CN111925424B

CN111925424B - 日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN111925424B
Application number: CN202010971316.0A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Midi Biotechnology Co ltd; Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN111925424A

Abstract

本发明公开了一种日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗包含重组蛋白以及医药学上可接受的载剂，所述重组蛋白具有SEQ ID NO:2所示序列。本发明提供的所述疫苗安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，并且还可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。

Description

日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

日本乙型脑炎（Japanese Encephalitis，JE）又称为流行性乙型脑炎（简称乙脑），是由日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）引起的一种以蚊虫为媒介的人畜共患自然疫源性传染病。JE可感染多种生物如猪、马、牛、羊、鼠、犬和人等，临床上以高热、意识障碍、惊厥或抽搐、呼吸衰竭、运动及反射障碍等神经症状为特征。该病具有明显的季节性和一定的地域性，多发生于夏秋蚊虫孽生的季节，猪是JEV主要的储存宿主和扩散宿主之一，一般在蚊-猪-蚊三者之间形成循环感染，也可以通过猪-蚊-人途径感染人类。因此预防和控制病毒的传播不仅对养殖业而且对人类健康都具有十分重要的意义。世界动物卫生组（OIE）将JE划归为B类传染病，我国农业部将其列为乙类法定传染病和二类动物疫病。

JEV属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），有囊膜，呈球形，二十面体对称。其基因组为单股正链RNA，全长约11kb，含有一个长的开放阅读框（ORF），编码多聚蛋白。多聚蛋白通过蛋白酶剪切为三个结构蛋白：核衣壳蛋白C蛋白、膜蛋白前体蛋白prM、纤突糖蛋白E蛋白和七个非结构蛋白：NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。E蛋白为病毒主要的结构蛋白，是JEV的重要抗原蛋白，具有与细胞表面受体结合的能力，诱导机体产生中和抗体，与病毒毒力、致病性、膜融合、免疫保护、血凝反应力和血清特异性等密切相关。

乙脑的传播主要以蚊虫叮咬为主，夏秋季蚊虫繁殖快，环境难控制，防蚊灭蚊效果不理想，因此大规模的疫苗接种成为乙脑防控的主要措施。现今广泛使用的JEV疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗两种，但灭活苗在应用的过程中存在副反应多、生产和纯化工艺复杂、生产设施要求高，生产成本高、抗体保持水平不高等缺点；减毒活疫苗中SA14-14-2减毒株从原代仓鼠肾细胞（PHK）经过多次传代多次蚀斑筛选纯化得到，其来源细胞系不被FDA认可，应用范围小，具有返祖风险性，纯化工艺也有待改善。

鉴于此，业界亟需发展出一种安全性高、免疫原性强的JEV基因工程亚单位疫苗。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种重组蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ IDNO:2的全长序列95％以上相同的序列。即，本发明实施例提供的重组蛋白的氨基酸序列可以是原始序列，增加或截短的序列。

本发明实施例还提供了用于编码所述重组蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述的编码基因具有SEQ ID NO:1所示序列或者与SEQ IDNO:1的全长序列95％以上相同的序列。

本发明实施例还提供了一种重组载体，其包含所述重组蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述重组载体包括但不限于pFastBac 1、pVL1393、pFastBacdual等，并优选采用pFastBac 1。

本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其包含所述重组蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述宿主细胞选自昆虫细胞，例如Sf9细胞系，优选的，所述Sf9细胞系包括但不限于Sf9、High Five或 Sf21细胞，更优选为Sf9细胞。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其特征在于包括：所述的重组蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。

在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、MONTANIDE ISA 15 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素之中的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 201 VG。

本发明实施例还提供了一种重组蛋白的制备方法，其包括：

将所述重组蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；

将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；

以所述重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并获得重组杆状病毒；

将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离获得所述重组蛋白。

在一些实施方式中，所述穿梭载体包括但不限于pFastBac 1、pVL1393、pFastBacdual等，优选为pFastBac1。

在一些实施方式中，所述昆虫细胞包括但不限于Sf9、High Five或 Sf21细胞等，优选为Sf9细胞。

本发明实施例还提供了一种日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备重组蛋白，并将所述重组蛋白与医药学上可接受的载剂混合。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备日本乙型脑炎病毒检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对日本乙型脑炎病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受日本乙型脑炎病毒感染的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。

本发明实施例提供了一种日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受日本乙型脑炎病毒感染的试剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对日本乙型脑炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受日本乙型脑炎病毒感染的药剂的用途。

本发明实施例还提供了一种诱导针对日本乙型脑炎病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用所述日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明实施例还提供了一种保护受试动物免受日本乙型脑炎病毒感染的方法，所述方法包括向受试动物施用所述日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明实施例还提供了一种适用于在受试动物中产生针对日本乙型脑炎病毒感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的重组蛋白以及佐剂分子。

如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。例如，所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方式中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。进一步的，所述佐剂可以优选采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。

较之现有技术，本发明实施例通过对日本乙型脑炎病毒E蛋白进行优化，包括删除其序列中的膜融合区域序列，在其序列中使用串联重复表位，以及突变其序列中的若干糖基化位点，从而获得重组蛋白（命名为JEV E蛋白），并显著降低了重组蛋白对细胞的毒性，大幅增强了其免疫原性，很好的增加了其表达量，同时还明显减少了其糖基化水平，降低其对动物的过敏性，而且前述重组蛋白可以采用杆状病毒昆虫细胞表达***，使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本，同时所获产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对动物没有致病性，适于作为日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗广泛应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是实施例1中密码子优化后的E基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图3是实施例1中转移载体pF-JEV-E的结构示意图。

图4是实施例3所获细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱。

图5是实施例4所获SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测结果图。

图6是实施例7所获纯化后重组蛋白的灰度扫描图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例主要是通过对日本乙型脑炎病毒E蛋白进行优化，从而获得了一种重组蛋白（JEV E蛋白），其中采用的优化方式及其作用包括：

去除E蛋白中的膜融合区域序列（VMTVGSRSFLVHREWFHDLALPWT），

在E蛋白中使用串联重复表位，

突变E蛋白中的两个糖基化位点（两个N突变成D）。

通过前述的优化，可以显著减少重组蛋白对细胞的毒性，大幅增加其表达量，同时明显提高其免疫原性，而且还可以有效减少其糖基化水平，降低其对动物的过敏性。

进一步的，前述重组蛋白可以基于杆状病毒昆虫细胞表达***，使用悬浮培养Sf9细胞进行表达，其不仅表达水平较高，而且蛋白免疫原性好。

进一步的，前述重组蛋白可以用于制备日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗。

例如，在本发明实施例的一个具体实施方案中，一种日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法具体可以包括：

（1）制备用于编码所述重组蛋白的核酸分子；

（2）将步骤（1）中制备的编码重组蛋白的核酸分子克隆到穿梭载体中，得到含有目的基因的重组穿梭载体；

（3）将步骤（2）获得的重组穿梭载体转化DH10Bac菌，挑选重组菌，抽提基因组转染Sf9细胞（或前述的其它昆虫细胞），获得重组杆状病毒；

（4）培育所述Sf9细胞（或前述的其它昆虫细胞）进而重组表达产生重组蛋白；

（5）将所述重组蛋白混合加入到佐剂中，得到所述疫苗。

本发明实施例的该具体实施方案中，使用Sf9细胞表达重组蛋白（JEV E蛋白），产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

本发明实施例提供的日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，对动物没有致病性，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，且还具有可以大规模批量生产、质控容易、批次间稳定、生产成本低等一系列优点。

本发明实施例提供的日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗在应用时，只需将有效量接种于猪、马、牛、羊、鼠、犬和人等动物。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 转移载体pF-JEV-E构建与鉴定

1．E基因扩增与纯化在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的E基因（定义为JEV-E基因，SEQ ID NO:1）并克隆到pUC17载体上，得到pUC-JEV-E质粒载体。以pUC-E质粒作为模板，JEV-E-F、JEV-E-R作为上下游引物进行PCR扩增（JEV-E-F、JEV-E-R的基因序列如SEQ ID NO:3、4所示），扩增体系见表1。

表1 JEV-E基因扩增体系

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在1.6kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2．酶切与纯化将pFastBac 1质粒和JEV-E基因PCR扩增产物使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac 1质粒以及E基因片段。

表2 JEV-E基因酶切反应体系

表3 pFastBac 1质粒酶切反应体系

3．连接将酶切过的pFastBac 1质粒和JEV-E基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 JEV-E基因酶切产物与pFastBac 1质粒连接体系

4．转化取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0 mL菌液离心浓缩成100 μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5．菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，JEV-E-F和JEV-E-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-JEV-E其示意图如图3。

实施例2 重组杆状病毒基因组Bac-JEV-E构建

1．DH10Bac菌转化取实施例1中1μl pF-JEV-E质粒加入100μl的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100 μl菌液稀释81倍后，取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。

2．挑选单克隆使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。获得重组质粒Bacmid-JEV-E。

实施例3重组杆状病毒转染

六孔板中每个孔接种0.8×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50~70%。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基T1稀释4μl的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；用100μl转染培养T1基稀释3μg实施例2中的重组Bacmid-JEV-E质粒，将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mLSF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。获得重组杆状病毒rBac-JEV-E，对收获的P1代重组杆状病毒使用Reed-Muench法检测病毒滴度，rBac-JEV-E种毒病毒滴度为7.5×10⁷ TCID₅₀ /mL。扩增重组杆状病毒rBac-JEV-E作为种毒备用。

另外按照上面的实施例方法构建表达如下对照组的重组杆状病毒（表5）。

表5

实施例4 SDS-PAGE检测

将实施例3中收获的rBac-JEV-E和各对照组的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

如图4所示，rBac-JEV-E细胞培养物在分子量约58kDa处出现目的条带，且蛋白表达量较各对照组都更高，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例5 Western Blot检测

将实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗JEV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图5所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例6昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养

在1000mL摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到3-55×10⁶cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-55×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-85×10⁶cell/mL时，接种rBac-JEV-E，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50%、搅拌速度100-180 rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48 h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存JEV-E蛋白原液。同时以同样的方法制备表达实施例3中对照组1-4的蛋白原液。

实施例7蛋白纯化

1．将收获的原液使用阳离子交换层析法进行纯化

使用强阳离子层析填料POROS 50HS进行离子交换层析，填料使用前使用0.5MNaOH进行消毒。然后用微滤缓冲液在室温平衡，然后将疫苗原液以125 mL/min的速率上柱，然后用漂洗buffer A（0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，0.5M NaCl）洗脱8个柱体积。然后以buffer A和buffer B进行线性梯度洗脱，从0% buffer B（即100% buffer A）到100%buffer B(0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.5M NaCl)（即0% buffer A），其中线性洗脱一共洗脱了10个柱体积，然后平均分别收获这10个柱体积的洗脱物。线性洗脱完后，再用bufferB洗脱2个柱体积，并分别收集。将收集的样品放在2 L的无菌的塑料瓶中放置在4℃。然后将最后一个洗脱峰（A280）下收集的组份无菌过滤储存在4℃。

2．羟基磷灰石疏水层析

使用预装羟基磷灰石柱（CHT™ Ceramic Hydroxyapatite Type II Media），首先使用50 mM MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.25M NaCl进行平衡，然后将上面初步纯化的样品以90cm/hour进行上样，上完样后使用8体积的平衡液进行洗脱直至UV值为零。然后使用洗脱液（0.2 M 磷酸盐，pH=7.0，1.25 M NaCl）进行梯度洗脱，洗脱液浓度从0%到100%，速度仍然是90 cm/h，洗脱体积是4个柱体积。纯化得到目的蛋白，即JEV-E蛋白。

将纯化的目的蛋白使用BCA总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，纯化后的蛋白如图6所示，目的蛋白浓度为1.2mg/mL，纯度为92%。

实施例8琼扩检测

使用琼扩方法检测表达的JEV-E蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入JEV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72 h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：JEV-E蛋白琼扩效价为1：256。

实施例9 疫苗制备

将实施例7中收获的重组JEV-E蛋白原液稀释后加入到MONTANIDE ISA 201 VG佐剂中（体积比为46:54），使得最终蛋白浓度为100µg/ml，乳化，质检合格后置于4℃保存。以同样的方法将对照组1、对照组2、对照组3和对照组4分别制备成疫苗。

实施例10 免疫实验

试验一：抗体检测

取4~6周龄Balb/c小鼠30只，随机分为6组，前五组分别腹腔注射本发明疫苗免疫组以及对照组1、对照组2、对照组3、对照组4疫苗各0.2ml，第六组设为阴性对照组，腹腔注射生理盐水0.2ml，在首次免疫4周后加强免疫一次。免疫前、一免后4周和一免后8周（二免后4周）分别采血，分离血清，用ELISA法检测各组的抗体水平，结果如表6所示。

表6

试验二：安全性试验

取4~6周龄Balb/c小鼠10只，随机分为2组，分别肌肉注射实施例9中免疫组以及对照组1疫苗各2ml，连续观察一周后分别脱颈椎处死，解剖并观察疫苗注射部位情况。观察期内免疫组小鼠生活正常，无发热现象，对照组1小鼠部分出现发热、厌食、腹泻、无力等症状；免疫组小鼠注射疫苗部位组织正常，对照组1小鼠疫苗注射部位基本均出现红肿、硬块等炎症反应。

试验三：

将试验一中二免7天后的小鼠每组处死3只，取脾细胞用于细胞因子试验。具体操作如下：用制备好的各组小鼠脾细胞悬液铺板，每孔100μl接种至96孔细胞培养板，同时加入终浓度为10μl/ml的rMEP进行刺激，37℃培养72h后收集上清，用细胞因子检测试剂盒来检测上清中的Th1细胞因子（IFN-γ）Th2细胞因子（IL-4）和Th2细胞因子（IL-4）含量。结果显示，免疫组的小鼠IFN-γ与IL-4显著的高于其他对照组，说明免疫组疫苗可诱导产生较高水平的Th1和Th2类型细胞因子，对小鼠发挥重要的抗病毒免疫作用。结果如表7所示。

表7

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司、苏州米迪生物技术有限公司

<120> 日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

<130> 20200903

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgaaatttc tggtgaacgt ggcgctggtg tttatggtgg tgtatattag ctatatttat 60

gcggatcgct ttaactgcct gggcatgggc aaccgcgatt ttattgaagg cgcgagcggc 120

gcgacctggg tggatctggt gctggaaggc gatagctgcc tgaccattat ggcgaacgat 180

aaaccgaccc tggatgtgcg catgaccaac attgaagcga gccagctggc ggaagtgcgc 240

agctattgct atcatgcgag cgtgaccgat attagcaccg tggcgcgctg cccgatgacc 300

ggcgaagcgc ataacgaaaa acgcgcggat agcagctatg tgtgcaaaca gggctttacc 360

gatcgcggct ggggcaacgg ctgcggcctg tttggcaaag gcagcattga tacctgcgcg 420

aaatttagct gcaccagcaa agcgattggc cgcgcgattc agccggaaaa cattaaatat 480

gaagtgggca tttttgtgca tggcaccacc accagcgaaa accatggcaa ctatagcgcg 540

caggtgggcg cgagccaggc ggcgaaattt accgtgaccc cggatgcgcc gagcattacc 600

ctgaaactgg gcgattatgg cgaagtgacc ctggattgcg aaccgcgcag cggcctgaac 660

accgaagcgt tttatccgcc gagcagcacc gcgtggcgcg atcgcgaact gctgatggaa 720

tttgaagaag cgcatgcgac caaacagagc gtggtggcgc tgggcagcca ggaaggcggc 780

ctgcatcagg cgctggcggg cgcgattgtg gtggaatata gcagcagcgt gaaactgacc 840

agcggccatc tgaaatgccg cctgaaaatg gataaactgg cgctgaaagg caccacctat 900

ggcatgtgca ccggcaaatt tagctttgcg aaaaacccgg cggataccgg ccatggcacc 960

gtggtgattg aactgagcta tagcggcagc gatggcccgt gcaaaattcc gattgtgagc 1020

gtggcgagcc tgaacgatat gaccccggcg ggccgcctgg tgaccgtgaa cccgtttgtg 1080

gcgaccagca gcgcgaacag caaagtgctg gtggaaatgg aaccgccgtt tggcgatagc 1140

tatattgtgg tgggccgcga agataaacag attaaccatc attggcataa agcgggcagc 1200

accctgggca aagcgtttct gaccaccctg aaaggcgcgc agcgcctggc ggcgctgggc 1260

gatatgtgca ccggcaaatt tagctttgcg aaaaacccgg cggataccgg ccatggcacc 1320

gtggtgattg aactgagcta tagcggcagc gatggcccgt gcaaaattcc gattgtgagc 1380

gtggcgagcc tgaacgatat gaccccggcg ggccgcctgg tgaccgtgaa cccgtttgtg 1440

gcgaccagca gcgcgaacag caaagtgctg gtggaaatgg aaccgccgtt tggcgatagc 1500

tatattgtgg tgggccgcga agataaacag attaaccatc attggcataa agcgggcagc 1560

accctgggca aagcgtttct gaccaccctg aaaggcgcgc agcgcctggc ggcgctgggc 1620

gattga 1626

<210> 2

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala Asp Arg Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg

20 25 30

Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu

35 40 45

Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu

50 55 60

Asp Val Arg Met Thr Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg

65 70 75 80

Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg

85 90 95

Cys Pro Met Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser

100 105 110

Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys

115 120 125

Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys

130 135 140

Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Ala Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr

145 150 155 160

Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly

165 170 175

Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val

180 185 190

Thr Pro Asp Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu

195 200 205

Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe

210 215 220

Tyr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asp Arg Glu Leu Leu Met Glu

225 230 235 240

Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser

245 250 255

Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu

260 265 270

Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu

275 280 285

Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr

290 295 300

Gly Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr

305 310 315 320

Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile

325 330 335

Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Ala Gly Arg

340 345 350

Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys

355 360 365

Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val

370 375 380

Gly Arg Glu Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser

385 390 395 400

Thr Leu Gly Lys Ala Phe Leu Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu

405 410 415

Ala Ala Leu Gly Asp Met Cys Thr Gly Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn

420 425 430

Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser

435 440 445

Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu

450 455 460

Asn Asp Met Thr Pro Ala Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val

465 470 475 480

Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro

485 490 495

Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Glu Asp Lys Gln Ile Asn

500 505 510

His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Leu Thr

515 520 525

Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp

530 535 540

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

ataggatcca tgaaatttct ggtgaacgtg gcgctgg 37

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ataaagcttt caatcgccca gcgccgccag gcgctgcgcg cc 42

<210> 5

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atgaaatttc tggtgaacgt ggcgctggtg tttatggtgg tgtatattag ctatatttat 60

gcggatcgct ttaactgcct gggcatgggc aaccgcgatt ttattgaagg cgcgagcggc 120

gcgacctggg tggatctggt gctggaaggc gatagctgcc tgaccattat ggcgaacgat 180

aaaccgaccc tggatgtgcg catgaccaac attgaagcga gccagctggc ggaagtgcgc 240

agctattgct atcatgcgag cgtgaccgat attagcaccg tggcgcgctg cccgatgacc 300

ggcgaagcgc ataacgaaaa acgcgcggat agcagctatg tgtgcaaaca gggctttacc 360

gatcgcggct ggggcaacgg ctgcggcctg tttggcaaag gcagcattga tacctgcgcg 420

aaatttagct gcaccagcaa agcgattggc cgcgcgattc agccggaaaa cattaaatat 480

gaagtgggca tttttgtgca tggcaccacc accagcgaaa accatggcaa ctatagcgcg 540

caggtgggcg cgagccaggc ggcgaaattt accgtgaccc cgaacgcgcc gagcattacc 600

ctgaaactgg gcgattatgg cgaagtgacc ctggattgcg aaccgcgcag cggcctgaac 660

accgaagcgt tttatccgcc gagcagcacc gcgtggcgca accgcgaact gctgatggaa 720

tttgaagaag cgcatgcgac caaacagagc gtggtggcgc tgggcagcca ggaaggcggc 780

ctgcatcagg cgctggcggg cgcgattgtg gtggaatata gcagcagcgt gaaactgacc 840

agcggccatc tgaaatgccg cctgaaaatg gataaactgg cgctgaaagg caccacctat 900

ggcatgtgca ccggcaaatt tagctttgcg aaaaacccgg cggataccgg ccatggcacc 960

gtggtgattg aactgagcta tagcggcagc gatggcccgt gcaaaattcc gattgtgagc 1020

gtggcgagcc tgaacgatat gaccccggcg ggccgcctgg tgaccgtgaa cccgtttgtg 1080

gcgaccagca gcgcgaacag caaagtgctg gtggaaatgg aaccgccgtt tggcgatagc 1140

tatattgtgg tgggccgcga agataaacag attaaccatc attggcataa agcgggcagc 1200

accctgggca aagcgtttct gaccaccctg aaaggcgcgc agcgcctggc ggcgctgggc 1260

gatatgtgca ccggcaaatt tagctttgcg aaaaacccgg cggataccgg ccatggcacc 1320

gtggtgattg aactgagcta tagcggcagc gatggcccgt gcaaaattcc gattgtgagc 1380

gtggcgagcc tgaacgatat gaccccggcg ggccgcctgg tgaccgtgaa cccgtttgtg 1440

gcgaccagca gcgcgaacag caaagtgctg gtggaaatgg aaccgccgtt tggcgatagc 1500

tatattgtgg tgggccgcga agataaacag attaaccatc attggcataa agcgggcagc 1560

accctgggca aagcgtttct gaccaccctg aaaggcgcgc agcgcctggc ggcgctgggc 1620

gattga 1626

<210> 6

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

atgaaatttc tggtgaacgt ggcgctggtg tttatggtgg tgtatattag ctatatttat 60

gcggatcgct ttaactgcct gggcatgggc aaccgcgatt ttattgaagg cgcgagcggc 120

gcgacctggg tggatctggt gctggaaggc gatagctgcc tgaccattat ggcgaacgat 180

aaaccgaccc tggatgtgcg catgaccaac attgaagcga gccagctggc ggaagtgcgc 240

agctattgct atcatgcgag cgtgaccgat attagcaccg tggcgcgctg cccgatgacc 300

ggcgaagcgc ataacgaaaa acgcgcggat agcagctatg tgtgcaaaca gggctttacc 360

gatcgcggct ggggcaacgg ctgcggcctg tttggcaaag gcagcattga tacctgcgcg 420

aaatttagct gcaccagcaa agcgattggc cgcgcgattc agccggaaaa cattaaatat 480

gaagtgggca tttttgtgca tggcaccacc accagcgaaa accatggcaa ctatagcgcg 540

caggtgggcg cgagccaggc ggcgaaattt accgtgaccc cggatgcgcc gagcattacc 600

ctgaaactgg gcgattatgg cgaagtgacc ctggattgcg aaccgcgcag cggcctgaac 660

accgaagcgt tttatccgcc gagcagcacc gcgtggcgcg atcgcgaact gctgatggaa 720

tttgaagaag cgcatgcgac caaacagagc gtggtggcgc tgggcagcca ggaaggcggc 780

ctgcatcagg cgctggcggg cgcgattgtg gtggaatata gcagcagcgt gaaactgacc 840

agcggccatc tgaaatgccg cctgaaaatg gataaactgg cgctgaaagg caccacctat 900

ggcatgtgca ccggcaaatt tagctttgcg aaaaacccgg cggataccgg ccatggcacc 960

gtggtgattg aactgagcta tagcggcagc gatggcccgt gcaaaattcc gattgtgagc 1020

gtggcgagcc tgaacgatat gaccccggcg ggccgcctgg tgaccgtgaa cccgtttgtg 1080

gcgaccagca gcgcgaacag caaagtgctg gtggaaatgg aaccgccgtt tggcgatagc 1140

tatattgtgg tgggccgcga agataaacag attaaccatc attggcataa agcgggcagc 1200

accctgggca aagcgtttct gaccaccctg aaaggcgcgc agcgcctggc ggcgctgggc 1260

tga 1263

<210> 7

<211> 1698

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

atgaaatttc tggtgaacgt ggcgctggtg tttatggtgg tgtatattag ctatatttat 60

gcggatcgct ttaactgcct gggcatgggc aaccgcgatt ttattgaagg cgcgagcggc 120

gcgacctggg tggatctggt gctggaaggc gatagctgcc tgaccattat ggcgaacgat 180

aaaccgaccc tggatgtgcg catgaccaac attgaagcga gccagctggc ggaagtgcgc 240

agctattgct atcatgcgag cgtgaccgat attagcaccg tggcgcgctg cccgatgacc 300

ggcgaagcgc ataacgaaaa acgcgcggat agcagctatg tgtgcaaaca gggctttacc 360

gatcgcggct ggggcaacgg ctgcggcctg tttggcaaag gcagcattga tacctgcgcg 420

aaatttagct gcaccagcaa agcgattggc cgcgcgattc agccggaaaa cattaaatat 480

gaagtgggca tttttgtgca tggcaccacc accagcgaaa accatggcaa ctatagcgcg 540

caggtgggcg cgagccaggc ggcgaaattt accgtgaccc cggatgcgcc gagcattacc 600

ctgaaactgg gcgattatgg cgaagtgacc ctggattgcg aaccgcgcag cggcctgaac 660

accgaagcgt tttatgtgat gaccgtgggc agccgcagct ttctggtgca tcgcgaatgg 720

tttcatgatc tggcgctgcc gtggaccccg ccgagcagca ccgcgtggcg cgatcgcgaa 780

ctgctgatgg aatttgaaga agcgcatgcg accaaacaga gcgtggtggc gctgggcagc 840

caggaaggcg gcctgcatca ggcgctggcg ggcgcgattg tggtggaata tagcagcagc 900

gtgaaactga ccagcggcca tctgaaatgc cgcctgaaaa tggataaact ggcgctgaaa 960

ggcaccacct atggcatgtg caccggcaaa tttagctttg cgaaaaaccc ggcggatacc 1020

ggccatggca ccgtggtgat tgaactgagc tatagcggca gcgatggccc gtgcaaaatt 1080

ccgattgtga gcgtggcgag cctgaacgat atgaccccgg cgggccgcct ggtgaccgtg 1140

aacccgtttg tggcgaccag cagcgcgaac agcaaagtgc tggtggaaat ggaaccgccg 1200

tttggcgata gctatattgt ggtgggccgc gaagataaac agattaacca tcattggcat 1260

aaagcgggca gcaccctggg caaagcgttt ctgaccaccc tgaaaggcgc gcagcgcctg 1320

gcggcgctgg gcgatatgtg caccggcaaa tttagctttg cgaaaaaccc ggcggatacc 1380

ggccatggca ccgtggtgat tgaactgagc tatagcggca gcgatggccc gtgcaaaatt 1440

ccgattgtga gcgtggcgag cctgaacgat atgaccccgg cgggccgcct ggtgaccgtg 1500

aacccgtttg tggcgaccag cagcgcgaac agcaaagtgc tggtggaaat ggaaccgccg 1560

tttggcgata gctatattgt ggtgggccgc gaagataaac agattaacca tcattggcat 1620

aaagcgggca gcaccctggg caaagcgttt ctgaccaccc tgaaaggcgc gcagcgcctg 1680

gcggcgctgg gcgattga 1698

<210> 8

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

atgaaatttc tggtgaacgt ggcgctggtg tttatggtgg tgtatattag ctatatttat 60

gcggatcgct ttaactgcct gggcatgggc aaccgcgatt ttattgaagg cgcgagcggc 120

gcgacctggg tggatctggt gctggaaggc gatagctgcc tgaccattat ggcgaacgat 180

aaaccgaccc tggatgtgcg catgaccaac attgaagcga gccagctggc ggaagtgcgc 240

agctattgct atcatgcgag cgtgaccgat attagcaccg tggcgcgctg cccgatgacc 300

ggcgaagcgc ataacgaaaa acgcgcggat agcagctatg tgtgcaaaca gggctttacc 360

gatcgcggct ggggcaacgg ctgcggcctg tttggcaaag gcagcattga tacctgcgcg 420

aaatttagct gcaccagcaa agcgattggc cgcgcgattc agccggaaaa cattaaatat 480

gaagtgggca tttttgtgca tggcaccacc accagcgaaa accatggcaa ctatagcgcg 540

caggtgggcg cgagccaggc ggcgaaattt accgtgaccc cgaacgcgcc gagcattacc 600

ctgaaactgg gcgattatgg cgaagtgacc ctggattgcg aaccgcgcag cggcctgaac 660

accgaagcgt tttatgtgat gaccgtgggc agccgcagct ttctggtgca tcgcgaatgg 720

tttcatgatc tggcgctgcc gtggaccccg ccgagcagca ccgcgtggcg caaccgcgaa 780

ctgctgatgg aatttgaaga agcgcatgcg accaaacaga gcgtggtggc gctgggcagc 840

caggaaggcg gcctgcatca ggcgctggcg ggcgcgattg tggtggaata tagcagcagc 900

gtgaaactga ccagcggcca tctgaaatgc cgcctgaaaa tggataaact ggcgctgaaa 960

ggcaccacct atggcatgtg caccggcaaa tttagctttg cgaaaaaccc ggcggatacc 1020

ggccatggca ccgtggtgat tgaactgagc tatagcggca gcgatggccc gtgcaaaatt 1080

ccgattgtga gcgtggcgag cctgaacgat atgaccccgg cgggccgcct ggtgaccgtg 1140

aacccgtttg tggcgaccag cagcgcgaac agcaaagtgc tggtggaaat ggaaccgccg 1200

tttggcgata gctatattgt ggtgggccgc gaagataaac agattaacca tcattggcat 1260

aaagcgggca gcaccctggg caaagcgttt ctgaccaccc tgaaaggcgc gcagcgcctg 1320

gcggcgctgg gcgattga 1338

Claims

1.重组蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示序列。

2.用于编码权利要求1所述重组蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：它具有SEQ ID NO:1所示序列。

4.重组载体，其包含权利要求1所述重组蛋白的编码基因。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体包括pFastBac 1、pVL1393或pFastBac dual。

6.宿主细胞，其包含权利要求1所述重组蛋白的编码基因。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为昆虫细胞，所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。

8.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的重组蛋白；以及，医药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载体包括MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素中的任意一种或者两种以上的组合。

10.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于包括：

将权利要求1所述重组蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述穿梭载体包括pFastBac 1、pVL1393或pFastBac dual；和/或，所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。

12.如权利要求1所述重组蛋白或权利要求8或9所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对日本乙型脑炎病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受日本乙型脑炎病毒感染的药剂中的用途。

13.如权利要求1所述重组蛋白或权利要求8或9所述免疫组合物在制备日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。