视，对猪场蓝耳病和猪瘟的净化有明确要求。免疫接种是预防和控制该病发生和流行的主要措施，猪瘟疫苗质量的好坏直接影响猪瘟的免疫效果。传统的猪瘟兔化弱毒活疫苗包括脾淋苗、原代细胞苗和ST传代细胞苗，该类疫苗均无法对疫苗免疫和野毒感染动物进行区别，不能满足猪瘟净化的需求。在目前猪瘟流行率低、全覆盖疫苗免疫以及政府和市场对能够提供DIVA鉴别的疫苗需求背景下，匹配当前流行毒株的亚单位疫苗的研发对未来猪瘟的净化具有积极意义。

发明内容

本发明的目的在于所研制的猪瘟E2重组亚单位疫苗，不但具有与猪瘟兔化弱毒C株疫苗相当的免疫效力，同时本疫苗免疫动物只产生针对E2蛋白的抗体，可通过E^rns抗体诊断试剂盒进行DIVA区别，而且其对应基因型与当前国内的流行毒株匹配度较高，避免由于流行毒株进化趋势逐渐偏离弱毒疫苗株而产生的基因差异所带来的影响，为将来猪瘟的净化提供保障。

基于此，本发明的目的是提供一种猪瘟病毒E2亚单位疫苗及其制备方法与应用。

所述猪瘟病毒E2亚单位疫苗包括猪瘟病毒重组E2蛋白与药学可接受的佐剂，如ISA 201VG佐剂。

本发明提供一种猪瘟病毒重组E2蛋白，为CSFV 1.1型或者2.1d型E2蛋白截短体(tE2)，具体的，其氨基酸序列为自序列表中序列3的氨基端第1-339位所示的氨基酸序列、序列表中序列3所示的氨基酸序列(羧基端连接His标签)、自序列表中序列4的氨基端第1-339位所示的氨基酸序列、或者序列表中序列4所示的氨基酸序列(羧基端连接His标签)。

本发明还提供猪瘟病毒重组E2基因，是上述猪瘟病毒重组E2蛋白的编码基因，具体的，所述猪瘟病毒重组E2基因为为自序列表中序列1的5’端第1-1017位核苷酸序列、序列表中序列1所示的核苷酸、自序列表中序列2的5’端第1-1017位核苷酸序列、或序列表中序列2所示的核苷酸。

所述的猪瘟病毒E2蛋白的截短体(tE2)，CSFV 1.1型tE2氨基酸序列为自序列表中序列3的氨基端第1-339位所示的氨基酸序列，编码序列为自序列1的5′端第1-1017位核苷酸，携带His标签的CSFV 1.1型tE2氨基酸序列如序列3所示，编码序列为序列1。CSFV 2.1d型tE2的氨基酸序列为自序列表中序列4的氨基端第1-339位所示的氨基酸序列，编码序列为自序列1的5′端第1-1017位核苷酸，携带His标签的CSFV 2.1d型tE2氨基酸序列如序列4所示，其核苷酸序列如序列2所示。gp67信号肽核苷酸序列如序列5所示，gp67信号肽氨基酸序列如序列6所示。

本发明的又一个目的是提供表达所述的猪瘟病毒重组E2蛋白的重组表达载体，是将所述的gp67信号肽的编码基因和猪瘟病毒重组E2基因克隆到穿梭载体pFastBac1中获得的表达携带gp67信号肽的猪瘟病毒重组E2蛋白的重组表达载体；其中，gp67信号肽核苷酸序列如序列5所示，gp67信号肽氨基酸序列如序列6所示。

本发明的再一个目的是提供一种表达所述的猪瘟病毒重组E2蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒是将权利要求3所述重组表达载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选阳性表达重组菌，将获得的重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，拯救重组杆状病毒，获得的表达所述猪瘟病毒重组E2蛋白的重组杆状病毒。

本发明还提供一种猪瘟病毒E2亚单位疫苗的制备方法，本发明的目的是这样实现的：根据密码子偏好性将人工合成的信号肽和编码CSFV 1.1型或者2.1d型E2蛋白截短体(tE2)基因克隆到商品化杆状病毒表达载体pFastBac1，得到重组穿梭质粒pFastBac1-1.1tE2或者pFastBac1-2.1dtE2。然后将以上重组穿梭质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性菌落，重组Bacmid-1.1tE2或者Bacmid-2.1dtE2。将该重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，得到表达CSFV 1.1型或者2.1d型tE2蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染处于对数期的昆虫细胞High Five进行扩大培养，纯化得到tE2蛋白。tE2与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪瘟E2重组亚单位疫苗。

进一步地，该方法包括下述步骤：

(1)将上述获得的重组杆状病毒感染处于对数期的昆虫细胞High Five进行扩大培养，纯化获取猪瘟病毒重组E2蛋白。

(2)将步骤(1)获得的重组E2蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪瘟E2重组亚单位疫苗。

具体操作步骤如下所述：

1、表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒的构建

(1)E2基因的获取：将NCBI公布的猪瘟病毒E2基因序列进行比对，针对目前的流行毒株和疫苗株信息筛选出1.1和2.1d型的基因信息；然后，根据昆虫密码子偏好性，分别人工合成1.1tE2(序列表中序列1)和2.1dtE2(序列表中序列2)基因，序列包含去除了E2基因跨膜区域的截短tE2和标签6×His。

(2)重组穿梭质粒的构建：将人工合成的gp67信号肽序列***杆状病毒穿梭载体pFastBac1，得到重组质粒pFastBac1-gp67；然后，将基因1.1tE2和2.1dtE2分别***重组质粒pFastBac1-gp67，构建得到重组穿梭质粒pFastBac1-1.1tE2和pFastBac1-2.1dtE2。

(3)重组Bacmid的提取：分别将重组穿梭质粒pFastBac1-1.1tE2和pFastBac1-2.1dtE2转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，发生Tn7转座，通过至少三次蓝白斑筛选，获得重组Bacmid-1.1tE2和Bacmid-2.1dtE2。

(4)重组杆状病毒的拯救：分别将重组Bacmid-1.1tE2和Bacmid-2.1dtE2 DNA5μg转染1×10⁶贴壁昆虫细胞Sf9，72小时收获培养上清，得到P1代重组杆状病毒2ml。

(5)重组杆状病毒的扩增：分别将两个P1代重组杆状病毒取1ml感染处于对数期的1×10⁷贴壁昆虫细胞Sf9，在感染后48小时细胞明显变大、变圆，72小时收获病毒液10ml，记为P2代病毒；进一步地，分别将两个重组病毒以体积比1：100感染处于对数期的悬浮Sf9细胞大量扩增病毒，在感染后72小时收获培养上清，记为P3代病毒。

2、tE2蛋白的表达与纯化

(1)tE2蛋白的表达：将P3重组杆状病毒以体积比1:4感染处于对数期的悬浮昆虫细胞High Five进行扩大培养，即在细胞密度为2×10⁶cell/ml的800ml细胞悬液中接入200ml P3代杆状病毒，在培养48小时后收获培养上清。

(2)tE2蛋白的纯化：首先，将培养上清1000ml用0.22μm的滤膜过滤后用蠕动泵以1ml/min的流速上样到HisTrap HP 5ml镍柱预装柱，上样完毕后在AKTA纯化仪用含20mM咪唑的缓冲液(20mM NaCl,50mM Tris-HCl,pH 8.0)洗去杂蛋白和未结合的蛋白，然后用含300mM咪唑的缓冲液洗下目的蛋白，结合SDS-PAGE电泳结果收集含有目的蛋白的样品用于下一步凝胶过滤层析；然后，将上一步纯化得到的样品在AKTA纯化仪经过GE HiLoadSuperdex 16/600 200pg柱子纯化得到目的蛋白。

3、猪瘟病毒tE2蛋白与ISA 201VG佐剂乳化制成疫苗：将定量猪瘟病毒tE2蛋白与ISA 201VG按体积比1:1混合，制成猪瘟病毒E2亚单位疫苗。

本发明提供的猪瘟E2重组亚单位疫苗免疫猪后可诱导产生特异性抗体，具有免疫原性强、安全性好且与当前流行毒株相匹配的优点；同时能够通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，可用于猪瘟病毒的净化。

附图说明

图1是表达猪瘟病毒重组E2蛋白(tE2)的重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9的细胞病变图，Sf9为未感染病毒的细胞阴性对照。

图2为猪瘟病毒重组E2蛋白(tE2)重组杆状病毒免疫学鉴定Western blot结果图，(A)图是anti-His单抗的鉴定结果图，(B)图是猪瘟病毒特异性anti-E2单抗的鉴定结果图。

图3是亲和层析纯化的猪瘟病毒重组E2蛋白(tE2)SDS-PAGE电泳结果图，泳道2和3是tE2蛋白单体形式，相同核苷酸大小的1.1和2.1d型猪瘟病毒重组E2蛋白(tE2蛋白)在SDS-PAGE图上的大小略有差异，是由构建的猪瘟病毒E2重组杆状病毒***表达的蛋白在糖基化修饰位置不同引起的；泳道4和5是二聚体形式的tE2(上样缓冲液中不加DTT)，证明了构建的猪瘟病毒E2重组杆状病毒***表达的蛋白能够正确折叠形成二聚体结构。糖基化和二聚体形成保证了亚单位疫苗的免疫原性。

图4是猪瘟1.1型猪瘟病毒重组E2蛋白(1.1tE2)或2.1d型猪瘟病毒重组E2蛋白(2.1dtE2)亚单位疫苗分别免疫仔猪后的抗体产生水平结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行进一步的说明。需要本领域普通技术人员理解的是，本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行修改和变更，但都落入本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的实验材料和实验试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的质粒pFastBac1^TM、大肠杆菌DH10Bac购自美国Invitrogen公司；转染试剂Lipofectamine 3000购自ThermoFisher；昆虫细胞Spodoptera frugiperdaSf9和High Five^TM购自美国菌种中心ATCC；HisTrap HP 5ml镍柱预装柱和HiLoad Superdex16/600 200pg凝胶过滤柱购自GE。

实施例1：表达猪瘟病毒重组E2蛋白(tE2)的重组杆状病毒的拯救和扩增

1、将人工合成的杆状病毒gp67信号肽序列(序列表中序列5)通过BamHⅠ和PstⅠ酶切位点装入载体pFastBac1^TM，得到重组质粒pFastBac1-gp67；

将NCBI公布的猪瘟病毒E2基因序列进行比对，针对目前的流行毒株和疫苗株信息筛选出1.1和2.1d型的基因信息；然后，根据昆虫密码子偏好性，分别人工合成1.1tE2(序列表中序列1)和2.1dtE2(序列表中序列2)基因，序列包含去除了E2基因跨膜区域的截短tE2和标签6×His。1.1tE2和2.1dtE2分别均通过PstⅠ和XhoⅠ酶切位点装入重组载体pFastBac1-gp67，构建得到重组穿梭质粒pFastBac1-1.1tE2和pFastBac1-2.1dtE2。这一步是由基因合成公司按照要求直接合成构建得到。

2、蓝白斑筛选

(1)转化：取穿梭载体pFastBac1-1.1tE2和pFastBac1-2.1dtE2各1μl(约100ng)分别加入50μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，轻轻弹击几下Ep管以使质粒和感受态细胞混匀，将Ep管置于冰上冰浴30分钟；接着在42度水浴热激90秒后立即放在冰上冷却1～2分钟；加入800μl无抗LB培养基，37度以220rpm的速度培养4小时。

(2)蓝白斑筛选：取以上菌液50μl涂布含有50μg/ml卡纳霉素、7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素(KTG三抗)，以及100μg/ml的Bluo-gal、40μg/ml IPTG的LB平板，将平板置于37度培养箱培养48小时后，挑取白斑于500μl KTG三抗LB培养基，37度、220rpm培养过夜；用接种环取1环该菌液，在含有KTG三抗和Bluo-gal、IPTG的LB平板上划线，将平板置于37度培养箱培养48小时；如此步骤，重复至少3次，得到重组大肠杆菌阳性菌。

3、重组Bacmid的获取

(1)取重组大肠杆菌阳性菌液50μl接种5ml KTG三抗LB培养基，在37度、220rpm摇菌培养过夜(16小时)；

(2)将菌液移至1.5ml Ep管，12000rpm、1分钟离心，尽量吸除上清；

按照TIANGEN质粒小提试剂盒说明书进行(3)～(5)操作：

(3)向留有菌体的Ep管中加入250μl溶液P1，悬浮菌体；

(4)接着向Ep管中加入250μl溶液P2，轻柔地上下翻转混匀6-8次，使菌体充***解；

(5)加入350μl溶液P3，出现白色絮状沉淀，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10分钟；

(6)用移液器将500μl上清液转移至一新的Ep管，等体积加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀，12000rpm离心5分钟；

(7)取500μl上层液体转移至一新的Ep管，等体积加入氯仿，上下颠倒混匀，12000rpm离心10分钟；

(8)取400μl上层液体转移至一新的Ep管，加入1/10体积的3M乙酸钠，然后加入2.5倍体积的乙醇，上下颠倒混匀，-20度过夜沉淀；

(9)将上一步置于-20度的Ep管取出，4度、12000rpm离心15分钟，然后加入1ml75％乙醇溶液清洗一遍，4度、12000rpm离心5分钟，尽量弃上层液体，室温干燥10分钟；

(10)向Ep管底部加入100μl去离子水，室温防止2分钟后用移液器轻轻吹打均匀，取2μl Bacmid DNA测其浓度。

4、表达猪瘟病毒tE2的重组杆状病毒的拯救

(1)Sf9细胞传代并铺至6孔细胞培养板中，待贴壁单层细胞长至90％左右(约1×10⁶)，PBS清洗细胞两次，然后加入1.8ml无血清Grace培养基；

(2)取两个1.5mL的无菌Ep管，每管加入100μl Grace培养基，向其中一管中加入10μl脂质体Lipofectamine 3000，另一管中加入5μgBacmid DNA和10μl P3000试剂，然后将两支管中的液体混匀并放置5分钟；

(3)将以上混合溶液加入6孔细胞培养板中，轻轻摇晃混匀，于28℃培养箱持续培养72小时后，收获第一代重组杆状病毒2ml，记为P1，避光4度保存。

5、表达猪瘟病毒tE2的重组杆状病毒的鉴定与扩增

(1)向100mm细胞培养皿中处于对数期的1×10⁷贴壁昆虫细胞Sf9加入1ml P1代重组杆状病毒，与未接毒Sf9细胞对照组相比，接入P1代病毒的细胞在感染后48小时明显变大、变圆(图1所示)，72小时收获培养上清10ml，记为P2代病毒；

(2)同时，取步骤(1)培养上清20μl，加入5×蛋白上样缓冲液5μl制备蛋白样品，取10μl蛋白样品SDS-PAGE，分别用anti-His单抗和猪瘟病毒特异性anti-E2单抗Westernblotting鉴定，结果如图2所示，两个单抗都分别能和1.1tE2、2.1dtE2蛋白特异性结合；

(3)Sf9悬浮细胞1升传代至2升的玻璃三角瓶，当细胞长至对数期(密度为2×10⁶/ml)时，以体积比1:100加入P2代病毒，在感染后72小时收获培养上清，记为P3代病毒。

实施例2：tE2重组蛋白的表达和纯化

1、tE2蛋白的表达

昆虫细胞High Five悬浮细胞800ml传代至2升的玻璃三角瓶，当细胞长至对数期(密度为2.5×10⁶/ml)时，以体积比1:4加入P3代病毒200ml进行扩大培养，在培养48小时后5000rpm离心20分钟收获培养上清。

2、tE2蛋白的纯化

(1)将培养上清1000ml用0.22μm的滤膜过滤后用蠕动泵以1ml/min的流速上样到HisTrap HP 5ml镍柱预装柱，上样完毕后在AKTA纯化仪用含20mM咪唑的缓冲液(20mMNaCl,50mM Tris-HCl,pH 8.0)洗去杂蛋白和未结合的蛋白，然后用含300mM咪唑的缓冲液洗下目的蛋白，各收集每一阶段的蛋白样品20μl，加入5μl 5×loadingbuffer，沸水浴10分钟后置于冰上；

(2)取10μl蛋白样品SDS-PAGE电泳，结合SDS-PAGE电泳结果收集含有目的蛋白的样品用于下一步凝胶过滤层析；

(3)将上一步纯化得到的样品在AKTA纯化仪经过GE HiLoad Superdex 16/600200pg柱子纯化得到目的蛋白，取10μl蛋白样品SDS-PAGE电泳进行鉴定(图3所示)，然后用10kD超滤管对目的蛋白进行浓缩。

(4)BCA法测定蛋白浓度为2mg/ml，体积为20-25ml左右，计算tE2蛋白的表达量可高达50mg/L。

实施例3：猪瘟E2亚单位疫苗的制备

取5ml ISA 201VG佐剂加入到已放有转子的20ml烧杯中，开启磁力搅拌器，调节至6挡，另取水相5ml(含有tE2蛋白1.1tE2或2.1dtE2)倒入烧杯中，使蛋白终浓度为40μg/2ml，倒入时间约5秒钟，待旋涡稳定后，乳化5min，关闭磁力搅拌器，将疫苗装至20ml瓶中，压盖、贴签；4度保存备用。

实施例4：猪瘟E2亚单位疫苗在仔猪的免疫试验

筛选猪瘟病毒抗体阴性的30日龄长白猪20头进行抗体水平评价试验，随机分成4组，5头/组。其中2组分别颈部肌肉免疫2ml 1.1tE2和2.1dtE2亚单位疫苗，初免21天后加强免疫一次；1组免疫商品化猪瘟活疫苗(传代细胞源)，1头份/头的剂量免疫一次；1组作为阴性对照，免疫2ml PBS。免疫后每周采集血清一次，用IDEXX阻断ELISA方法检测猪瘟病毒E2抗体效价。

表1.免疫仔猪后的阻断ELISA结果

从表1和图4结果可以看出，1.1tE2和2.1dtE2亚单位疫苗在一免后14天阻断率均显著高于某商品化猪瘟活疫苗(传代细胞源)，在一免21天时抗体阻断率大于70％，在理论上已经足以保护猪群免受猪瘟病毒的感染；在二免后7天和14天阻断率升高至90％以上，也明显比商品化猪瘟活疫苗的高；此外，2.1dtE2免疫组在免疫后14、21、28和35天阻断率均高于1.1tE2免疫组。这组数据说明我们的1.1tE2和2.1dtE2亚单位疫苗可用作猪瘟候选标记疫苗，尤其对当前国内流行的2.1型猪瘟病毒感染具有积极意义。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120>一种猪瘟病毒重组E2蛋白及其应用

<130> WHOI201006

<170> Patent-In 3.5

<160> 6

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtttggctt gcaaggagga ctacagatac gccatcagca gcaccaacga gatcggattg 60

ttgggcgccg gcggattgac caccacctgg aaggagtact cccacgactt gcagttgaac 120

gacggaaccg tcaaggctat ctgcgtcgcc ggttcattca aggtgaccgc tctgaacgtc 180

gtgtcccgta gatacctggc ctccttgcac aagggagctt tgctgacctc cgtgaccttc 240

gagcttttgt tcgacggtac aaaccctagc accgaggaga tgggcgacga cttcggtttc 300

ggcctctgcc cattcgacac ctccccagtc gtcaagggaa agtacaacac caccctgttg 360

aacggtagcg ctttctacct cgtctgccct atcggatgga ccggagtcat cgagtgcacc 420

gctgtgtccc caaccaccct cagaaccgag gtcgtgaaga ccttccgtag agagaagcca 480

ttccctcaca gaatggactg cgtgaccacc accgtggaga acgaggactt gttctactgc 540

aagttgggcg gtaactggac ctgcgtcaag ggtgagcctg tggtctacac cggcggccag 600

gtgaagcagt gcaagtggtg cggattcgac ttcaacgagc cagacggttt gcctcactac 660

ccaatcggta agtgcatctt ggctaacgag accggttaca gaatcgtgga cagcaccgac 720

tgcaacaggg acggtgtggt catcagcgct gagggtagcc acgagtgctt gatcggaaac 780

accaccgtca aggtccacgc tagtgacgag aggctcggcc ctatgccatg ccgcccaaag 840

gagatcgtgt ccagcgctgg tcctgtgcgt aagacctcct gcaccttcaa ctacgctaag 900

accctgaaga acaagtacta cgagccccgc gacagctact tccagcagta catgctgaag 960

ggtgagtacc agtactggtt cgacttggac gtgaccgaca ggcactccga ctacttccac 1020

caccaccacc accactaa 1038

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggctcagct gcaaggagga ctacagatac gccatctcca gcaccaacga gatcggccca 60

ttgggtgctg agggattgac caccacctgg cgcgagtaca gccacggtct ccagttggac 120

gacggaaccg tcagagctat ctgcaccgcc ggtagcttca aggtgatcgc tctgaacgtc 180

gtgtcccgta gatacttggc ctccttgcac aagcgcgctt tgcctacctc cgtgaccttc 240

gagttgctgt tcgacggaac ctcccccgct atcgaggaga tgggcgacga cttcggattc 300

ggattgtgcc cattcgacac cacccccgtc gtcaagggta agtacaacac caccctgttg 360

aacggtagcg ctttctactt ggtctgccca atcggatgga ccggtgtcat cgagtgcacc 420

gctgtgtccc caaccaccct cagaaccgag gtcgtgaaga ccttcaagcg tgagaagcca 480

ttccctcaca gagtggactg cgtgaccacc atcgtggaga aggaggactt gttctactgc 540

aagtggggcg gcaactggac ctgcgtgaag ggtaaccctg tgacctacat gggcggccag 600

gtgaagcagt gcaagtggtg cggtttcgac ttcaaggagc ctgacggttt gcctcactac 660

ccaatcggaa agtgcatctt ggctaacgag accggttaca gagtcgtgga cagcaccgac 720

tgcaacaggg acggtgtggt catcagcacc gagggagagc acgagtgctt gatcggaaac 780

accaccgtca aggtccacgc tctggacggc aggctgggtc ctatgccatg ccgccctaag 840

gagatcgtct cctccgccgg cccagtccgt aagacctcct gcaccttcaa ctacaccaag 900

accctgaaga acaagtacta cgagcctaga gacagctact tccagcagta catgttgaag 960

ggcgagtacc agtactggtt cgacttggac gctaccgacc accacaccga ctacttccac 1020

caccaccacc accactaa 1038

<210> 3

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn

1 5 10 15

Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu

20 25 30

Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys

35 40 45

Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu

180 185 190

Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly

195 200 205

Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp

225 230 235 240

Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Ala Glu Gly Ser His Glu Cys

245 250 255

Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu

260 265 270

Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro

275 280 285

Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn

290 295 300

Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser

325 330 335

Asp Tyr Phe His His His His His His

340 345

<210> 4

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn

1 5 10 15

Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Arg Glu

20 25 30

Tyr Ser His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys

35 40 45

Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Ile Val Glu Lys Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Trp Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn

180 185 190

Pro Val Thr Tyr Met Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly

195 200 205

Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val Val Asp Ser Thr Asp

225 230 235 240

Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys

245 250 255

Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Leu Asp Gly Arg Leu

260 265 270

Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro

275 280 285

Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys Asn

290 295 300

Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala Thr Asp His His Thr

325 330 335

Asp Tyr Phe His His His His His His

340 345

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp

35 40

Claims

1.一种猪瘟病毒重组E2蛋白，其氨基酸序列为自序列表中序列3的氨基端第1-339位所示的氨基酸序列或序列表中序列3所示的氨基酸序列。

2.一种猪瘟病毒重组E2基因，为自序列表中序列1的5’端第1-1017位核苷酸序列或序列表中序列1所示的核苷酸。

3.表达权利要求1所述的猪瘟病毒重组E2蛋白的重组表达载体，是将权利要求2所述的猪瘟病毒重组E2基因和gp67信号肽的编码基因克隆到出发载体杆状病毒穿梭载体pFastBac1中，获得携带gp67信号肽的猪瘟病毒E2蛋白重组表达质粒；其中，gp67信号肽核苷酸序列如序列5所示，gp67信号肽氨基酸序列如序列6所示。

4.表达权利要求1所述的猪瘟病毒重组E2蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒是将权利要求3所述重组表达载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选阳性表达重组菌，将获得的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid转染昆虫细胞Sf9，拯救重组杆状病毒，获得的表达所述猪瘟病毒重组E2蛋白的重组杆状病毒。

5.一种猪瘟E2重组亚单位疫苗，包含权利要求1所述的猪瘟病毒重组E2蛋白以及药学上可接受的佐剂。

6.一种猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法，包括下述步骤：

（1）将权利要求4获得的重组杆状病毒感染处于对数期的昆虫细胞High Five进行扩大培养，纯化获取猪瘟病毒重组E2蛋白。

（2）将步骤（1）获得的重组E2蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪瘟E2重组亚单位疫苗。

7.权利要求6所述的方法制备的猪瘟E2重组亚单位疫苗。

8.权利要求1所述的猪瘟病毒重组E2蛋白在制备预防猪瘟的亚单位疫苗中的应用。