CN111107834A - 类视黄醇的生物合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经由多步法产生类视黄醇的新颖酶促方法，所述方法包括在产生胡萝卜素的宿主细胞中使用具有活性的异源酶，特别地其中所述方法导致高百分比的反式同种型类视黄醇。

Description

类视黄醇的生物合成
本发明涉及经由多步法产生类视黄醇的新颖酶促方法，所述方法包括在产生胡萝卜素的宿主细胞中使用具有活性的异源酶，特别地其中所述方法导致高百分比的反式同种型类视黄醇。
类视黄醇，包括维生素A，是必须经由营养品供应给人类的非常重要且不可缺少的营养因子之一。类视黄醇促进人类的健康，尤其是在视觉、免疫***和生长方面。
目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，包括微生物转换步骤，这将更加经济和环保。
通常，产生类视黄醇的生物***在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不可行的。造成这种情况的原因有一些，包括类视黄醇在此类生物***中的不稳定性或副产物的相对高产量。
因此，改善β-胡萝卜素酶促转换为维生素A的产物特异性和/或生产率是一项持续存在的任务。特别地，期望优化参与前体和/或中间体的转换的酶的生产率和选择性。
令人惊讶地，我们现在能够确定一种产生视黄酯(retinyl ester)，特别是视黄醇乙酸酯(retinyl acetate)的方法，其中使用经修饰的宿主生物体，诸如产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述方法包括使参与β-胡萝卜素至视黄醇乙酸酯的转换的基因表达，其中总转换率是至少约10％朝向视黄醇生成，并且反式视黄醇乙酸酯的百分比是至少65％。
特别地，本发明涉及一种宿主细胞，特别是产生类胡萝卜素的宿主细胞，诸如真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含(1)立体选择性/反式选择性β-胡萝卜素氧化酶(beta-carotene oxidase,BCO)，所述立体选择性/反式选择性BCO催化β-胡萝卜素至视黄醛(retinal/retinaldehyde)混合物的转换，所述视黄醛混合物的至少65％的百分比作为反式视黄醛存在；(2)乙酰转移酶(acetyl transferase,ATF)，所述ATF催化视黄醇至视黄醇乙酸酯混合物的转换，其中总转换率是至少10％的视黄醇被乙酰化成视黄酯，特别是视黄醇乙酸酯，并且其中ATF偏好于将反式视黄醇乙酰化。优选地，至少80％的视黄酯呈视黄醇乙酸酯形式，优选地作为反式视黄醇乙酸酯。
根据本发明的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，任选地还包含(3)(优选地异源)视黄醇脱氢酶(retinol dehydrogenase,RDH)，所述RDH能够将视黄醛转换为视黄醇，特别地总转换率是至少约90％朝向视黄醇生成。
根据本发明的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，任选地还包含(4)对内源性酰基转移酶活性(即朝向将视黄醇酰化成长链视黄酯的活性)的修饰，所述修饰导致所述内源性酰基转移酶活性被降低或消除。
如本文所用，术语“真菌宿主细胞”尤其包括酵母作为宿主细胞，例如耶氏酵母属(Yarrowia)或酵母属(Saccharomyces)。
如本文所用，关于BCO的术语“立体选择性”、“选择性”、“反式选择性”或“反式同种型选择性”酶在本文中可互换使用。它们是指具有增强的朝向反式同种型的催化活性，即增强的朝向将β-胡萝卜素催化成反式视黄醛的活性的酶，即如本文所公开的BCO。如果满足以下条件，则根据本发明的酶是反式特异性的：基于由这种酶或包含/表达这种酶的此类产生胡萝卜素的宿主细胞(特别是真菌宿主细胞)产生的类视黄醇的总量，反式同种型(诸如反式视黄醛)的百分比在至少约65％的范围内。
如本文所用，术语“β-胡萝卜素氧化酶”、“β-胡萝卜素加氧酶”、“具有β-胡萝卜素氧化活性的酶”或“BCO”在本文中可互换使用，并且是指这样的酶，所述酶能够以反式同种型选择性方式催化β-胡萝卜素转换成视黄醛，导致基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇(包括视黄醛)的总量，视黄醛混合物具有至少约65％，诸如68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的反式同种型视黄醛。
本文所限定的反式选择性BCO可以从任何来源获得，诸如植物、动物、细菌、真菌、藻类。特别有用的立体选择性BCO获自真菌，尤其是双核菌亚界(Dikarya)，包括但不限于选自子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)的真菌，优选地获自镰刀菌属(Fusarium)或黑粉菌属(Ustilago)，更优选地是从藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)或玉米黑粉菌(U.maydis)中分离出来的，诸如FfCarX(来源于AJ854252的多肽序列)、UmCCO1(来源于EAK81726的多肽序列)。此外，特别有用的立体选择性BCO获自昆虫，特别是双翅目(Diptera)，优选地获自果蝇(Drosophila)，更优选地获自黑腹果蝇(D.melanogaster)，诸如DmNinaB或DmBCO(来源于NP_650307.2的多肽序列)。此外，特别有用的立体选择性BCO获自植物，特别是被子植物(Angiosperms)，优选地获自番红花属(Crocus)，更优选地获自番红花(C.sativus)，诸如CsZCO(来源于Q84K96.1的多肽序列)。此外，特别有用的立体选择性BCO获自真核生物，特别是鱼类(pesces)，优选地获自短担尼鱼属(Danio)或真鮰属(Ictalurus)，更优选地获自斑马鱼(D.rerio)或斑点叉尾鮰(I.punctatus)，诸如DrBCO1、IpBCO(来源于XP_017333634的多肽序列)。
因此，在一个方面中，本发明涉及用于生物合成类胡萝卜素(包括维生素A)的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含与已知来自选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7组成的组的数据库的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽或编码此类序列的多核苷酸，或与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17的多肽具有至少50％，诸如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽或编码此类序列的多核苷酸。
除了如上所述的优选在如本文所限定的产生胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中异源表达的立体选择性BCO之外，宿主细胞还包含(2)乙酰转移酶(ATF)，所述ATF催化视黄醇转换为视黄醇乙酸酯混合物，其中总转换率为至少10％的视黄醇被乙酰化成视黄酯，特别是视黄醇乙酸酯，并且其中ATF偏好于将反式视黄醇乙酰化。
如本文所用，术语“乙酰转移酶”、“视黄醇乙酰化酶”、“具有视黄醇乙酰化活性的酶”或“ATF”在本文中可互换使用，并且是指酶[EC 2.3.1.84]，所述酶[EC 2.3.1.84]能够催化视黄醇转换为视黄醇乙酸酯，其中至少80％、约87％、90％、92％、95％、97％、99％或至多100％的量的所产生的视黄醇乙酸酯呈反式同种型。所述ATF能够将视黄醇，优选反式视黄醇转换为视黄酯，特别是视黄醇乙酸酯，总转换率是至少约10％，优选地12％、15％、20％、30％、40％、50％、80％、90％或甚至100％(基于所述宿主细胞产生的类视黄醇混合物中类视黄醇的总量)朝向视黄酯(例如视黄醇乙酸酯)生成。优选的同种型是ATF1。
如本文限定的ATF可以从任何来源获得，诸如植物、动物(包括人)、藻类、真菌(包括酵母)，或细菌。特别有用的ATF，优选地ATF1酶，获自酵母，尤其是酵母属或拉茜斯酵母属(Lachancea)，优选地获自贝酵母(Saccharomyces bayanus)，诸如SbATF1(来源于AHX23958.1的多肽序列)；Lachancea mirantina(LmATF1；SEQ ID NO:33)；或酵郎香菌(Lachancea fermentati)，诸如LfATF1(来源于SCW02964.1的多肽序列)或LffATF1(来源于LT598487的多肽序列)。此外，特别有用的ATF1酶获自植物，包括但不限于选自矮牵牛属(Petunia)、卫矛属(Euonymus)、苹果属(Malus)或草莓属(Fragaria)的植物，优选地获自矮牵牛(P.hybrida)，诸如PhATF(来源于ABG75942.1的多肽序列)；卫矛(E.alatus)，诸如EaCAcT(来源于ADF57327.1的多肽序列)；苹果(M.domestica)(来源于AY517491的多肽序列)；或草莓(F.ananassa)(来源于AEM43830.1的多肽序列)。此外，特别有用的ATF1酶获自埃希氏菌属(Escherichia)，优选地大肠杆菌(E.coli)，诸如EcCAT(来源于EDS05563.1的多肽序列)。
因此，在一个方面中，本发明涉及用于生物合成类视黄醇(包括维生素A)的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：
(1)与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7组成的组的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，或与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽具有至少50％，诸如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽；以及
(2)与选自由包括根据SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:39的核苷酸序列的多核苷酸编码的SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。
根据本发明的一个方面，产生类胡萝卜素的宿主细胞包含(1)如本文所限定的立体选择性BCO，以及(2)反式作用的ATF，优选地ATF1酶，所述宿主细胞被用于产生视黄醇乙酸酯的方法中，其中视黄醇乙酸酯混合物中至少80％的百分比作为反式同种型存在，所述宿主细胞还包含选择性视黄醇脱氢酶(retinol dehydrogenase,RDH)，所述选择性RDH催化视黄醛还原成视黄醇，总转换率是至少90％朝向视黄醇产生。
如本文所用，术语“视黄醛还原酶”、“视黄醇脱氢酶”、“具有视黄醛还原活性的酶”或“RDH”在本文中可互换使用，并且是指酶[EC1.1.1.105]，所述酶[EC 1.1.1.105]几乎专有地(90％或更高)能够催化视黄醛转换为视黄醇，即所述酶[EC 1.1.1.105]能够催化视黄醛转换为视黄醇，总转换率为至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％朝向视黄醇形成。
出于本发明的目的，导致视黄醇形成增加至少约18％，诸如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的任何视黄醛还原酶均可用于如本文所限定的方法中，所述增加是基于使用合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞(特别是真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属的菌株)中存在的内源性RDH的视黄醇形成计算的。
如本文所限定的具有朝向视黄醇形成，即视黄醛还原反应的活性的RDH可以从任何来源获得，诸如植物、动物(包括人)、藻类、真菌(包括酵母)，或细菌。特别有用的RDH获自真菌，特别是双核菌亚界，包括但不限于选自子囊菌门的真菌，优选地获自镰刀菌属，更优选地是从藤仓镰刀菌分离的，诸如FfRDH12(SEQ ID NO:19)。
因此，在另一方面中，本发明涉及一种用于生物合成类视黄醇(包括维生素A)的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：
(1)与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7组成的组的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，或与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽具有至少50％，诸如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽；
(2)与选自由包括根据SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:39的核苷酸序列的多核苷酸编码的SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽；以及
(3)与由包括根据SEQ ID NO:20的核酸序列的多核苷酸编码的，根据SEQ ID NO:19的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。
根据本发明的另一方面，根据本发明的产生类胡萝卜素的宿主细胞被用于产生视黄醇乙酸酯的方法中，其中至少65％的百分比的视黄醇乙酸酯作为反式同种型存在，所述宿主细胞包含(1)如本文所限定的立体选择性或反式选择性BCO，(2)如本文所限定的ATF，诸如ATF1，所述ATF偏好于将反式视黄醇乙酰化，(3)具有约90％或更高的经由还原视黄醛而形成视黄醇的活性的RDH，所述宿主细胞任选地还包含对内源性酰基转移酶活性的修饰，诸如降低或消除的将视黄醇酰化成长链视黄酯的内源性活性。
如本文所用，术语“酰基转移酶”、“视黄醇酰化酶”、“具有视黄醇酰化活性的酶”在本文中可互换使用，并且是指能够催化视黄醇转换为长链视黄酯的酶。合适的酰化酶可以选自酰基-辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶家族成员[EC 2.3.1]，包括但不限于DGAT[EC2.3.1.20]，诸如DGAT1或DGAT2、ARAT、mdy。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种用于生物合成类视黄醇(包括维生素A)的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：
(1)与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7组成的组的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，或与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽具有至少50％，诸如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽；
(2)与选自由包括根据SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:39的核苷酸序列的多核苷酸编码的SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽；
(3)与由包括根据SEQ ID NO:20的核酸序列的多核苷酸编码的，根据SEQ ID NO:19的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽；以及
(4)降低或消除的具有催化视黄醇乙酰化为长链视黄酯的酰基转移酶活性的多肽(诸如DGAT[EC 2.3.1.20])的活性。
如本文所限定，在使用产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞产生类视黄醇的方法中对酰化活性的修饰是指编码酰基转移酶活性的一个或多个内源性基因的降低或消除，使得内源性酰基转移酶的活性被降低或消除，优选地被消除，与在宿主细胞修饰之前表达相应内源性酰基转移酶的宿主细胞(即其中内源性酰基转移酶仍然是有活性的)相比，所述宿主细胞能够或用于产生包含至少约65％的反式同种型的视黄醇乙酸酯混合物。当在维生素A生产方法中使用所述宿主细胞时，基于视黄酯的总量，反式同种型(诸如反式视黄醇乙酸酯)的百分比可以增加到约65％或更高，优选地诸如68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％。
内源性基因/蛋白质活性(诸如视黄醇酰基转移酶活性)的降低或消除，可以通过例如将一个或多个突变引入编码具有所述活性(诸如酰基转移酶活性)的酶的一个或多个内源性基因中来实现。技术人员知道如何在遗传上操纵如本文所限定的宿主细胞，从而降低或消除所述活性(例如酰基转移酶活性)。这些遗传操纵包括但不限于例如使用质粒、病毒或其他载体进行基因置换、基因扩增、基因破坏、转染、转化。
可以以不同的方式来进行在核酸或氨基酸中生成突变，即诱变，诸如通过随机诱变或定点诱变，由诸如辐射等试剂(agents)引起的物理损伤，化学处理，或***遗传元件。技术人员知道如何引入突变。
用于使如本文所限定的宿主细胞产生较少或不产生蛋白质(诸如如本文所限定的酰化酶)和/或基因拷贝，即具有较少或没有酰基转移酶活性的修饰可包括使用弱启动子，或使(如本文所述的)相应酶(或其部分)，特别是其调控元件发生突变(例如，***、缺失或点突变)。此类遗传操纵的示例可以例如影响由如本文所限定的酶的N末端区域介导的与DNA的相互作用，或与其他效应分子的相互作用。特别地，可以在蛋白质的功能(诸如用于催化活性的功能)部分中进行导致降低或消除的特定酶活性的修饰。此外，可以通过使所述酶与特异性抑制剂或与所述酶特异性相互作用的其他物质接触来实现酶比活性(specificactivity)的降低或消除。为了鉴定此类抑制剂，可以在怀疑抑制所述酶的活性的化合物的存在下表达并测试相应酶(诸如如本文所限定的酰化酶)的活性。
用于使如本文所限定的宿主细胞产生更多蛋白质(诸如如本文所限定的具有朝向视黄醇形成的选择性的RDH、(反式作用的)ATF和/或立体选择性BCO)和/或基因拷贝的修饰可以包括：使用强启动子、合适的转录和/或翻译增强子，或将一个或多个基因拷贝引入产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，导致在给定时间内相应酶的积累增加。技术人员知道根据宿主细胞使用哪些技术。基因表达的增加或减少可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。
与如本文所限定的酶的酶促催化有关的术语“转换”、“氧化”、“还原”、“酰化”、“乙酰化”是本领域公认的，并且是指酶对类视黄醇，特别是视黄醇乙酸酯的形成/产生的作用。
优选地，在如本文所限定的产生类视黄醇，特别是视黄醇乙酸酯的方法中使用的酶作为异源酶表达。它们可整合在合适的表达载体上，或可整合在染色体DNA中。此类产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞被称为重组宿主细胞，所述宿主细胞包含在表达载体上或整合到宿主细胞的染色体DNA中的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码参与类视黄醇产生，特别是如本文所述的视黄醇乙酸酯产生的酶。
在一个特定方面中，本发明涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞携带如本文所限定的一种或多种(遗传)修饰，将用于产生类视黄醇，特别是视黄醇乙酸酯的方法中，其中至少约65-90％的视黄醇乙酸酯呈反式同种型，并且其中基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇的总量，乙酰化的视黄醇形式(即视黄酯，例如视黄醇乙酸酯)的百分比是约至少10％。
根据本发明的另一方面，用如本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞产生的细胞外类视黄醇的量可以增加，特别地使用选自包括酵母(诸如耶氏酵母属或酵母属)在内的真菌的产生类胡萝卜素的宿主细胞。因此，如本文所述的方法导致至少80％的类视黄醇，诸如85％、90％、92％、95％、98％、99％或至多100％的类视黄醇，特别是视黄醇乙酸酯被输出到细胞外，其中优选地约至少80％的百分比呈反式同种型。关于进一步的分离和纯化步骤，这是特别有用的。
用于如本文所述的方法的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞可以选自适于类胡萝卜素/类视黄醇产生并且允许表达编码如本文所公开的酶(包括如本文所述的功能等同物或衍生物)中的一种的核酸的任何(微)生物。合适的产生类胡萝卜素/类视黄醇的宿主(微)生物的示例是细菌、藻类、真菌(包括酵母)、植物或动物细胞。优选的细菌是以下属的细菌：埃希氏菌属，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)；链霉菌属(Streptomyces)；泛菌属(Pantoea)(欧文氏菌属(Erwinia))；芽孢杆菌属(Bacillus)；黄杆菌属(Flavobacterium)；聚球藻属(Synechococcus)；乳杆菌属(Lactobacillus)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；微球菌属(Micrococcus)；Mixococcus；短杆菌属(Brevibacterium)；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)；戈登氏菌属(Gordonia)；迪茨氏菌属(Dietzia)；鼠尾菌属(Muricauda)；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)；集胞藻属(Synochocystis)；副球菌属(Paracoccus)，诸如产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)。优选的真核微生物，特别是包括酵母在内的真菌，选自酵母属，诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；曲霉属(Aspergillus)，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；毕赤酵母属(Pichia)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；汉逊酵母属(Hansenula)，诸如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；须霉属(Phycomyces)，诸如布氏须霉(Phycomycesblakesleanus)；毛霉属(Mucor)；红酵母属(Rhodotorula)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)；法夫酵母属(Xanthophyllomyces)；发夫酵母属(Phaffia)；布拉霉属(Blakeslea)，诸如三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)；或耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别地，优选的是在真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属中表达，或在埃希氏菌属中表达，更优选地在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。
关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。因此，例如，菌株Lachancea mirantina是源自日本的菌株接合酵母属IFO 11066(ZygosaccharomycesSp.IFO 11066)的同义词。
取决于宿主细胞，如本文所限定的多核苷酸，诸如编码如本文所限定的BCO、RDH、ATF的多核苷酸可经优化以在相应宿主细胞中表达。技术人员知道如何生成此类经修饰的多核苷酸。应当理解的是，如本文所限定的多核苷酸还包括此类经宿主优化的核酸分子，只要它们仍表达具有如本文所限定的相应活性的多肽即可。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所限定的BCO、ATF和/或RDH的多核苷酸，所述多核苷酸经优化以在所述宿主细胞中表达，而不影响宿主细胞的生长或酶的表达模式。特别地，产生类胡萝卜素的宿主细胞选自耶氏酵母属，诸如解脂耶氏酵母，所述宿主细胞包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:39组成的组的经优化的多核苷酸序列，或与所述多核苷酸序列具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的序列。
本发明涉及一种经由以下物质的酶促活性来产生包含视黄醇乙酸酯的视黄酯混合物，优选地其中至少65％的百分比是反式视黄醇乙酸酯的方法：(1)如本文所限定的立体专一性BCO，包括使β-胡萝卜素与所述BCO接触，从而产生视黄醛混合物，所述视黄醛混合物中至少65％，诸如至少65-90％的百分比是反式视黄醛，以及(2)如本文所限定的Atf1酶中的一种，包括使视黄醇，优选反式视黄醇或其中至少65-90％呈反式同种型的视黄醇混合物与所述Atf1酶接触。特别地，本发明涉及一种产生维生素A的方法，所述方法包括(a)将编码(1)如本文所限定的立体选择性BCO酶中的一种和(2)如本文所限定的Atf1酶中的一种的核酸分子引入如本文所限定的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中；(b)将β-胡萝卜素酶促转换为视黄醛，其中至少约65％是反式视黄醛，经由所述表达的Atf1的作用将视黄醇(优选地其中至少65-90％的百分比是反式视黄醇)酶促转换(即乙酰化)成反式视黄醇乙酸酯和顺式视黄醇乙酸酯的混合物；以及(3)在本领域技术人员已知的合适条件下将所述视黄醇乙酸酯转换为维生素A。
术语“序列同一性”、“％同一性”或“序列同源性”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此限定，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。
已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,Longden和Bleasby，Trends inGenetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。如果所比较的两个氨基酸序列在他们的任何氨基酸上都没有差异，则它们是相同的或具有100％的同一性。关于本文所限定的源自植物的酶，技术人员知道植物来源的酶可包含叶绿体靶向信号，所述叶绿体靶向信号将经由特定的酶(例如叶绿体加工酶(chloroplast processing enzyme,CPE))被切割。
如本文所限定的酶还包括带有不改变酶活性的一种或多种氨基酸取代的酶，即所述酶相对于野生型酶显示出相同的性质并且催化β-胡萝卜素转换为视黄醛，视黄醛转换为视黄醇，视黄醇转换为视黄醇乙酸酯，特别地总转换率是至少约65％，诸如至少约65-90％朝向产生视黄醇乙酸酯的反式同种型。此类突变也称为“沉默突变”，其不改变如本文所述的酶的(酶促)活性。
根据本发明的核酸分子可仅包含由本发明提供的核酸序列的部分或片段，例如可用作探针或引物的片段或编码如本文所限定的酶的部分的片段。由编码如本文所限定的BCO、ATF和/或RDH的基因的克隆确定的核苷酸序列允许生成被设计用于鉴定和/或克隆来自其他物种的其他同源物的探针和引物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸，所述基本上纯化的寡核苷酸通常包含优选在高度严格条件下与本文所述的核苷酸序列的至少约12个或15个，优选约18个或20个，更优选约22个或25个，甚至更优选约30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或75个或更多个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
此类杂交条件的优选的非限制性示例是在约45℃下于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下，优选在55℃下，更优选在60℃下，甚至更优选在65℃下在1x SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。
高度严格条件包括例如在42℃下使用洋地黄毒苷(DIG)标记的DNA探针(通过使用DIG标记***；Roche Diagnostics GmbH,68298 Mannheim,德国制备)在含有或不含有100μg/ml鲑鱼精DNA的溶液(诸如DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH))，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基硫酸钠、0.1％的N-月桂酰肌氨酸和2％的封闭剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中孵育2h至4天，然后在室温下在2xSSC和0.1％SDS中将滤器(filters)洗涤两次(持续5至15分钟)，以及然后在65-68℃下在0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗涤两次(持续15-30分钟)。
如本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，能够表达产生β-胡萝卜素的基因、如本文所述的β-胡萝卜素氧化酶、如本文所限定的视黄醇乙酰化酶、如本文所限定的视黄醛还原酶，和/或任选地生物合成维生素A所需的其他基因，所述宿主细胞可以如技术人员关于不同宿主细胞所已知的那样在需氧或厌氧条件下在补充有适当营养物的水性培养基中培养。任选地，如本文所限定，所述培养是在参与电子转移的蛋白质和/或辅因子存在下进行的。宿主细胞的培养/生长可以以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。如本领域技术人员所已知的，取决于宿主细胞，优选地类视黄醇(诸如维生素A)和前体(诸如视黄醛、视黄醇)的产生可变化。选自耶氏酵母属的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008042338中。关于在选自大肠杆菌的宿主细胞中的类视黄醇产生，方法描述于例如Jang等人，Microbial Cell Factories,10:95(2011)中。在例如WO2014096992中公开了在酵母宿主细胞(诸如酿酒酵母)中生产β-胡萝卜素和类视黄醇的具体方法。
本发明涉及一种产生类视黄醇，特别是视黄醇乙酸酯的方法，其中基于由相应宿主细胞在如本文所述的条件下在产生类胡萝卜素的宿主细胞中产生的类视黄醇的总量，类视黄醇的至少约65％呈反式同种型并且至少约10％的百分比呈乙酰化形式，即作为视黄醇乙酸酯。可以从培养基和/或宿主细胞中分离产生的类视黄醇，特别是视黄醇乙酸酯，并任选地进一步纯化。
如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内和在限定温度下每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性表示为每mg蛋白质每分钟消耗的底物或形成的产物的μmol数。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，在本文件全文中可互换地使用μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义。如果酶在体内，即在如本文所限定的宿主细胞内，或在合适的底物存在下的***内，执行其催化活性，则所述酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文所限定的BCO、RDH或ATF的活性。评估如本文所限定的合适酶用于类视黄醇产生的能力的分析方法是本领域已知的，诸如在WO2014096992的实施例4中所述。简而言之，产物类视黄醇和类胡萝卜素等的滴度可通过HPLC测量。
如本文所用，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致产生类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素。用于生成产生类胡萝卜素的宿主细胞的基因和方法是本领域已知的，参见例如WO2006102342。取决于要产生的类胡萝卜素，可以涉及不同的基因。
如本文所用，产生类视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致经由β-胡萝卜素的酶促转换经由视黄醛、视黄醇和视黄醇乙酸酯产生类视黄醇，例如维生素A及其前体。这些多肽包括如本文所限定的BCO、RDH和ATF。维生素A途径的基因和生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域已知的。优选地，β-胡萝卜素经由β-胡萝卜素氧化酶的作用被转换为视黄醛，所述视黄醛经由如本文所限定的RDH的作用被进一步转换为视黄醇，并且所述视黄醇，优选地反式视黄醇，经由乙酰转移酶(诸如ATF1)的作用被转换为乙酸视黄酯(retinol acetate)。乙酸视黄酯可以是从宿主细胞中分离出来的选定的类视黄醇。
如本文所用的类视黄醇包括β胡萝卜素切割产物，也称为脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲醇盐(retinoicmethoxide)、视黄醇乙酸酯、视黄酯、4-酮-类视黄醇、3羟基-类视黄醇，或它们的组合。如本文所用的长链视黄酯限定了由至少约8个，诸如9个、10个、12个、13个、15个或20个碳原子且至多约26个，诸如25个、22个、21个或更少的碳原子，以及优选至多约6个不饱和键，诸如0个、1个、2个、4个、5个、6个不饱和键组成的烃酯。长链视黄酯包括但不限于亚油酸、油酸或棕榈酸。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338中。
如本文所用的视黄醛是以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛已知的。视黄醛在本文中可互换地称为维生素A醛，并且包括顺式同种型和反式同种型两者，诸如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。
如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域公知的。它包括通过两个具有20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接而自然形成的长的40个碳缀合的类异戊二烯多烯。这些类胡萝卜素包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素，所述类胡萝卜素可以在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。
如本文所用的维生素A可以是水溶液中存在的维生素A的任何化学形式，诸如未解离的，其游离酸形式，或解离为阴离子。如本文所用的该术语包括生物技术维生素A途径中的所有前体或中间体。它还包含维生素A乙酸酯。
特别地，本发明的特征在于以下实施方式：
-一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：
(a)立体选择性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，所述宿主细胞产生包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中由所述宿主细胞产生的所述混合物中反式视黄醛的百分比是至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％；以及
(b)乙酰转移酶(ATF)[EC 2.3.1.84]，优选地具有乙酰转移酶1(Atf1)活性的酶，所述酶催化视黄醇，优选反式视黄醇转换为视黄醇乙酸酯混合物，其中基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇的总量，至少10％的百分比是乙酰化的视黄醇，即视黄醇乙酸酯。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中乙酰转移酶[EC 2.3.1.84]，优选具有乙酰转移酶1活性的酶，催化视黄醇转换为视黄醇乙酸酯混合物，其中所述混合物包含至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的视黄醇乙酸酯，诸如至少65-90％的反式同种型视黄醇乙酸酯。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞还包含(优选异源的)视黄醇脱氢酶(RDH)[EC 1.1.1.105]，所述RDH能够将视黄醛转换为视黄醇，其中总转换率为至少约90％朝向视黄醇生成，优选地所述RDH获自真菌，特别是双核菌亚界，包括但不限于选自子囊菌门的真菌，更优选地获自镰刀菌属，甚至更优选地是从藤仓镰刀菌中分离出来的，诸如与FfRDH12(SEQ ID NO:19)具有至少约60％同一性的多肽。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞还包含对内源性酰基转移酶活性的修饰，其中已经降低或消除了所述内源性酰基转移酶活性，优选地[EC 2.3.1]活性，更优选地酰基转移酶[EC 2.3.1.20]活性。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述BCO选自真菌、植物或动物，优选地选自镰刀菌属(Fusarium)、黑粉菌属(Ustilago)、番红花属(Crocus)、果蝇属(Drosophila)、短担尼鱼属(Danio)、真鮰属(Ictalurus)、狗鱼属(Esox)、矛尾鱼属(Latimeria)，更优选地选自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、番红花(Crocus sativus)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、白斑狗鱼(Esox lucius)、矛尾鱼(Latimeria chalumnae)，甚至更优选地选自与根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的多肽具有至少约60％同一性的多肽或与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽序列具有至少约50％的同一性的多肽。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述乙酰转移酶，优选地Atf1，选自植物、动物(包括人)、藻类、真菌(包括酵母)或细菌，优选地选自酵母属(Saccharomyces)、草莓属(Fragaria)、埃希氏菌属(Escherichia)、卫矛属(Euonymus)、苹果属(Malus)、矮牵牛属(Petunia)或拉茜斯酵母属(Lachancea)，更优选地选自贝酵母(Saccharomyces bayanus)、草莓(Fragaria ananassa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、卫矛(Euonymus alatus)、苹果(Malus domestica)、矮牵牛(Petuniahybrida)、Lachancea mirantina或酵郎香菌(Lachancea fermentati)，甚至更优选地选自与根据SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的多肽具有至少约60％同一性的多肽。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞产生视黄醇乙酸酯混合物，所述视黄醇乙酸酯混合物包含至少约65％，优选地68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的反式视黄醇乙酸酯同种型，诸如至少65-90％的反式视黄醇乙酸酯同种型。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自真菌，包括酵母，更优选地选自酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、布拉霉属(Blakeslea)或耶氏酵母属(Yarrowia)，甚至更优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)或副球菌属(Paracoccus)。
-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞被用于将β-胡萝卜素转换为维生素A的方法中。
-一种产生反式视黄醇乙酸酯的方法，所述方法包括在合适的培养条件下在水性培养基中培养如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞；以及从所述培养基和/或宿主细胞分离并任选地进一步纯化所述反式视黄醇乙酸酯。
-一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将编码如本文所限定的立体选择性BCO、如本文所限定的乙酰转移酶[EC2.3.1.84]、任选地如本文所限定的视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞，尤其是真菌宿主细胞中；
(b)任选地降低或消除(a)的细胞的如本文所限定的内源性酰基转移酶活性[EC2.3.1]；
(c)将β-胡萝卜素酶促转换为视黄醇乙酸酯混合物，所述视黄醇乙酸酯混合物包含的反式视黄醇乙酸酯与顺式视黄醇乙酸酯之比为4；以及
(d)在合适的培养条件下将视黄醇乙酸酯转换为维生素A。
-一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将编码立体选择性BCO、乙酰转移酶[EC 2.3.1.84]、任选地视黄醇脱氢酶[EC1.1.1.105]的核酸分子引入合适的宿主细胞中；
(b)任选地降低或消除(a)的细胞的内源性酰基转移酶活性[EC 2.3.1]；
(c)将β-胡萝卜素酶促转换为类视黄醇，基于所产生的类视黄醇的总量，所述类视黄醇包含至少10％的百分比的视黄醇乙酸酯，所述视黄醇乙酸酯包含至少65％的百分比的反式同种型；以及
(d)在合适的培养条件下将视黄醇乙酸酯转换为维生素A。
以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文，特别是WO2006102342、WO2008042338或WO2014096992。
实施例
实施例1：通用方法、菌株和质粒
本文所述的所有基本分子生物学和DNA操纵程序通常是根据Sambrook等人(编著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:New York(1989)或Ausubel等人(编著)Current Protocols in MolecularBiology.Wiley:New York(1998)执行的。
摇板试验。通常，向800μl的0.075％酵母提取物、0.25％的蛋白胨(0.25X YP)接种10μl新近生长的耶氏酵母属，并覆盖800μl矿物油(Drakeol 5,Penreco Personal CareProducts,Karns City,PA,USA)碳源，5％的矿物油中的玉米油和/或5％的水相中的葡萄糖。使转化体在24孔板(微孔板装置24深孔板，Whatman 7701-5102)中生长，用密封垫(Analytical Sales and Services Inc.Plate Mats 24010CM)覆盖，用Qiagen AirporeTape Sheets(19571)无菌密封，并在30℃下以800RPM在Infors多板摇床(Multitron)中在YPD培养基中振荡4天。将矿物油级分从摇板孔中移出，并使用光电二极管阵列检测器在正相柱上通过HPLC进行分析。此方法被用于实施例2、3、4中。
DNA转化。通过在YPD板培养基上过夜生长来转化菌株，从板上刮下50μl细胞，然后通过在含有1μg转化DNA(通常是用于整合转化的线性DNA)、40％PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA的500μl中在40℃下孵育60分钟来转化，随后直接铺板到选择性培养基上，或者在显性抗生素标记物选择的情况下，使细胞在30℃下在YPD液体培养基上生长4小时，然后再铺板到选择性培养基上。
DNA分子生物学。在pUC57载体(GenScript,Piscataway,NJ)中以NheI和MluI末端合成基因。通常，将基因亚克隆到MB5082‘URA3’、MB6157HygR和MB8327NatR载体中，以用于解脂耶氏酵母转化中的标记物选择，如在WO2016172282中所述。为了通过基因和标记物HindIII/XbaI(MB5082)或PvuII(MB6157和MB8327)的随机非同源末端连接来进行干净的基因***，分别通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱进行纯化。MB5082‘URA3’标记物由于无端(gratuitous)重复的侧翼序列而可以重复使用，所述无端重复的侧翼序列使得能够基于FOA选择URA3盒的圆形切除物(excisants)。可以通过Cre重组酶的瞬时表达来去除NatR和HygR标记物，所述Cre重组酶的瞬时表达由于侧翼的Lox位点而导致切除物。
质粒列表。表1、表2和序列表中列出了要使用的质粒、菌株、核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列ID NO:2、NO:4、NO:6、NO:8、NO:10、NO:12、NO:14、NO:16、NO:18、NO:20、NO:22、NO:24、NO:26、NO:28、NO:30、NO:32、NO:35、NO:37和NO:39经密码子优化以在耶氏酵母属中表达。
表1：用于构建携带异源BCO、RDH和ATF1基因的菌株的质粒列表。序列ID NO是指***物。有关更多详细信息，请参见文本。
Figure BDA0002421157350000221
表2：携带异源BCO、RDH和ATF1基因的用于产生类视黄醇的耶氏酵母属菌株的列表。有关更多详细信息，请参见文本。
Figure BDA0002421157350000231
正相视黄醇方法。使用附接到Waters 717自动进样器的Waters 1525二元泵来注入样品。使用配有安全硅胶保护柱套件的150×4.6mm的Phenomenex Luna 3μ Silica(2)来解析(resolve)类视黄醇。对于虾青素相关化合物，流动相由1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成；或者对于玉米黄质相关化合物，流动相由1000mL己烷、60mL异丙醇和0.1mL乙酸组成。所述流动相的流速各自为每分钟0.6mL。柱温是环境温度。注入体积是20μL。检测器是从210nm至600nm进行收集的光电二极管阵列检测器。根据表3检测分析物。
表3：使用正相视黄醇方法的分析物列表。所有添加的中间体的加总给出了类视黄醇的总量。有关更多详细信息，请参见文本。
中间体 保留时间[min] 最大λ[nm]
11-顺式二氢视黄醇 7.1 293
11-顺式视黄醛 4 364
11-顺式视黄醇 8.6 318
13-顺式视黄醛 4.1 364
二氢视黄醇 9.2 292
视黄醇乙酸酯 3.5 326
视黄酯 3 325
反式视黄醛 4.7 376
反式视黄醇 10.5 325
样品制备。根据条件，通过各种方法制备样品。对于全培养液或经洗涤的培养液样品，将培养液置于经称重的
Figure BDA0002421157350000241
管中，并加入流动相，根据制造商的用法说明书在
Figure BDA0002421157350000242
匀浆器(Bertin Corp,Rockville,MD,USA)中在最高设置3X下处理样品。在经洗涤的培养液中，将样品在微量离心机中的1.7ml管中以10000rpm旋转1分钟，将培养液倾析出，加入1ml水，混合，沉淀，然后倾析出，并定容至初始体积，将混合物再次沉淀，并用适量的流动相定容，并通过
Figure BDA0002421157350000243
珠磨进行处理。为了分析矿物油级分，将样品以4000RPM旋转10分钟，并通过正排量移液器(Eppendorf,Hauppauge,NY,USA)将油从顶部移出，在流动相中稀释，通过涡旋混合，并通过HPLC分析测量类视黄醇浓度。
发酵条件。发酵与前述条件相同，优选使用硅油或矿物油覆盖和搅拌罐，优选将葡萄糖或玉米油加入总体积为0.5L至5L的台式反应器中(见WO2016172282)。通常，在补料分批搅拌罐反应器中观察到了相同的结果，具有提高的生产率，证明了该***用于生产类视黄醇的效用。优选地，用5％的葡萄糖分批进行发酵，并且在溶解氧骤降后加入20％的硅油，并且在整个进料程序中继续进料以达到20％的溶解氧。或者，将玉米油用作进料，将矿物油用作第二相来收集脂肪族类视黄醇。
实施例2：在解脂耶氏酵母中将β-胡萝卜素转换为视黄醛
为了表达异源BCO，用纯化的线性DNA片段转化β胡萝卜素菌株ML17544，所述纯化的线性DNA片段是通过HindII和XbaI介导的限制性内切核酸酶切割和包含与URA3营养标记物连接的经密码子优化的片段的β胡萝卜素氧化酶(BCO)的凝胶纯化得到的。转化DNA来源于MB6702果蝇属NinaB BCO基因、MB6703番红花属BCO基因、MB8456镰刀菌属BCO基因，以及MB8457黑粉菌属BCO基因和MB6098短担尼鱼属BCO基因，其中使用经密码子优化的序列(SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12)。然后使基因生长，在摇板分析中筛选6-8个分离株，并将表现良好的分离株在补料分批搅拌罐反应中运行8-10天。如WO2014096992中所述使用标准参数通过HPLC检测顺式视黄醛和反式视黄醛，但使用用于类视黄醇分析物的纯化标准品进行校准。视黄醛混合物中的反式视黄醛的量能够分别增加到90％(使用番红花属BCO)、95％(使用镰刀菌属BCO)、98％(使用黑粉菌属BCO)和98％(使用短担尼鱼属BCO)。相比之下，基于视黄醛总量，来自黑腹果蝇的BCO(SEQID NO:7)导致了61％的反式视黄醛(参见表4)。
表4：通过异源BCO的作用增强的耶氏酵母属中的视黄醛产生。“％反式”是指类视黄醇混合物中反式视黄醛的百分比。有关更多详细信息，请参见文本。
Figure BDA0002421157350000261
实施例3：在解脂耶氏酵母中将视黄醛转换为视黄醇
为了表达异源RDH，用纯化的HinDIII/XbaI片段转化β胡萝卜素菌株ML17767，所述纯化的HinDIII/XbaI片段来源于含有与URA3启动子连接的视黄醇脱氢酶(RDH)基因片段的质粒。在摇板试验中筛选6至8个分离株中降低的视黄醇:视黄醛比率，并将成功的分离株在补料分批搅拌罐反应器中运行8天，显示该方法的生产率提高了一个数量级，这表明了在大规模生产中的效用。使用镰刀菌属RDH12同源物时获得了最佳结果，其中在如上所述进行摇瓶孵育8天后，仅2％或残留量的视黄醛保留。来源于镰刀菌属序列的分离株显示出增加的视黄醇还原。
实施例4：在解脂耶氏酵母中将视黄醇转换为视黄醇乙酸酯
为了表达异源ATF1，用纯化的PvuII基因片段转化产生反式视黄醇的菌株ML17968，所述纯化的PvuII基因片段含有与潮霉素抗性标记物(HygR)连接的乙酰转移酶基因片段，以用于在含有100ug/ml潮霉素的富集培养基(YPD)中进行选择。在铺板之前，使培养物在YPD中生长四小时以合成抗生素抗性基因。在摇板试验中筛选分离株的酰化作用，并将成功的分离株在补料分批搅拌罐反应器中筛选，显示生产率提高了一个数量级，这表明了在生产类视黄醇中的效用。来自分析的数据在表5中示出)。
表5：通过异源ATF1酶的作用增强的耶氏酵母属中反式类视黄醇的产生。“％反式”是指类视黄醇混合物中反式视黄醇乙酸酯的百分比。有关更多详细信息，请参见文本。
Figure BDA0002421157350000271
实施例5：ATF1活性试验
为了表达异源ATF1，用纯化的PvuII基因片段转化产生反式视黄醇的菌株ML17968，所述纯化的PvuII基因片段含有与潮霉素抗性标记物(HygR)连接的乙酰转移酶基因片段，以用于在含有100ug/ml潮霉素的富集培养基(YPD)中进行选择。在铺板之前，使培养物在YPD中生长四小时以合成抗生素抗性基因。在摇板试验中筛选分离株的酰化作用，特别地使用在0.25X YP中的10％葡萄糖作为碳源并以硅油作为覆盖物，并将成功的分离株在具有葡萄糖进料和硅油覆盖物的补料分批搅拌罐反应器中进一步筛选，显示生产率提高了一个数量级，这表明了在生产类视黄醇中的效用。来自分析的数据在表5中示出。
实施例6：在酿酒酵母中将β-胡萝卜素转换为视黄醇乙酸酯
通常，根据本领域已知的标准方法(诸如，如在US20160130628或WO2009126890中所述)，用编码诸如香叶基香叶基合酶、八氢番茄红素合酶、番茄红素合酶、番茄红素环化酶等酶的异源基因转化β-胡萝卜素菌株，所述β-胡萝卜素菌株被构建用于产生β-胡萝卜素。此外，当用β-胡萝卜素氧化酶基因转化时，能够产生视黄醛。此外，当用视黄醇脱氢酶转化时，则能够产生视黄醇。视黄醇可通过用编码醇乙酰转移酶的基因转化而被乙酰化。任选地，可使内源性视黄醇酰化基因缺失。此外，可以选择酶以产生并酰化视黄醇的反式形式，以分别产生全反式视黄醇乙酸酯和反式视黄醇的长链酯。用这种方法，获得了关于反式同种型特异性或视黄醇乙酸酯生产率的相似结果。
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120> 类视黄醇的生物合成
<130> 32576-WO-PCT
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 787
<212> PRT
<213> 玉米黑粉菌(Ustilago maydis)
<400> 1
Met Val Lys Gly Ser Ser Asn Arg Arg Gln His Ser Ala Ser Leu Gln
1 5 10 15
Gly Leu Pro Ser Ser Gln His Cys Ala Pro Val Ile Ser Ile Pro Ser
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asp His Ala Tyr Pro Pro Ser Ser Phe Thr
35 40 45
Ile Pro Leu Ser Lys Asp Glu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Pro Ser Arg
50 55 60
Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser Arg Arg Pro Val Leu Ser Arg Arg Arg
65 70 75 80
Thr Ser Lys Lys Glu Tyr Val His Pro Tyr Leu Ser Gly Asn Phe Ala
85 90 95
Pro Val Thr Thr Glu Cys Pro Leu Thr Asp Cys Leu Phe Glu Gly Thr
100 105 110
Ile Pro Glu Glu Phe Ala Gly Ser Gln Tyr Val Arg Asn Gly Gly Asn
115 120 125
Pro Leu Ala Asn Ser Glu Arg Asp Arg Asp Ala His Trp Phe Asp Ala
130 135 140
Asp Gly Met Leu Ala Gly Val Leu Phe Arg Arg Thr Pro Lys Gly Thr
145 150 155 160
Ile Gln Pro Cys Phe Leu Asn Arg Phe Ile Leu Thr Asp Leu Leu Leu
165 170 175
Ser Thr Pro Glu His Ser Arg Leu Pro Tyr Val Pro Ser Ile Ala Thr
180 185 190
Leu Val Asn Pro His Thr Ser Val Phe Trp Leu Leu Cys Glu Ile Ile
195 200 205
Arg Thr Phe Val Leu Ala Met Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly Leu
210 215 220
Gly Gly Asn Gln Lys Leu Lys Arg Ile Ser Val Ala Asn Thr Ser Val
225 230 235 240
Phe Trp His Asp Gly Lys Ala Met Ala Gly Cys Glu Ser Gly Pro Pro
245 250 255
Met Arg Ile Met Leu Pro Gly Leu Glu Thr Ala Gly Trp Tyr Thr Gly
260 265 270
Glu Glu Asp Lys Glu Lys Glu Thr Cys Asp Lys Asn Ser Gly Asn Ser
275 280 285
Leu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Gly Phe Gly Gly Gly Pro Pro Ile Val
290 295 300
Ser Met Leu Arg Glu Phe Thr Thr Ala His Pro Lys Ile Asp Pro Arg
305 310 315 320
Thr Gln Glu Leu Leu Leu Tyr His Met Cys Phe Glu Pro Pro Tyr Leu
325 330 335
Arg Ile Ser Val Ile Pro Ala Ser Gln Ser Lys Lys Thr Asp Leu Pro
340 345 350
Ala His Ala Lys Thr Ile Lys Gly Lys Ala Val Arg Gly Leu Lys Gln
355 360 365
Pro Lys Met Met His Asp Phe Gly Ala Thr Ala Thr Gln Thr Val Ile
370 375 380
Ile Asp Val Pro Leu Ser Leu Asp Met Met Asn Leu Val Arg Gly Lys
385 390 395 400
Pro Ile Leu His Tyr Asp Pro Ser Gln Pro Thr Arg Phe Gly Ile Leu
405 410 415
Pro Arg Tyr Glu Pro Glu Arg Val Arg Trp Tyr Glu Ser Ala Glu Ala
420 425 430
Cys Cys Ile Tyr His Thr Ala Asn Ser Trp Asp Asp Asp Gly Lys Phe
435 440 445
Asp Ala Ser His Glu His Ala Thr Arg Ser Ala Ile Arg Gly Val Asn
450 455 460
Met Leu Gly Cys Arg Leu Asn Ser Ala Thr Leu Val Tyr Ser Ala Gly
465 470 475 480
Asn Leu Leu Pro Pro Ser His Val Leu Pro Pro Pro Asn Cys Pro Glu
485 490 495
Lys Cys Gln Leu Tyr Tyr Trp Arg Phe Asp Leu Glu His Ala Glu Thr
500 505 510
Asn Thr Ile Ser His Glu Phe Ala Leu Ser Asp Ile Pro Phe Glu Phe
515 520 525
Pro Thr Ile Asn Glu Asp Tyr Ser Met Gln Gln Ala Cys Tyr Val Tyr
530 535 540
Gly Thr Ser Met Arg Asp Gly Thr Phe Asp Ala Gly Leu Gly Lys Ala
545 550 555 560
Ala Lys Ile Asp Ala Leu Val Lys Leu Asp Ala Gln Ala Leu Ile Arg
565 570 575
Lys Gly Lys Ala Met Trp Ser Gln Gly Arg Leu Lys Ala Gly Asp Ser
580 585 590
Val Asp Thr Arg Thr Val Glu Glu Val Leu Thr Ala Gln Arg Asp Gly
595 600 605
Ser Ala Ser Pro Glu Asp Pro Ile Lys Ile Phe Glu Met Pro Arg Gly
610 615 620
Trp Tyr Ala Gln Glu Thr Thr Phe Val Pro Arg Arg Ser Ser Thr Asn
625 630 635 640
Glu Thr Ser Gln Glu Asp Asp Gly Trp Leu Val Cys Tyr Val Phe Asp
645 650 655
Glu Ala Thr Gly Leu His Pro Ser Thr Gly Glu Val Leu Pro Gly Ala
660 665 670
Ser Ser Glu Leu Trp Ile Ile Asp Ala Lys Leu Met Ser Arg Val Val
675 680 685
Cys Arg Ile Lys Leu Pro Gln Arg Val Pro Tyr Gly Leu His Gly Thr
690 695 700
Leu Phe Thr Glu Glu Gln Ile Ala Ser Gln Lys Pro Ile Asp Pro Ser
705 710 715 720
Gln Val Arg Ser Trp Ala Leu Ser Ile Asn Leu Ala Asp Pro Phe Ser
725 730 735
Ser Ser Ala Leu Gly Ser Thr Val Tyr Ser Ala Ala Gly Lys Ala Ala
740 745 750
Thr Ser Lys Phe Lys Asn Arg Glu Glu Thr Tyr Ala Ala Phe Ile Lys
755 760 765
Asp Pro Ile Arg Ile Gly Ala Trp Trp Val Lys Arg Asn Ile Glu Leu
770 775 780
Leu Ile Ala
785
<210> 2
<211> 2364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的UmCCO1
<400> 2
atggttaagg gctcctctaa ccgacgacag cactccgctt cccttcaggg actcccttct 60
tctcagcact gtgcccccgt tatctctatt ccttctcccc ctccccctgc tgaggatcac 120
gcttaccccc cttcctcttt cactattcct ctctccaagg atgaggagct tgctgaggcc 180
ggaccctctc gacccggttc ctctgctatt tctcgacgac ctgttctgtc tcgacgacga 240
acttctaaga aggagtacgt tcacccctac ctctccggca actttgcccc tgttaccact 300
gagtgccctc tcaccgattg tctctttgag ggtactatcc ctgaggagtt tgctggctcc 360
cagtacgtcc gaaacggcgg aaaccccctt gccaactccg agcgagatcg agatgcccac 420
tggttcgatg ctgacggtat gctggctgga gttctctttc gacgaacccc caagggcacc 480
attcagcctt gtttcctcaa ccgattcatt ctcaccgacc tcctgctctc tacccctgag 540
cactctcgac tcccttacgt cccttccatc gctactctcg tcaaccccca cacttccgtc 600
ttttggctcc tttgtgagat catccgaact ttcgttctgg ctatgcttac ctggctccct 660
ggcctcggac tcggtggcaa ccagaagctc aagcgaatct ctgttgctaa cacctccgtt 720
ttctggcacg acggaaaggc tatggctgga tgtgagtctg gaccccctat gcgaatcatg 780
ctccctggtc ttgagactgc cggctggtac actggtgagg aggataagga gaaggagact 840
tgtgataaga actctggcaa ctctctcact tcttcctctt ctaagggttt tggcggaggc 900
cctcccattg tctccatgct tcgagagttt accactgctc accccaagat tgaccctcga 960
acccaggagc tccttctcta ccacatgtgc ttcgagcccc cttaccttcg aatctctgtc 1020
atccctgctt ctcagtctaa gaagactgac ctccctgctc acgctaagac cattaagggt 1080
aaggctgtgc gaggtcttaa gcagcccaag atgatgcacg atttcggcgc taccgccact 1140
cagaccgtca tcatcgacgt ccctctctcc ctcgacatga tgaacctcgt ccgaggcaag 1200
cccattctgc actacgatcc ctctcagcct acccgattcg gtattcttcc ccgatacgag 1260
cctgagcgag tgcgatggta cgagtctgcc gaggcttgct gtatctacca caccgccaac 1320
tcttgggatg acgatggcaa gtttgacgct tctcacgagc acgctacccg atccgccatc 1380
cgaggcgtca acatgctcgg ctgccgactc aactctgcca ccctcgtgta ctctgctgga 1440
aaccttctcc ctccctctca cgtccttccc cctcccaact gccctgagaa gtgtcagctc 1500
tactactggc gattcgacct tgagcacgct gagactaaca ccatttccca cgagtttgct 1560
ctgtccgaca ttcctttcga gttccccacc atcaacgagg actactctat gcagcaggct 1620
tgttacgttt acggtacttc catgcgagat ggcacctttg acgctggact cggaaaggct 1680
gctaagattg acgcccttgt taagctggac gctcaggccc ttattcgaaa gggcaaggcc 1740
atgtggtccc agggacgact taaggctgga gactctgtgg acacccgaac cgttgaggag 1800
gttctcactg ctcagcgaga tggttctgcc tcccctgagg accctatcaa gattttcgag 1860
atgccccgag gatggtacgc tcaggagact accttcgtcc ctcgacgatc ctctactaac 1920
gagacttctc aggaggatga cggttggctc gtctgctacg tgttcgatga ggccactggc 1980
cttcaccctt ccaccggaga ggttctccct ggcgcttcct ccgagctgtg gatcattgat 2040
gccaagctca tgtcccgagt cgtttgccga atcaagctcc cccagcgagt cccttacgga 2100
ctccacggca ctctctttac cgaggagcag attgcctctc agaagcctat cgacccttct 2160
caggtccgat cctgggctct gtctatcaac cttgccgatc ccttctcctc ttccgccctt 2220
ggctctaccg tgtactccgc cgctggtaag gctgccacct ccaagtttaa gaaccgagag 2280
gagacttacg ctgccttcat caaggaccct atccgaatcg gcgcttggtg ggtcaagcga 2340
aacatcgagc tcctgattgc ttaa 2364
<210> 3
<211> 696
<212> PRT
<213> 藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 3
Met Lys Phe Leu Gln Gln Asn Ser Phe Thr Gln Thr Ser Met Ser Gln
1 5 10 15
Pro His Glu Asp Val Ser Pro Ala Ile Arg His Pro Tyr Leu Thr Gly
20 25 30
Asn Phe Ala Pro Ile His Lys Thr Thr Asn Leu Thr Pro Cys Thr Tyr
35 40 45
Ser Gly Cys Ile Pro Pro Glu Leu Thr Gly Gly Gln Tyr Val Arg Asn
50 55 60
Gly Gly Asn Pro Val Ser His Gln Asp Leu Gly Lys Asp Ala His Trp
65 70 75 80
Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu Ser Gly Val Ala Phe Arg Lys Ala Ser
85 90 95
Ile Asp Gly Lys Thr Ile Pro Glu Phe Val Asn Gln Tyr Ile Leu Thr
100 105 110
Asp Leu Tyr Leu Ser Arg Lys Thr Thr Ser Ile Ala Ser Pro Ile Met
115 120 125
Pro Ser Ile Thr Thr Leu Val Asn Pro Leu Ser Thr Met Phe Gln Ile
130 135 140
Met Phe Ala Thr Phe Arg Thr Ile Phe Leu Val Ile Leu Ser Asn Leu
145 150 155 160
Pro Gly Ser Gln Gln Ala Ile Lys Arg Ile Ser Val Ala Asn Thr Ala
165 170 175
Val Leu Tyr His Asp Gly Arg Ala Leu Ala Thr Cys Glu Ser Gly Pro
180 185 190
Pro Met Arg Ile Gln Leu Pro Ser Leu Asp Thr Val Gly Trp Phe Asp
195 200 205
Gly Val Glu Ala Glu Gly Glu Pro Glu Ile Ser Gln Ala Gly Ser Asp
210 215 220
Asp Ser Pro Phe Gly Gly Ser Gly Ile Phe Ser Phe Met Lys Glu Trp
225 230 235 240
Thr Thr Gly His Pro Lys Val Asp Pro Val Thr Gly Glu Met Leu Leu
245 250 255
Tyr His Asn Thr Phe Met Pro Pro Tyr Val His Cys Ser Val Leu Pro
260 265 270
Lys Ser Asn Glu Lys Ala Pro Gly His Arg Leu Val Asn Gln Pro Val
275 280 285
Leu Gly Val Ser Gly Ala Arg Met Met His Asp Phe Gly Ala Ser Arg
290 295 300
Ser His Thr Ile Ile Met Asp Leu Pro Leu Ser Leu Asp Pro Leu Asn
305 310 315 320
Thr Met Lys Gly Lys Glu Val Val Ala Tyr Asp Pro Thr Lys Pro Ser
325 330 335
Arg Phe Gly Val Phe Pro Arg His Leu Pro Ser Ser Val Arg Trp Phe
340 345 350
His Thr Ala Pro Cys Cys Ile Phe His Thr Ala Asn Thr Trp Asp Ser
355 360 365
Gln Ser Ser Glu Gly Glu Leu Ser Val Asn Leu Leu Ala Cys Arg Met
370 375 380
Thr Ser Ser Thr Leu Val Tyr Thr Ala Gly Asn Ile Arg Pro Pro Val
385 390 395 400
Arg Ser Arg Cys Thr Gln Ala Arg Val Trp Ser Asp Glu Arg Glu Glu
405 410 415
Thr Ala Cys Arg Tyr Lys Glu Ala Pro Ala Leu Glu Ser Pro Gly Glu
420 425 430
Ser Thr Gly Leu Ala Asp Tyr Phe Pro Ile Thr Ala Glu Ser Asp Asp
435 440 445
Tyr Asp Gln Cys Arg Leu Tyr Tyr Tyr Glu Phe Asp Leu Ala Met Glu
450 455 460
Ser Arg Asn His Val Lys Ser Gln Trp Ala Leu Ser Ala Ile Pro Phe
465 470 475 480
Glu Phe Pro Ser Val Arg Pro Asp Arg Glu Met Gln Glu Ala Arg Tyr
485 490 495
Ile Tyr Gly Cys Ser Thr Ser Thr Ser Cys Phe Gly Val Ala Leu Gly
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Asp Arg Arg Ser Val Cys Glu Ile Leu Gln Glu Gln Arg Lys Asp Asp
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Pro Ile Tyr Ile Phe Arg Leu Pro Pro Asn His Tyr Ala Gln Glu Pro
565 570 575
Arg Phe Val Pro Arg Ala Cys Ser Thr Glu Glu Asp Asp Gly Tyr Leu
580 585 590
Leu Phe Tyr Val Phe Asp Glu Ser Gln Leu Leu Pro Ser Gly Asp Cys
595 600 605
Pro Pro Ser Ala Thr Ser Glu Leu Trp Ile Leu Asp Ala Lys Asn Met
610 615 620
Arg Asp Val Val Ala Lys Val Arg Leu Pro Gln Arg Val Pro Tyr Gly
625 630 635 640
Leu His Gly Thr Trp Phe Ser Ser Gln Asp Ile Glu Ser Gln Arg Ser
645 650 655
Val Glu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Val Val Gln Arg Lys Lys Glu Glu
660 665 670
Trp Val Asn Ser Gly Gly Gln Ile Arg Lys Ser Trp Met Val Leu Arg
675 680 685
Glu Lys Leu Glu Lys Ala Val Gly
690 695
<210> 4
<211> 2091
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的FfCarX
<400> 4
atgaagtttc tccagcagaa ctcctttacc cagacctcta tgtctcagcc tcacgaggat 60
gtctctcccg ccattcgaca cccttacctt accggcaact ttgctcctat tcacaagacc 120
actaacctca ctccctgtac ttactctggc tgcattcccc ccgagcttac cggaggtcag 180
tacgttcgaa acggcggaaa ccctgtctcc caccaggatc tcggaaagga tgctcactgg 240
ttcgatggcg acggtatgct ctctggcgtc gcctttcgaa aggcttccat tgatggcaag 300
actatccctg agttcgttaa ccagtacatt cttaccgacc tttacctttc tcgaaagacc 360
acctctattg cttcccctat tatgccctct atcaccaccc tggttaaccc tctctctact 420
atgtttcaga tcatgttcgc caccttccga actatcttcc tcgtcattct ctccaacctc 480
cctggttctc agcaggctat caagcgaatc tccgttgcca acactgctgt tctttaccac 540
gatggtcgag ctcttgccac ttgcgagtct ggccccccca tgcgaatcca gcttccctcc 600
ctcgataccg ttggctggtt cgacggtgtt gaggctgagg gtgagcctga gatttctcag 660
gccggctctg atgactctcc cttcggcggt tccggcatct tctcctttat gaaggagtgg 720
accaccggcc accctaaggt ggaccccgtt accggagaga tgcttctcta ccacaacacc 780
ttcatgcctc cctacgtgca ctgctctgtt cttcccaagt ctaacgagaa ggctcccgga 840
caccgacttg ttaaccagcc cgttcttggt gtttctggtg cccgaatgat gcacgacttc 900
ggagcctctc gatctcacac tatcatcatg gaccttcccc tgtctctgga ccctctcaac 960
actatgaagg gaaaggaggt tgttgcttac gaccctacca agccttctcg attcggtgtg 1020
ttcccccgac accttccctc ttccgtgcga tggtttcaca ctgctccttg ctgtatcttt 1080
cacactgcta acacttggga ttctcagtcc tctgagggag agctttctgt taacctcctt 1140
gcctgccgaa tgacctcttc tacccttgtt tacactgccg gcaacatccg acctcccgtt 1200
cgatctcgat gtactcaggc ccgagtctgg tccgatgagc gagaggagac tgcttgtcga 1260
tacaaggagg ctcctgctct tgagtctcct ggtgagtcca ctggccttgc cgactacttt 1320
cccattaccg ctgagtccga cgactacgat cagtgccgac tctactacta cgagtttgac 1380
cttgctatgg agtcccgaaa ccacgtcaag tcccagtggg ctctctctgc cattcctttc 1440
gagtttccct ctgtgcgacc tgaccgagag atgcaggagg ctcgatacat ctacggctgt 1500
tccacttcca cttcttgctt cggtgtggct ctcggacgag ctgataaggt tgaccttctc 1560
gttaagatgg atgccaagac cctcattcag cgaggaaaga agatgaacgc tacttccatc 1620
accggatgcg ttgatcgacg atctgtctgc gagatccttc aggagcagcg aaaggatgac 1680
cctatttaca ttttccgact tccccctaac cactacgctc aggagccccg attcgttccc 1740
cgagcttgtt ctactgagga ggacgacgga tacctccttt tctacgtgtt cgacgagtct 1800
cagctccttc cctctggcga ttgtcctccc tctgctactt ctgagctttg gattcttgac 1860
gctaagaaca tgcgagatgt tgtggccaag gtccgacttc cccagcgagt tccttacggt 1920
ctgcacggta cttggttctc ttctcaggat attgagtctc agcgatctgt ggagtctctt 1980
cgatctcttg aggttgtgca gcgaaagaag gaggagtggg ttaactctgg aggccagatt 2040
cgaaagtcct ggatggttct tcgagagaag ctggagaagg ctgttggata g 2091
<210> 5
<211> 369
<212> PRT
<213> 番红花(Crocus sativus)
<400> 5
Met Gln Val Asp Pro Thr Lys Gly Ile Gly Leu Ala Asn Thr Ser Leu
1 5 10 15
Gln Phe Ser Asn Gly Arg Leu His Ala Leu Cys Glu Tyr Asp Leu Pro
20 25 30
Tyr Val Val Arg Leu Ser Pro Glu Asp Gly Asp Ile Ser Thr Val Gly
35 40 45
Arg Ile Glu Asn Asn Val Ser Thr Lys Ser Thr Thr Ala His Pro Lys
50 55 60
Thr Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Phe Ser Phe Ser Tyr Gly Pro Ile
65 70 75 80
Gln Pro Tyr Val Thr Tyr Ser Arg Tyr Asp Cys Asp Gly Lys Lys Ser
85 90 95
Gly Pro Asp Val Pro Ile Phe Ser Phe Lys Glu Pro Ser Phe Val His
100 105 110
Asp Phe Ala Ile Thr Glu His Tyr Ala Val Phe Pro Asp Ile Gln Ile
115 120 125
Val Met Lys Pro Ala Glu Ile Val Arg Gly Arg Arg Met Ile Gly Pro
130 135 140
Asp Leu Glu Lys Val Pro Arg Leu Gly Leu Leu Pro Arg Tyr Ala Thr
145 150 155 160
Ser Asp Ser Glu Met Arg Trp Phe Asp Val Pro Gly Phe Asn Met Val
165 170 175
His Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Glu Gly Gly Glu Val Val Val Ile
180 185 190
Val Ala Pro Asn Val Ser Pro Ile Glu Asn Ala Ile Asp Arg Phe Asp
195 200 205
Leu Leu His Val Ser Val Glu Met Ala Arg Ile Glu Leu Lys Ser Gly
210 215 220
Ser Val Ser Arg Thr Leu Leu Ser Ala Glu Asn Leu Asp Phe Gly Val
225 230 235 240
Ile His Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Lys Ser Arg Tyr Ala Tyr Leu Gly
245 250 255
Val Gly Asp Pro Met Pro Lys Ile Arg Gly Val Val Lys Val Asp Phe
260 265 270
Glu Leu Ala Gly Arg Gly Glu Cys Val Val Ala Arg Arg Glu Phe Gly
275 280 285
Val Gly Cys Phe Gly Gly Glu Pro Phe Phe Val Pro Ala Ser Ser Lys
290 295 300
Lys Ser Gly Gly Glu Glu Asp Asp Gly Tyr Val Val Ser Tyr Leu His
305 310 315 320
Asp Glu Gly Lys Gly Glu Ser Ser Phe Val Val Met Asp Ala Arg Ser
325 330 335
Pro Glu Leu Glu Ile Leu Ala Glu Val Val Leu Pro Arg Arg Val Pro
340 345 350
Tyr Gly Phe His Gly Leu Phe Val Thr Glu Ala Glu Leu Leu Ser Gln
355 360 365
Gln
<210> 6
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的CsZCO
<400> 6
atgcaggtgg accccaccaa gggtatcggc ctggccaaca cttctctcca gttctccaac 60
ggacgactcc acgctctttg cgagtacgac ctcccctacg tcgttcgact ctcccccgag 120
gacggtgaca tctctaccgt cggacgaatc gagaacaacg tttctactaa gtctaccacc 180
gcccacccca agaccgaccc cgtcaccgga gagaccttct ctttctccta cggtcccatt 240
cagccctacg tcacctactc ccgatacgac tgcgacggca agaagtccgg ccccgacgtg 300
cccatcttct ctttcaagga gccctctttc gtccacgact tcgccatcac cgagcactac 360
gccgtctttc ccgacattca gatcgtgatg aagcccgccg agatcgttcg aggacgacga 420
atgatcggcc ccgaccttga gaaggtcccc cgactgggcc ttctcccccg atacgccacc 480
tccgactccg agatgcgatg gttcgacgtg cccggtttca acatggttca cgtggttaac 540
gcttgggagg aggagggcgg agaggtcgtg gtcatcgtgg cccccaacgt gtcccccatt 600
gagaacgcca tcgaccgatt cgacctcctc cacgtgtctg tggagatggc ccgaatcgag 660
ctgaagtccg gttccgtgtc ccgaaccctt ctctctgccg agaacctcga tttcggtgtg 720
attcaccgag gctactccgg tcgaaagtcc cgatacgctt acctcggagt cggcgacccc 780
atgcccaaga ttcgaggtgt ggtcaaggtg gacttcgagc tggccggacg aggagagtgc 840
gtggttgccc gacgagagtt cggcgtgggt tgtttcggtg gagagccctt ctttgtcccc 900
gcttcttcca agaagtctgg aggcgaggag gacgatggct acgttgtgtc ttaccttcac 960
gacgagggaa agggagagtc ctctttcgtc gtgatggacg ctcgatctcc cgagctggag 1020
attcttgccg aggtggttct gccccgacga gttccctacg gttttcacgg cctctttgtt 1080
accgaggccg agcttctctc ccagcagtag 1110
<210> 7
<211> 620
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400> 7
Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp Phe Phe Ala Val
1 5 10 15
Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly
20 25 30
Asn Gly Arg Leu Tyr Pro Asn Cys Ser Ser Asp Val Trp Leu Arg Ser
35 40 45
Cys Glu Arg Glu Ile Val Asp Pro Ile Glu Gly His His Ser Gly His
50 55 60
Ile Pro Lys Trp Ile Cys Gly Ser Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Ser
65 70 75 80
Trp Lys Val Gly Asp Met Thr Phe Gly His Leu Phe Asp Cys Ser Ala
85 90 95
Leu Leu His Arg Phe Ala Ile Arg Asn Gly Arg Val Thr Tyr Gln Asn
100 105 110
Arg Phe Val Asp Thr Glu Thr Leu Arg Lys Asn Arg Ser Ala Gln Arg
115 120 125
Ile Val Val Thr Glu Phe Gly Thr Ala Ala Val Pro Asp Pro Cys His
130 135 140
Ser Ile Phe Asp Arg Phe Ala Ala Ile Phe Arg Pro Asp Ser Gly Thr
145 150 155 160
Asp Asn Ser Met Ile Ser Ile Tyr Pro Phe Gly Asp Gln Tyr Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Glu Thr Pro Phe Met His Arg Ile Asn Pro Cys Thr Leu Ala
180 185 190
Thr Glu Ala Arg Ile Cys Thr Thr Asp Phe Val Gly Val Val Asn His
195 200 205
Thr Ser His Pro His Val Leu Pro Ser Gly Thr Val Tyr Asn Leu Gly
210 215 220
Thr Thr Met Thr Arg Ser Gly Pro Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Phe Pro
225 230 235 240
His Gly Glu Gln Met Phe Glu Asp Ala His Val Val Ala Thr Leu Pro
245 250 255
Cys Arg Trp Lys Leu His Pro Gly Tyr Met His Thr Phe Gly Leu Thr
260 265 270
Asp His Tyr Phe Val Ile Val Glu Gln Pro Leu Ser Val Ser Leu Thr
275 280 285
Glu Tyr Ile Lys Ala Gln Leu Gly Gly Gln Asn Leu Ser Ala Cys Leu
290 295 300
Lys Trp Phe Glu Asp Arg Pro Thr Leu Phe His Leu Ile Asp Arg Val
305 310 315 320
Ser Gly Lys Leu Val Gln Thr Tyr Glu Ser Glu Ala Phe Phe Tyr Leu
325 330 335
His Ile Ile Asn Cys Phe Glu Arg Asp Gly His Val Val Val Asp Ile
340 345 350
Cys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Met Ile Asn Cys Met Tyr Leu Glu Ala
355 360 365
Ile Ala Asn Met Gln Thr Asn Pro Asn Tyr Ala Thr Leu Phe Arg Gly
370 375 380
Arg Pro Leu Arg Phe Val Leu Pro Leu Gly Thr Ile Pro Pro Ala Ser
385 390 395 400
Ile Ala Lys Arg Gly Leu Val Lys Ser Phe Ser Leu Ala Gly Leu Ser
405 410 415
Ala Pro Gln Val Ser Arg Thr Met Lys His Ser Val Ser Gln Tyr Ala
420 425 430
Asp Ile Thr Tyr Met Pro Thr Asn Gly Lys Gln Ala Thr Ala Gly Glu
435 440 445
Glu Ser Pro Lys Arg Asp Ala Lys Arg Gly Arg Tyr Glu Glu Glu Asn
450 455 460
Leu Val Asn Leu Val Thr Met Glu Gly Ser Gln Ala Glu Ala Phe Gln
465 470 475 480
Gly Thr Asn Gly Ile Gln Leu Arg Pro Glu Met Leu Cys Asp Trp Gly
485 490 495
Cys Glu Thr Pro Arg Ile Tyr Tyr Glu Arg Tyr Met Gly Lys Asn Tyr
500 505 510
Arg Tyr Phe Tyr Ala Ile Ser Ser Asp Val Asp Ala Val Asn Pro Gly
515 520 525
Thr Leu Ile Lys Val Asp Val Trp Asn Lys Ser Cys Leu Thr Trp Cys
530 535 540
Glu Glu Asn Val Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Pro Ser Pro Asp
545 550 555 560
Pro Lys Ser Glu Asp Asp Gly Val Ile Leu Ala Ser Met Val Leu Gly
565 570 575
Gly Leu Asn Asp Arg Tyr Val Gly Leu Ile Val Leu Cys Ala Lys Thr
580 585 590
Met Thr Glu Leu Gly Arg Cys Asp Phe His Thr Asn Gly Pro Val Pro
595 600 605
Lys Cys Leu His Gly Trp Phe Ala Pro Asn Ala Ile
610 615 620
<210> 8
<211> 1863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的DmNinaB
<400> 8
atggccgctg gtgttttcaa gtcttttatg cgagatttct ttgctgttaa gtacgatgag 60
cagcgaaacg acccccaggc cgagcgactg gacggcaacg gacgactgta ccccaactgc 120
tcctctgatg tttggcttcg atcttgcgag cgagagatcg ttgaccccat tgagggccac 180
cactccggtc acattcccaa gtggatttgc ggttccctgc tccgaaacgg ccccggctct 240
tggaaggttg gcgacatgac cttcggccac ctgttcgact gctccgccct gctccaccga 300
tttgccattc gaaacggacg agtcacctac cagaaccgat ttgttgacac tgagactctg 360
cgaaagaacc gatctgccca gcgaattgtt gtcaccgagt ttggcactgc cgctgttccc 420
gatccctgtc actccatctt cgaccgattt gccgccattt ttcgacccga ttctggaacc 480
gataactcca tgatttccat ctaccccttc ggcgaccagt actacacttt caccgagact 540
ccctttatgc accgaattaa cccctgcact ctcgctactg aggctcgaat ctgcaccacc 600
gacttcgttg gcgttgtcaa ccacacttct cacccccacg ttcttccctc tggcactgtt 660
tacaacctgg gcaccactat gacccgatct ggacccgctt acactatcct ctctttcccc 720
cacggcgagc agatgttcga ggacgctcac gttgtcgcca ctctgccctg ccgatggaag 780
ctgcaccccg gttatatgca caccttcggc ctcactgacc actactttgt cattgttgag 840
cagccccttt ccgtttccct cactgagtac atcaaggccc agcttggcgg acagaacctt 900
tccgcttgcc tcaagtggtt cgaggaccga cccactctct ttcaccttat tgatcgagtt 960
tccggcaagc tggtccagac ctacgagtcc gaggctttct tctacctgca catcatcaac 1020
tgctttgagc gagatggcca cgttgtcgtt gacatttgct cttaccgaaa ccccgagatg 1080
attaactgca tgtacctgga ggccattgcc aacatgcaga ctaaccccaa ctacgctacc 1140
ctctttcgag gacgacccct tcgattcgtc ctgcccctcg gcactattcc ccccgcctct 1200
atcgccaagc gaggactcgt caagtccttc tccctcgctg gactctccgc tccccaggtt 1260
tctcgaacca tgaagcactc cgtttctcag tacgccgata ttacctacat gcccaccaac 1320
ggaaagcagg ccactgctgg agaggagtcc cccaagcgag atgccaagcg aggccgatac 1380
gaggaggaga accttgtcaa cctggttact atggagggct ctcaggccga ggcttttcag 1440
ggcaccaacg gcattcagct tcgacccgag atgctgtgtg attggggctg tgagactccc 1500
cgaatctact acgagcgata catgggcaag aactaccgat acttctacgc catttcttcc 1560
gatgttgatg ctgtcaaccc cggcaccctc atcaaggttg atgtctggaa caagtcttgt 1620
cttacctggt gcgaggagaa cgtctacccc tctgagccca tttttgtccc ctctcccgat 1680
cccaagtccg aggacgatgg cgttatcctg gcctctatgg ttcttggcgg tcttaacgac 1740
cgatacgtcg gccttattgt tctttgtgcc aagaccatga ccgagctggg ccgatgtgat 1800
ttccacacca acggacccgt tcccaagtgc ctccacggtt ggtttgctcc caacgccatt 1860
tag 1863
<210> 9
<211> 525
<212> PRT
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 9
Met Leu Ser Phe Phe Trp Arg Asn Gly Ile Glu Thr Pro Glu Pro Leu
1 5 10 15
Lys Ala Asp Val Ser Gly Ser Ile Pro Pro Trp Leu Gln Gly Thr Leu
20 25 30
Leu Arg Asn Gly Pro Gly Leu Phe Ser Val Gly Asn Thr Ser Tyr Lys
35 40 45
His Trp Phe Asp Gly Met Ala Leu Ile His Ser Phe Thr Phe Lys Asp
50 55 60
Gly Glu Val Phe Tyr Arg Ser Lys Tyr Leu Lys Ser Glu Thr Tyr Lys
65 70 75 80
Lys Asn Ile Ala Ala Asp Arg Ile Val Val Ser Glu Phe Gly Thr Met
85 90 95
Val Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Ile Phe Ser Arg Ala Phe Ser Tyr
100 105 110
Met Met Asn Ala Ile Pro Asp Phe Thr Asp Asn Asn Leu Ile Asn Ile
115 120 125
Ile Lys Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ala Ser Ser Glu Val Asn Tyr Ile
130 135 140
Asn Gln Ile Asp Pro Leu Thr Leu Glu Thr Leu Gly Arg Thr Asn Tyr
145 150 155 160
Arg Asn His Ile Ala Ile Asn Leu Ala Thr Ala His Pro His Tyr Asp
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Glu Glu Gly Asn Thr Tyr Asn Met Gly Thr Ala Ile Met Asn Leu Gly
180 185 190
Arg Pro Lys Tyr Val Ile Phe Lys Val Pro Ala Asn Thr Ser Asp Lys
195 200 205
Glu Asn Lys Lys Pro Ala Leu Ser Glu Val Glu Gln Val Cys Ser Ile
210 215 220
Pro Ile Arg Pro Ser Leu Tyr Pro Ser Tyr Phe His Ser Phe Gly Met
225 230 235 240
Thr Glu Asn Tyr Ile Ile Phe Val Glu Gln Ala Phe Lys Leu Asp Ile
245 250 255
Val Lys Leu Ala Thr Ala Tyr Phe Arg Asp Ile Asn Trp Gly Ser Cys
260 265 270
Leu Lys Phe Asp Gln Asp Asp Ile Asn Val Phe His Leu Val Asn Lys
275 280 285
Lys Thr Gly Lys Ala Val Ser Val Lys Tyr Tyr Thr Asp Pro Phe Val
290 295 300
Thr Phe His His Ile Asn Ala Tyr Glu Asp Asp Gly His Val Val Phe
305 310 315 320
Asp Leu Ile Thr Tyr Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Asp Met Phe Tyr Ile
325 330 335
Gln Asn Met Lys Gln Asp Val Lys Arg Phe Ile Glu Thr Asn Lys Asp
340 345 350
Phe Ala Gln Pro Val Cys Gln Arg Phe Val Leu Pro Val Asn Val Asp
355 360 365
Lys Glu Thr Pro Gln Asp Ile Asn Leu Val Lys Leu Gln Asp Thr Thr
370 375 380
Ala Thr Ala Val Leu Lys Glu Asp Gly Ser Val Tyr Cys Thr Pro Asp
385 390 395 400
Ile Ile Phe Lys Gly Leu Glu Leu Pro Ala Ile Asn Tyr Lys Phe Asn
405 410 415
Ser Lys Lys Asn Arg Tyr Phe Tyr Gly Thr Arg Val Glu Trp Ser Pro
420 425 430
Tyr Pro Asn Lys Val Ala Lys Val Asp Val Val Thr Arg Thr His Lys
435 440 445
Ile Trp Thr Glu Glu Glu Cys Tyr Pro Ser Glu Pro Val Phe Ile Ala
450 455 460
Ser Pro Asp Ala Val Asp Glu Asp Asp Gly Val Ile Leu Ser Ser Val
465 470 475 480
Val Ser Phe Asn Pro Gln Arg Pro Pro Phe Leu Val Val Leu Asp Ala
485 490 495
Lys Ser Phe Lys Glu Ile Ala Arg Ala Thr Ile Asp Ala Ser Ile His
500 505 510
Met Asp Leu His Gly Leu Phe Ile His Asp Lys Ser Thr
515 520 525
<210> 10
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的DrBCO
<400> 10
atgctctctt tcttctggcg aaacggtatc gagacccccg agcccctcaa ggctgacgtt 60
tccggctcta tccctccctg gcttcaggga acccttctcc gaaacggtcc tggtctgttc 120
tccgttggca acacttccta caagcactgg ttcgatggta tggctctcat tcactccttc 180
acctttaagg atggtgaggt tttttaccga tctaagtacc tgaagtctga gacttacaag 240
aagaacatcg ctgccgaccg aatcgttgtg tctgagttcg gaaccatggt gtaccccgat 300
ccctgcaaga acattttctc ccgagccttc tcttacatga tgaacgccat tcctgacttt 360
accgataaca acctcattaa catcattaag tacggtgagg attactacgc ctcctctgag 420
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cgaaaccaca ttgccatcaa ccttgccact gctcaccctc actacgacga ggagggtaac 540
acttacaaca tgggcactgc tattatgaac ctcggtcgac ccaagtacgt gattttcaag 600
gtgcccgcca acacctctga taaggagaac aagaagcctg ccctctctga ggtggagcag 660
gtttgctcca ttcccatccg accctccctt tacccttctt acttccactc ttttggcatg 720
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actgcttact tccgagatat taactgggga tcttgcctta agttcgacca ggatgacatt 840
aacgtgttcc acctggtcaa caagaagact ggtaaggctg tgtccgtgaa gtactacact 900
gacccctttg ttaccttcca ccacatcaac gcttacgagg acgatggcca cgtcgtcttc 960
gatctcatta cttacaagga ctctaagctg tacgatatgt tctacattca gaacatgaag 1020
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tttgtccttc ccgtcaacgt tgataaggag acccctcagg acatcaacct tgtcaagctg 1140
caggacacca ctgccactgc tgtcctgaag gaggacggct ctgtctactg cacccctgac 1200
atcattttta agggtcttga gctccctgct atcaactaca agtttaactc taagaagaac 1260
cgatacttct acggcacccg agtggagtgg tccccttacc ctaacaaggt cgctaaggtg 1320
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cacgacaagt ctacctaa 1578
<210> 11
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑马鱼BCO TPI aa
<400> 11
Lys Gln Lys Ser Asn His Ile Leu Gln Tyr Ser Pro Val Ile Thr Ala
1 5 10 15
Ser Ile Thr Pro Val Gln Val Ser Leu Gly Phe Leu Phe Thr Asp Thr
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Val Ile Tyr Leu Thr Ile Ser Leu Gln Val Thr Gln Lys Val His Val
35 40 45
Gly Asn Glu Pro Gln Thr Lys Thr Arg Tyr Asp Lys Ile Ala Leu Phe
50 55 60
Asp Ala Glu Phe Asp Gly Val Ser Ile Gly Val Met Thr Phe Ile Cys
65 70 75 80
Ile His Thr Lys Lys Ser Trp Trp Tyr Phe Cys Val Ile Thr Ser Asp
85 90 95
Ile Tyr Ala Pro Pro Asn Pro Pro Ala Thr Val Lys Ser Val Ser Leu
100 105 110
Leu Tyr Met Leu Thr Lys Pro Pro Thr Val Gln Arg Asn Pro Ser Ala
115 120 125
Lys Ser His Asn Gln Leu Ile Thr Thr His Pro Met Thr Ser Pro Gln
130 135 140
Ile Leu Tyr Ala Phe Arg His Tyr Tyr Ser Ser Leu Gln Arg Arg Cys
145 150 155 160
Leu Arg Phe His Phe Cys Ser Ile Thr Ser Leu Asn Pro Tyr Arg Gln
165 170 175
Ile Arg Pro Trp His Val Ser Arg Leu Ile Ser Pro Arg Val Leu His
180 185 190
Gln Gly Gly Gly Val Arg Asn Thr Val Arg Ala His Ser Lys Gly Val
195 200 205
Arg Val Arg Ala Ser Asp Asn Ile Ala Trp Thr Arg Arg His Ile Leu
210 215 220
Asp Phe Trp Ala Arg Cys Ile His Leu Leu Arg Phe Pro Thr Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Ser Pro Ser Gln Pro Ile Glu Gly Asn Leu Ile Arg Asp Thr
245 250 255
Phe Val Ile His Ser Gln Ile Tyr Lys Gln Cys His Ser Pro Ser Tyr
260 265 270
Ser Tyr Ile Gln His Asn Tyr Ile Gln
275 280
<210> 12
<211> 880
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的DrBCO-TPI
<400> 12
aaacaaaaga gctgaaatca tatccttcag tagtagtata gtcctgttat cacagcatca 60
attacccccg tccaagtaag ttgattggga tttttgttta cagatacagt aatatacttg 120
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gatatctacg caccccccaa cccccctgct acagtaaaga gtgtgagtct actgtacatg 360
cttactaaac cacctactgt acagcgaaac ccctcagcaa aatcacacaa tcagctcatt 420
acaacacacc caatgacctc accacaaatt ctatacgcct tttgacgcca ttattacagt 480
agcttgcaac gccgttgtct taggttccat ttttagtgct ctattacctc acttaacccg 540
tataggcaga tcaggccatg gcactaagtg tagagctaga ggttgatatc gccacgagtg 600
ctccatcagg gctagggtgg ggttagaaat acagtccgtg cgcactcaaa aggcgtccgg 660
gttagggcat ccgataatat cgcctggact cggcgccata ttctcgactt ctgggcgcgt 720
tgtattcatc tcctccgctt cccaacactt ccacccgttt ctccatccca accaatagaa 780
tagggtaacc ttattcggga cactttcgtc atacatagtc agatatacaa gcaatgtcac 840
tctccttcgt actcgtacat acaacacaac tacattcaaa 880
<210> 13
<211> 531
<212> PRT
<213> 斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus）
<400> 13
Met Glu Ala Ile Phe Cys Arg Asn Gly Thr Glu Thr Pro Glu Pro Val
1 5 10 15
Lys Ala Val Val Ser Gly Ala Ile Pro Pro Trp Leu Gln Gly Thr Leu
20 25 30
Leu Arg Asn Gly Pro Gly Leu Phe Ser Ile Gly Lys Thr Ser Tyr Asn
35 40 45
His Trp Phe Asp Gly Leu Ser Leu Ile His Ser Phe Thr Phe Lys His
50 55 60
Gly Asp Val Tyr Tyr Arg Ser Lys Phe Leu Arg Ser Asp Thr Tyr Lys
65 70 75 80
Lys Asn Ile Ala Ala Asn Arg Ile Val Val Ser Glu Phe Gly Thr Met
85 90 95
Val Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Ile Phe Ser Lys Ala Phe Thr Tyr
100 105 110
Leu Leu Asn Ser Ile Pro Asp Phe Thr Asp Asn Asn Leu Val Ser Ile
115 120 125
Ile Lys Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Thr Ser Ser Glu Ile Asn Tyr Ile
130 135 140
Asn Gln Ile Asn Pro Val Thr Leu Asp Thr Ile Gly Arg Ala Asn Tyr
145 150 155 160
Arg Asn Tyr Ile Ser Leu Asn Leu Ala Thr Ala His Pro His Tyr Asp
165 170 175
Asp Glu Gly Asn Thr Tyr Asn Met Gly Thr Ala Ile Leu Ala Met Ser
180 185 190
Gly Pro Lys Tyr Val Ile Phe Lys Val Pro Ala Thr Thr Ser Asp Ile
195 200 205
Lys Asp Asn Gly Lys Thr Asn Leu Ala Leu Lys Asn Leu Gln Gln Ile
210 215 220
Cys Ala Ile Pro Phe Arg Ser Lys Leu Tyr Pro Ser Tyr Tyr His Ser
225 230 235 240
Phe Gly Met Thr Gln Asn Tyr Ile Ile Phe Val Glu Gln Pro Phe Lys
245 250 255
Leu Asp Ile Ile Arg Leu Ala Thr Ala Tyr Phe Arg Arg Thr Thr Trp
260 265 270
Gly Lys Cys Leu Phe Tyr Asp Gln Asp Asp Val Thr Leu Phe His Ile
275 280 285
Ile Asn Arg Lys Thr Gly Asp Ala Val Asn Thr Lys Phe Tyr Gly Asp
290 295 300
Ala Leu Val Val Phe His His Ile Asn Ala Tyr Glu Glu Asp Gly His
305 310 315 320
Ile Val Phe Asp Leu Ile Ser Tyr Lys Asp Ser Ser Leu Tyr Asp Leu
325 330 335
Phe Tyr Ile Asp Tyr Met Lys Gln Glu Ala Pro Lys Phe Thr Glu Thr
340 345 350
Ser Lys Ala Phe Ser Arg Pro Val Cys Gln Arg Phe Val Ile Pro Leu
355 360 365
Asn Ala Asp Leu Lys Gly Asn Pro Leu Gly Lys Asn Leu Val Arg Leu
370 375 380
Glu Asp Thr Ser Ala Thr Ala Val Phe Gln Met Asp Gly Ser Leu Tyr
385 390 395 400
Cys Thr Pro Glu Thr Leu Phe Gln Gly Leu Glu Leu Pro Ser Ile Asn
405 410 415
Tyr Gln Tyr Asn Gly Lys Lys Tyr Arg Tyr Phe Tyr Gly Ser Met Met
420 425 430
Asp Trp Ser Pro Gln Ala Asn Lys Ile Ala Lys Val Asp Val Asp Thr
435 440 445
Lys Thr His Leu Glu Trp Thr Glu Glu Asp Cys Tyr Pro Ser Glu Pro
450 455 460
Lys Phe Val Ala Ser Pro Gly Ala Val Asp Glu Asp Asn Gly Val Ile
465 470 475 480
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Asn Pro Lys Lys Ser Pro Phe Met Leu
485 490 495
Val Leu Asp Ala Lys Thr Leu Lys Glu Ile Ala Arg Ala Ser Ile Asp
500 505 510
Ala Thr Val His Leu Asp Leu His Gly Ile Phe Ile Pro Gln Glu Thr
515 520 525
Glu Leu Lys
530
<210> 14
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的IpBCO
<400> 14
atggaggcca ttttctgtcg aaacggcacc gagactcccg agcccgtcaa ggctgttgtg 60
tccggtgcta tccccccttg gcttcaggga acccttctcc gaaacggacc cggccttttc 120
tccattggta agacttccta caaccactgg tttgacggac tctctcttat tcactctttc 180
acctttaagc acggtgatgt ttactaccga tctaagttcc tccgatccga tacctacaag 240
aagaacattg ctgccaaccg aatcgttgtg tctgagtttg gcactatggt ctaccccgat 300
ccctgcaaga acattttctc taaggccttc acttacctgc tcaactctat tcccgatttc 360
accgacaaca accttgtctc tattattaag tacggcgatg actactacac ttcttccgag 420
attaactaca tcaaccagat caaccccgtt actctcgaca ctattggacg agccaactac 480
cgaaactaca tttcccttaa ccttgctact gcccaccctc actacgatga cgagggaaac 540
acctacaaca tgggcactgc tatcctggct atgtctggac ccaagtacgt catcttcaag 600
gtgcccgcta ctacctctga tattaaggac aacggaaaga ctaaccttgc tctgaagaac 660
ctgcagcaga tctgcgccat tcctttccga tctaagctct acccttctta ctaccactcc 720
tttggtatga ctcagaacta catcattttc gttgagcagc ccttcaagct ggacattatt 780
cgactggcca ctgcttactt ccgacgaacc acctggggca agtgcctctt ttacgaccag 840
gacgatgtta ctctcttcca cattatcaac cgaaagactg gtgacgccgt gaacactaag 900
ttctacggtg atgctctcgt ggttttccac cacatcaacg cctacgagga ggacggccac 960
atcgtttttg acctgatctc ttacaaggac tcttctctct acgacctttt ctacattgac 1020
tacatgaagc aggaggctcc taagttcact gagacttcca aggctttttc tcgacccgtc 1080
tgtcagcgat tcgtcatccc tctcaacgct gacctcaagg gaaaccccct gggcaagaac 1140
cttgtccgac ttgaggacac ttctgctacc gctgtgttcc agatggacgg ttccctgtac 1200
tgtactcccg agactctctt tcagggtctt gagctccctt ccattaacta ccagtacaac 1260
ggaaagaagt accgatactt ctacggctct atgatggatt ggtcccctca ggctaacaag 1320
atcgctaagg tggacgttga taccaagact caccttgagt ggaccgagga ggattgctac 1380
ccttctgagc ctaagtttgt cgcttcccct ggcgctgtcg atgaggataa cggtgtgatc 1440
ctgtcttctg ttgtctccgt caaccccaag aagtccccct ttatgctcgt gctcgatgct 1500
aagaccctca aggagatcgc tcgagcctct attgacgcca ctgttcacct cgacctccac 1560
ggaattttca tccctcagga gactgagctt aagtaa 1596
<210> 15
<211> 527
<212> PRT
<213> 白斑狗鱼(Esox lucius)
<400> 15
Met Ala Gln Ile Ile Phe Gly Lys Asn Gly Thr Glu Ser Pro Glu Pro
1 5 10 15
Val Lys Ala Glu Ile Thr Gly Cys Ile Pro Glu Trp Leu Gln Gly Thr
20 25 30
Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Leu Phe Lys Val Gly Asp Thr Glu Tyr
35 40 45
Asn His Trp Phe Asp Gly Met Ala Leu Ile His Ser Phe Thr Phe Lys
50 55 60
Asp Gly Asp Val Tyr Tyr Arg Ser Lys Phe Leu Arg Ser Asp Thr Phe
65 70 75 80
Gln Lys Asn Thr Lys Ala Asn Lys Ile Val Val Ser Glu Phe Gly Thr
85 90 95
Met Ile Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Met Phe Ser Lys Ala Phe Ser
100 105 110
Tyr Leu Leu Ala Ala Ile Pro Asp Phe Thr Asp Asn Asn Leu Ile Asn
115 120 125
Ile Ile Arg Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ala Ser Ser Glu Ile Asn Tyr
130 135 140
Ile Asn Gln Ile Asp Pro Val Thr Leu Glu Val Ile Gly Lys Met Asn
145 150 155 160
Tyr Arg Lys His Ile Ser Leu Asn Leu Ala Thr Ala His Pro His Tyr
165 170 175
Asp Glu Glu Gly Asn Thr Tyr Asn Met Gly Ile Ala Leu Met Arg Phe
180 185 190
Gly Met Pro Lys Tyr Val Ile Phe Lys Val Pro Val Asp Ala Ser Asp
195 200 205
Lys Glu Gly Lys Lys Pro Ala Leu Glu Glu Val Glu Gln Val Cys Asn
210 215 220
Ile Pro Phe Arg Ser Thr Leu Phe Pro Ser Tyr Phe His Ser Phe Gly
225 230 235 240
Met Ser Glu Asn Tyr Ile Ile Phe Val Glu Gln Pro Phe Lys Leu Asp
245 250 255
Ile Leu Arg Leu Ala Thr Ala Asn Phe Arg Gly Ser Thr Trp Gly Ser
260 265 270
Cys Leu Lys Tyr Asp Lys Glu Asp Ile Thr Leu Ile His Leu Val Asp
275 280 285
Lys Lys Thr Gly Lys Ala Val Ser Thr Lys Phe Tyr Ala Asp Ala Leu
290 295 300
Val Val Phe His His Ile Asn Ala Tyr Glu Asp Asp Asn His Val Val
305 310 315 320
Phe Asp Met Ile Thr Tyr Lys Asp Ser Asn Leu Tyr Glu Met Phe Tyr
325 330 335
Leu Ala Asn Met Arg Glu Glu Ser Asn Lys Phe Ile Glu Asp Lys Val
340 345 350
Asn Phe Ser Gln Pro Ile Cys Gln Arg Phe Val Leu Pro Leu Asn Val
355 360 365
Asp Lys Asp Thr Thr Lys Gly Thr Asn Met Val Met Leu Lys Asn Thr
370 375 380
Thr Ala Lys Ala Val Met Gln Asp Asp Gly Ser Val Tyr Cys Lys Pro
385 390 395 400
Asp Thr Ile Phe Ala Gly Leu Glu Leu Pro Gly Ile Asn Tyr Lys Phe
405 410 415
Asn Gly Lys Lys Tyr Arg Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Val Glu Trp Thr
420 425 430
Pro Phe Pro Asn Lys Ile Gly Lys Val Asp Ile Leu Thr Lys Lys His
435 440 445
Ile Glu Trp Thr Glu Glu Glu Cys Tyr Pro Ser Glu Pro Val Phe Val
450 455 460
Ala Ser Pro Gly Ala Met Glu Glu Asp Asp Gly Val Ile Leu Ser Ser
465 470 475 480
Ile Val Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Pro Phe Met Leu Val Leu Asn
485 490 495
Ala Lys Asn Phe Glu Glu Ile Ala Arg Ala Ser Ile Asp Ala Ser Val
500 505 510
His Leu Asp Leu His Gly Leu Phe Ile Pro Ser Gln Lys Thr Asn
515 520 525
<210> 16
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的ElBCO
<400> 16
atggctcaga ttatttttgg caagaacggc actgagtctc ctgagcctgt caaggccgag 60
attaccggat gtatccctga gtggctccag ggtactctcc ttcgaaacgg tcccggtctt 120
ttcaaggtgg gtgataccga gtacaaccac tggttcgatg gcatggccct gattcactct 180
tttaccttca aggatggtga cgtgtactac cgatctaagt tccttcgatc cgacaccttc 240
cagaagaaca ctaaggctaa caagattgtt gtgtctgagt ttggcaccat gatttaccct 300
gacccctgca agaacatgtt ttccaaggct ttctcctacc tccttgctgc catccctgac 360
ttcaccgata acaacctgat taacattatc cgatacggtg aggactacta cgcctcttcc 420
gagatcaact acatcaacca gattgaccct gttaccctgg aggtgattgg aaagatgaac 480
taccgaaagc acatttctct gaaccttgct actgcccacc ctcactacga cgaggaggga 540
aacacttaca acatgggaat cgccctcatg cgatttggca tgcccaagta cgtcatcttc 600
aaggttcctg tcgatgcttc tgataaggag ggcaagaagc ctgcccttga ggaggtggag 660
caggtctgca acattccctt tcgatctacc ctcttcccct cttacttcca ctcttttggc 720
atgtctgaga actacatcat ctttgtcgag cagcctttca agctggacat cctccgactg 780
gccactgcta acttccgagg atctacctgg ggttcctgcc tgaagtacga caaggaggac 840
attactctca tccacctggt cgacaagaag actggtaagg ctgtttccac caagttctac 900
gctgatgctc tggttgtttt ccaccacatt aacgcctacg aggacgacaa ccacgtggtt 960
ttcgatatga tcacctacaa ggactccaac ctgtacgaga tgttctacct tgctaacatg 1020
cgagaggagt ctaacaagtt cattgaggac aaggtcaact tctcccagcc tatctgccag 1080
cgatttgtcc tccccctcaa cgttgacaag gataccacta agggaaccaa catggtgatg 1140
ctcaagaaca ctaccgccaa ggccgtgatg caggatgacg gctctgtgta ctgcaagcct 1200
gacaccattt ttgctggtct tgagctccct ggcattaact acaagttcaa cggcaagaag 1260
taccgatact tttacggctc tcgagtggag tggactccct tccctaacaa gattggaaag 1320
gtggacattc tgaccaagaa gcacattgag tggaccgagg aggagtgtta cccctctgag 1380
cccgtttttg ttgcctcccc cggagctatg gaggaggatg acggagtcat tctttcttct 1440
attgtctctc tcaaccctaa caagtccccc ttcatgcttg tcctcaacgc taagaacttt 1500
gaggagattg ctcgagcctc catcgatgcc tctgttcacc tcgatctcca cggactcttc 1560
attccctctc agaagactaa ctag 1584
<210> 17
<211> 531
<212> PRT
<213> 矛尾鱼(Latimeria chalumnae)
<400> 17
Met Gln Ser Leu Phe Gly Lys Asn Lys Arg Glu Cys Pro Glu Pro Ile
1 5 10 15
Lys Ala Glu Val Lys Gly Gln Ile Pro Ala Trp Leu Gln Gly Thr Leu
20 25 30
Leu Arg Asn Gly Pro Gly Met His Thr Val Gly Glu Thr Ser Tyr Asn
35 40 45
His Trp Phe Asp Gly Leu Ala Leu Met His Ser Phe Thr Phe Lys Asp
50 55 60
Gly Glu Val Phe Tyr Gln Ser Lys Tyr Leu Arg Ser Asp Thr Tyr Lys
65 70 75 80
Lys Asn Met Glu Ala Asn Arg Ile Val Val Ser Glu Phe Gly Thr Met
85 90 95
Ala Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Ile Phe Ser Lys Ala Phe Ser Tyr
100 105 110
Leu Ser His Thr Ile Pro Glu Phe Thr Asp Asn Cys Leu Ile Asn Ile
115 120 125
Met Lys Cys Gly Glu Asp Tyr Tyr Ala Val Thr Glu Thr Asn Phe Ile
130 135 140
Arg Lys Ile Asp Pro Lys Ser Leu Asp Thr Leu Glu Lys Val Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Lys Tyr Ile Ala Leu Asn Leu Ala Ser Ser His Pro His Tyr Asp
165 170 175
Ala Ala Gly Asp Thr Ile Asn Met Gly Thr Ser Ile Ala Asp Lys Gly
180 185 190
Lys Thr Lys Tyr Leu Ile Val Lys Ile Pro Asn Met Lys Pro Val Glu
195 200 205
Ser Glu Lys Lys Lys Lys Val Tyr Phe Lys Asn Leu Glu Val Leu Cys
210 215 220
Ser Ile Pro Ser His Gly Arg Leu Asn Pro Ser Tyr Tyr His Ser Phe
225 230 235 240
Gly Ile Thr Glu Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Gln Pro Phe Lys Leu
245 250 255
Asp Leu Leu Lys Leu Ala Thr Ala Tyr Phe Arg Gly Ile Asn Trp Ala
260 265 270
Ser Cys Leu Asn Phe His Ser Glu Asp Lys Thr Phe Ile His Ile Ile
275 280 285
Asp Arg Arg Thr Lys Thr Ser Val Ser Thr Lys Phe His Thr Asp Ala
290 295 300
Leu Val Leu Tyr His His Val Asn Ala Tyr Glu Glu Asp Gly His Val
305 310 315 320
Val Phe Asp Val Ile Ala Tyr Asn Asp Ser Ser Leu Tyr Asp Met Phe
325 330 335
Tyr Leu Ala Asn Val Arg Gln Glu Ser Ala Glu Phe Glu Ala Lys Asn
340 345 350
Thr Ser Ser Ser Lys Pro Ala Cys Arg Arg Phe Val Ile Pro Leu Gln
355 360 365
Pro Asp Lys Asp Ala Glu Leu Gly Thr Asn Leu Val Lys Leu Ala Ser
370 375 380
Thr Thr Ala Asp Ala Ile Lys Glu Lys Asp Ser Ile Tyr Cys His Pro
385 390 395 400
Glu Ile Leu Val Glu Asp Ile Glu Leu Pro Arg Ile Asn Tyr Asn Tyr
405 410 415
Asn Gly Lys Lys Tyr Arg Tyr Ile Tyr Val Thr Gly Ile Ala Trp Lys
420 425 430
Pro Ile Pro Thr Lys Ile Val Lys Phe Asp Thr Leu Thr Arg Lys Ser
435 440 445
Val Glu Trp Gln Glu Glu Asp Cys Trp Pro Ala Glu Pro Val Phe Val
450 455 460
Pro Ser Pro Asp Ala Lys Glu Glu Asp Asp Gly Ile Val Leu Ser Ser
465 470 475 480
Ile Val Cys Thr Ser Pro Asn Lys Phe Pro Phe Leu Leu Ile Leu Asp
485 490 495
Ala Lys Thr Phe Thr Glu Leu Ala Arg Ala Ser Ile Asn Ala Asp Val
500 505 510
His Leu Asp Leu His Gly Tyr Phe Ile Pro Glu Lys Lys Lys Ala Gln
515 520 525
Ile Thr His
530
<210> 18
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的LcBCO
<400> 18
atgcagtctc tgttcggtaa gaacaagcga gagtgtcctg agcccattaa ggctgaggtg 60
aagggtcaga ttcctgcttg gctccagggt actctccttc gaaacggccc tggcatgcac 120
accgttggcg agacttctta caaccactgg ttcgacggac tcgctcttat gcactccttc 180
acctttaagg atggtgaggt tttttaccag tctaagtacc tgcgatccga cacctacaag 240
aagaacatgg aggccaaccg aattgtcgtg tctgagttcg gaaccatggc ctaccccgat 300
ccctgcaaga acattttttc caaggctttt tcttaccttt ctcacaccat ccctgagttt 360
accgacaact gtctgatcaa cattatgaag tgtggtgagg attactacgc tgttactgag 420
actaacttca tccgaaagat tgatcccaag tccctcgaca ccctggagaa ggttgactac 480
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accattaaca tgggcacctc tatcgctgat aagggaaaga ctaagtacct gattgttaag 600
attcccaaca tgaagcccgt tgagtctgag aagaagaaga aggtctactt taagaacctg 660
gaggtgctct gctccatccc ttctcacgga cgacttaacc cttcttacta ccactccttt 720
ggcatcactg agaactacat cgttttcgtg gagcagccct ttaagctgga ccttctcaag 780
ctggccaccg cctacttccg aggtattaac tgggcctctt gtcttaactt ccactccgag 840
gacaagactt tcattcacat catcgatcga cgaaccaaga cctccgtttc cactaagttt 900
cacaccgatg ctctcgttct ttaccaccac gtcaacgctt acgaggagga tggccacgtt 960
gttttcgatg tcattgccta caacgactct tctctctacg atatgtttta cctcgccaac 1020
gttcgacagg agtctgccga gtttgaggct aagaacacct cttcctccaa gcctgcttgt 1080
cgacgatttg tcattcccct gcagcctgac aaggatgctg agctgggcac taacctggtc 1140
aagctcgctt ccactaccgc cgacgccatt aaggagaagg actccattta ctgccaccct 1200
gagatcctgg ttgaggatat tgagctccct cgaattaact acaactacaa cggcaagaag 1260
taccgataca tttacgttac tggtatcgcc tggaagccca ttcccactaa gattgtcaag 1320
tttgacactc tcactcgaaa gtccgtggag tggcaggagg aggactgttg gcccgccgag 1380
cctgtctttg ttccttcccc cgatgccaag gaggaggacg atggtattgt tctttcttcc 1440
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atccctgaga agaagaaggc ccagatcacc cactag 1596
<210> 19
<211> 325
<212> PRT
<213> 藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 19
Met Thr Thr Lys Tyr Thr Ser Val His Glu Ser Pro Asn Gly Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ala Arg Pro Thr Ala Ser Gln Ile Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Glu
20 25 30
Gly Glu Leu Ser Gly Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Cys Ser Ser Gly
35 40 45
Ile Gly Val Glu Thr Ala Arg Ala Ile Tyr Arg Thr Gly Ala Thr Leu
50 55 60
Tyr Leu Thr Ala Arg Asp Val Asp Lys Ala Lys Thr Val Leu Pro Asp
65 70 75 80
Leu Val Asp Thr Ser Arg Val His Phe Leu His Leu Asp Leu Asn Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Val Arg Gly Phe Ala Glu Asn Phe Lys Ser Lys Ser Thr
100 105 110
Gln Leu His Ile Leu Ile Glu Asn Ala Gly Val Met Ala Cys Pro Glu
115 120 125
Gly Arg Thr Val Asp Gly Phe Glu Thr Gln Phe Gly Ile Asn His Leu
130 135 140
Ala His Phe Leu Leu Phe Tyr Leu Leu Lys Asp Thr Leu Leu Asn Ser
145 150 155 160
Ser Thr Pro Ala Phe Asn Ser Arg Val Val Ile Leu Ser Ser Cys Ala
165 170 175
His Gln Ala Gly Ser Val His Leu Asn Asn Leu Ser Leu Glu Gly Gly
180 185 190
Tyr Glu Pro Trp Lys Ser Tyr Gly Gln Ser Lys Thr Ala Asn Leu Trp
195 200 205
Thr Ala Arg Glu Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ala Ser Gly Ile His Ser
210 215 220
Trp Ala Val His Pro Gly Ser Ile Ala Thr Glu Leu Gln Arg His Val
225 230 235 240
Ser Asp Glu Leu Lys Gln Lys Trp Ala Asp Asp Lys Glu Gly Ala Lys
245 250 255
Leu Trp Lys Ser Thr Glu Gln Gly Ala Ala Thr Thr Val Leu Ala Ala
260 265 270
Val Ser Pro Glu Leu Glu Gly Lys Gly Gly Leu Tyr Leu Glu Asp Thr
275 280 285
Gln Val Ala Lys Pro Pro Ala Arg Gly Met Phe Gly Val Ala Asp Trp
290 295 300
Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Pro Ser Lys Leu Trp Ala Lys Ser Leu Glu
305 310 315 320
Leu Leu Lys Leu Gln
325
<210> 20
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的FfRDH12
<400> 20
atgaccacta agtacacttc cgttcacgag tctcccaacg gccctggtga cgctcgaccc 60
accgcttccc agattatcga cgattacaac cttgagggag agctttctgg caagactgtt 120
ctcgtcaccg gctgttcctc tggtattggt gttgagactg cccgagctat ttaccgaact 180
ggtgccaccc tttacctcac tgcccgagat gtcgataagg ccaagaccgt tcttcccgac 240
cttgttgaca cttcccgagt ccactttctc caccttgacc ttaactctct ggagtctgtt 300
cgaggttttg ctgagaactt caagtctaag tccactcagc ttcacattct catcgagaac 360
gctggcgtga tggcctgtcc cgagggccga accgtcgatg gttttgagac tcagtttggt 420
atcaaccacc ttgctcactt tctcctcttt tacctcctca aggataccct tctcaactct 480
tctacccccg ctttcaactc ccgagttgtc atcctctctt cttgtgctca ccaggctggt 540
tccgttcacc ttaacaacct gtctcttgag ggtggatacg agccttggaa gtcttacggc 600
cagtccaaga ctgccaacct ttggactgcc cgagagatcg agaagcgatt tggtgcttcc 660
ggtatccact cttgggctgt tcaccccggt tccatcgcta ctgagcttca gcgacacgtt 720
tccgacgagc ttaagcagaa gtgggctgac gataaggagg gtgccaagct gtggaagtcc 780
accgagcagg gtgccgccac cactgtcctt gctgctgttt cccctgagct tgagggtaag 840
ggcggtcttt accttgagga tacccaggtt gccaagcccc ctgcccgagg aatgtttggt 900
gttgctgact gggcttacga tgaggatggc ccctctaagc tctgggccaa gtctcttgag 960
ctccttaagc tccagtaa 978
<210> 21
<211> 525
<212> PRT
<213> 贝酵母(Saccharomyces bayanus)
<400> 21
Met Asn Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Ser Leu Val Gln Asp Glu Cys Leu
1 5 10 15
Ala Lys Met Ile Gln Asn Gly His Ser Arg Arg Met Gly Ser Val Glu
20 25 30
Asp Leu Tyr Ala Ala Leu Asn Arg Gln Lys Leu Tyr Arg Asn Phe Ser
35 40 45
Thr Tyr Ser Glu Leu Asn Asp Tyr Cys Thr Lys Asp Gln Leu Ala Leu
50 55 60
Ala Leu Arg Asn Ile Cys Leu Lys Asn Pro Thr Leu Leu His Ile Val
65 70 75 80
Leu Pro Ala Arg Trp Pro Asp His Glu Asn Tyr Tyr Leu Ser Ser Glu
85 90 95
Tyr Tyr Ser Gln Pro His Pro Lys His Asp Tyr Ile Ser Val Leu Pro
100 105 110
Glu Leu Lys Phe Asp Gly Val Ile Leu Asn Glu Gln Pro Glu His Asn
115 120 125
Ala Leu Met Lys Gln Ile Leu Glu Glu Leu Lys Asp Ser Asn Gly Ser
130 135 140
Tyr Thr Ala Lys Ile Phe Lys Leu Thr Thr Ala Leu Thr Ile Pro Tyr
145 150 155 160
Ala Gly Pro Thr Ser Pro Thr Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Glu Glu
165 170 175
Gly Tyr Thr Asp Lys Trp Lys Lys Phe Ile Phe Leu Ser Asn His Cys
180 185 190
Met Cys Asp Gly Arg Thr Ser Ile His Phe Phe Gln Asp Leu Arg Asp
195 200 205
Glu Leu Asn Asn Ile Lys Thr Pro Pro Lys Lys Leu Asp Tyr Ile Phe
210 215 220
Gln Tyr Glu Lys Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Lys Leu Pro Glu Pro Ile
225 230 235 240
Glu Asn Met Ile Asp Phe Arg Pro Pro Tyr Met Phe Ile Pro Lys Ser
245 250 255
Leu Ile Ser Gly Phe Ile Tyr Ser His Leu Arg Phe Ser Ser Lys Gly
260 265 270
Val Cys Thr Arg Met Asp Glu Leu Glu Lys Asn Asp Asp Ile Val Thr
275 280 285
Glu Ile Ile Thr Ile Ser Pro Ser Glu Leu Gln Lys Ile Arg Thr Lys
290 295 300
Ile Lys Ser Asn Ile Pro Gly Lys Cys Thr Ile Thr Pro Phe Leu Glu
305 310 315 320
Val Cys Trp Phe Val Ser Leu His Lys Trp Gly Lys Phe Phe Lys Pro
325 330 335
Leu Lys Phe Glu Trp Leu Thr Asp Val Phe Ile Pro Ala Asp Cys Arg
340 345 350
Ser Leu Leu Pro Glu Asp Glu Asp Val Arg Ala Met Tyr Arg Tyr Gly
355 360 365
Ala Asn Val Gly Phe Val Asp Phe Thr Pro Trp Ile Ser Glu Phe Asn
370 375 380
Met Asn Asp Ser Lys Glu Asn Phe Trp Pro Leu Ile Ala His Tyr His
385 390 395 400
Glu Val Ile Ser Gly Ala Ile Asn Asp Lys Lys His Leu Asn Gly Leu
405 410 415
Gly Phe Asn Ile Gln Gly Leu Val Gln Lys Tyr Val Asn Ile Asp Lys
420 425 430
Val Met Arg Asp Arg Ala Leu Gly Lys Ser Arg Gly Gly Thr Leu Leu
435 440 445
Ser Asn Val Gly Ile Phe His Gln Ser Glu Glu Thr Asp Ser Arg Tyr
450 455 460
Ser Ile Arg Asp Leu Ala Phe Gly Gln Phe Gln Gly Ser Trp His Gln
465 470 475 480
Ala Phe Ser Leu Gly Val Cys Ser Thr Asn Val Lys Gly Met Asn Ile
485 490 495
Val Ile Ser Ser Thr Lys Asn Ala Val Gly Ser Gln Glu Leu Leu Glu
500 505 510
Glu Leu Cys Ala Met Tyr Lys Ala Leu Leu Leu Asp Pro
515 520 525
<210> 22
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的SbATF1
<400> 22
atgaacacct actctgagaa gacctctctt gttcaggacg agtgtctggc taagatgatt 60
cagaacggtc actctcgacg aatgggctct gtcgaggacc tttacgccgc cctcaaccga 120
cagaagctct accgaaactt ctctacttac tctgagctga acgattactg cactaaggat 180
cagctcgctc ttgctctccg aaacatttgt ctgaagaacc ccactctcct tcacattgtt 240
cttcccgctc gatggcccga tcacgagaac tactaccttt cttctgagta ctactctcag 300
ccccacccca agcacgatta catctctgtt cttcccgagc tgaagttcga tggtgtgatt 360
ctcaacgagc agcccgagca caacgccctt atgaagcaga ttcttgagga gcttaaggat 420
tccaacggtt cttacactgc taagattttc aagctcacta ccgctctcac tattccctac 480
gctggtccca cttctcccac ttggcgactg atttgtctgc ccgaggaggg atacaccgat 540
aagtggaaga agtttatttt cctttccaac cactgcatgt gtgatggtcg aacctctatt 600
cacttctttc aggatctccg agatgagctt aacaacatca agactccccc caagaagctc 660
gactacattt tccagtacga gaaggactac cagcttctcc gaaagctccc cgagcccatt 720
gagaacatga ttgattttcg acccccctac atgtttattc ccaagtccct tatttccggc 780
ttcatttact cccaccttcg attctcctct aagggtgtgt gtacccgaat ggacgagctt 840
gagaagaacg acgatattgt tactgagatc atcaccatct ctccctctga gcttcagaag 900
attcgaacta agatcaagtc taacattccc ggcaagtgca ccatcactcc cttccttgag 960
gtttgttggt ttgtttctct ccacaagtgg ggcaagtttt tcaagcccct caagttcgag 1020
tggcttaccg atgtttttat tcccgctgat tgccgatctc tgctccccga ggacgaggac 1080
gtgcgagcta tgtaccgata cggcgctaac gtcggttttg ttgacttcac tccctggatt 1140
tctgagttta acatgaacga ctctaaggag aacttctggc cccttattgc tcactaccac 1200
gaggttattt ctggtgccat caacgacaag aagcacctca acggtcttgg tttcaacatt 1260
cagggccttg tccagaagta cgtcaacatt gacaaggtga tgcgagatcg agcccttggt 1320
aagtcccgag gaggcaccct gctctctaac gtgggtattt tccaccagtc tgaggagact 1380
gactcccgat actctatccg agacctcgct ttcggtcagt ttcagggttc ttggcaccag 1440
gctttctctc tcggtgtttg ttccactaac gtgaagggaa tgaacattgt tatttcttcc 1500
actaagaacg ccgtgggttc ccaggagctc cttgaggagc tttgtgccat gtacaaggct 1560
ctgctccttg acccctaa 1578
<210> 23
<211> 391
<212> PRT
<213> 草莓(Fragaria x ananassa）
<400> 23
Met Ser Tyr Lys Asn Asn His Ser Ile Leu Ser Lys Pro Asn Asp Pro
1 5 10 15
Val Glu Val Ile Arg Asp Ala Leu Ser Lys Ala Leu Gln Phe Tyr Tyr
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Arg Leu Arg Glu Gly Pro Asn Lys Lys Leu Met Val
35 40 45
Asp Cys Thr Gly Glu Gly Ile Leu Phe Val Glu Ala Asn Ala Glu Val
50 55 60
Thr Leu Asp Glu Leu Gly Asp Ala Ile Leu Pro Pro Cys Pro Phe Leu
65 70 75 80
Asp Gly Phe Leu Phe Asn Val Pro Gly Ser Asp Gly Ile Leu Gly Ser
85 90 95
Pro Leu Cys Leu Ile Gln Val Thr Arg Leu Ser Cys Gly Gly Phe Ile
100 105 110
Phe Ala Leu Arg Leu Asn His Thr Ile Cys Asp Ala Leu Gly Leu Val
115 120 125
Gln Phe Leu Asn Ala Val Gly Glu Ile Ala Gln Gly Lys Tyr Ala Pro
130 135 140
Ser Ile Thr Pro Val Trp Glu Arg Glu Leu Leu Ser Ala Arg Asp Pro
145 150 155 160
Pro Arg Ile Ser Cys Thr His Glu Glu Phe Asp Asp Ser Ile Asp His
165 170 175
Ser Tyr Pro Asn Tyr Gly Ala Thr Val Gln Gln Cys Tyr Cys Phe Gly
180 185 190
Pro Lys Glu Ile Lys Ser Leu Arg Glu His Leu Pro Pro His Leu Ser
195 200 205
Thr Cys Ser Ser Thr Phe Glu Leu Ile Thr Ala Cys Val Trp Lys Cys
210 215 220
Arg Thr Ile Ser Leu Asp Met Asp Pro Glu Gln Ile Val Arg Leu Ser
225 230 235 240
Cys Val Val Thr Ala Leu Gly Lys His Asn Asn Val Cys Leu Pro Leu
245 250 255
Gly Tyr Tyr Gly Asn Thr Phe Thr Tyr Pro Ala Val Val Ser Thr Ala
260 265 270
Glu Arg Leu Cys Asn Ser Pro Leu Gly Tyr Ala Val Glu Leu Val Lys
275 280 285
Lys Ser Lys Ala Lys Met Ser Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ala Ile Asp
290 295 300
Phe Val Glu Val Arg Gly Arg Pro Pro Phe Ala Leu Glu Gly Met Ser
305 310 315 320
Asp Phe Leu Val Ser Asp Asn Thr Arg Thr Gly Leu Gly Glu Ile Asp
325 330 335
Phe Gly Phe Gly Lys Pro Val Tyr Ala Gly Val Ala Lys Ser Thr Asp
340 345 350
Leu Ile Ser Phe Tyr Val Arg Ser Thr Asn Lys Glu Glu Arg Glu Ile
355 360 365
Leu Val Pro Val Cys Leu Pro Ile Leu Ser Met Glu Ile Phe Gln Gln
370 375 380
Glu Leu Lys Lys Met Ile Gly
385 390
<210> 24
<211> 1176
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的FaATF
<400> 24
atgtcttaca agaacaacca ctctattctg tctaagccta acgaccctgt cgaggtgatt 60
cgagatgccc tgtccaaggc ccttcagttt tactaccctc tcgctggacg actccgagag 120
ggtcccaaca agaagctcat ggtggactgc actggtgagg gaatcctctt tgttgaggct 180
aacgctgagg tcactctcga tgagctcggc gatgctatcc ttcccccttg tcctttcctt 240
gacggttttc tctttaacgt gcccggttct gacggtattc ttggttctcc tctctgtctt 300
attcaggtca ctcgactctc ttgtggaggt tttatttttg ctctgcgact taaccacact 360
atttgcgatg ctctgggtct tgttcagttt ctcaacgctg ttggcgagat tgcccaggga 420
aagtacgctc cttctattac ccctgtttgg gagcgagagc tcctctctgc ccgagaccct 480
ccccgaattt cctgtactca cgaggagttt gacgattcta ttgaccactc ttaccctaac 540
tacggtgcta ccgttcagca gtgttactgt tttggtccca aggagatcaa gtcccttcga 600
gagcaccttc cccctcacct ttctacttgt tcttccactt tcgagcttat tactgcttgt 660
gtgtggaagt gccgaactat ctctctcgat atggaccctg agcagattgt ccgactctct 720
tgcgttgtta ctgctcttgg taagcacaac aacgtttgtc tccctctcgg atactacgga 780
aacactttca cttaccctgc tgttgtttct actgccgagc gactttgtaa ctctcccctg 840
ggttacgctg tggagcttgt caagaagtcc aaggctaaga tgtctgagga gtaccttcga 900
tctgctattg actttgtcga ggttcgagga cgacccccct ttgctcttga gggtatgtct 960
gacttccttg tttccgataa cactcgaact ggtcttggtg agattgactt tggcttcgga 1020
aagcctgttt acgctggagt tgccaagtcc accgatctca tctcctttta cgtccgatcc 1080
actaacaagg aggagcgaga gattcttgtc cctgtttgcc ttcccattct gtctatggag 1140
atttttcagc aggagctcaa gaagatgatt ggttaa 1176
<210> 25
<211> 219
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 25
Met Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Val Asp Ile Ser Gln Trp
1 5 10 15
His Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gln Ser Val Ala Gln Cys Thr
20 25 30
Tyr Asn Gln Thr Val Gln Leu Asp Ile Thr Ala Phe Leu Lys Thr Val
35 40 45
Lys Lys Asn Lys His Lys Phe Tyr Pro Ala Phe Ile His Ile Leu Ala
50 55 60
Arg Leu Met Asn Ala His Pro Glu Phe Arg Met Ala Met Lys Asp Gly
65 70 75 80
Glu Leu Val Ile Trp Asp Ser Val His Pro Cys Tyr Thr Val Phe His
85 90 95
Glu Gln Thr Glu Thr Phe Ser Ser Leu Trp Ser Glu Tyr His Asp Asp
100 105 110
Phe Arg Gln Phe Leu His Ile Tyr Ser Gln Asp Val Ala Cys Tyr Gly
115 120 125
Glu Asn Leu Ala Tyr Phe Pro Lys Gly Phe Ile Glu Asn Met Phe Phe
130 135 140
Val Ser Ala Asn Pro Trp Val Ser Phe Thr Ser Phe Asp Leu Asn Val
145 150 155 160
Ala Asn Met Asp Asn Phe Phe Ala Pro Val Phe Thr Met Gly Lys Tyr
165 170 175
Tyr Thr Gln Gly Asp Lys Val Leu Met Pro Leu Ala Ile Gln Val His
180 185 190
His Ala Val Cys Asp Gly Phe His Val Gly Arg Met Leu Asn Glu Leu
195 200 205
Gln Gln Tyr Cys Asp Glu Trp Gln Gly Gly Ala
210 215
<210> 26
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的EcCAT
<400> 26
atggagaaga agattactgg ttacaccact gtcgatattt ctcagtggca ccgaaaggag 60
cactttgagg cttttcagtc tgttgctcag tgtacttaca accagaccgt tcagctcgat 120
attaccgctt tccttaagac tgtcaagaag aacaagcaca agttttaccc tgcctttatt 180
cacattcttg cccgactgat gaacgctcac cctgagttcc gaatggctat gaaggatggt 240
gagctcgtga tttgggattc tgttcaccct tgttacaccg tttttcacga gcagactgag 300
actttctctt ccctctggtc tgagtaccac gatgacttcc gacagttcct tcacatttac 360
tctcaggatg tcgcctgtta cggtgagaac ctggcttact tccctaaggg ttttattgag 420
aacatgtttt tcgtgtctgc taacccctgg gtttccttca cctcttttga ccttaacgtg 480
gctaacatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcactatgg gaaagtacta cactcagggc 540
gacaaggtgc tcatgcccct ggccattcag gttcaccacg ctgtctgtga tggctttcac 600
gtcggtcgaa tgcttaacga gcttcagcag tactgcgatg agtggcaggg cggcgcttag 660
<210> 27
<211> 363
<212> PRT
<213> 卫矛(Euonymus alatus)
<400> 27
Met Met Asp Ala His Gln Glu Ile Lys Asn Phe Ile Lys Val Trp Val
1 5 10 15
Gln Ala Met Val Cys Leu Ser Tyr Ala Tyr Tyr Phe Ser Ser Arg Leu
20 25 30
Pro Lys Gly Leu Leu Arg Leu Leu Ser Leu Leu Pro Val Leu Tyr Leu
35 40 45
Leu Leu Ile Ala Pro Leu Asn Ile Ser Ser Phe Ile Leu Ser Ser Ile
50 55 60
Thr Gly Phe Phe Leu Ala Trp Leu Thr Thr Phe Lys Val Ile Ser Phe
65 70 75 80
Ala Phe Asp Gln Gly Pro Leu Tyr Pro Leu Pro Gln Asn Leu Leu His
85 90 95
Phe Ile Ser Ile Ala Cys Leu Pro Ile Thr Ile Lys Arg Asn Pro Ser
100 105 110
Pro Lys Leu Lys Ser Thr Thr Asn Pro Ser Pro Ile Ser His Leu Leu
115 120 125
Lys Lys Ala Phe Met Ser Phe Pro Ser Lys Val Leu Phe His Trp Val
130 135 140
Ile Ala His Leu Tyr Gln Tyr Lys Lys Tyr Met Asp Pro Asn Val Val
145 150 155 160
Leu Val Ile Tyr Cys Cys His Val Tyr Val Met Leu Asp Ile Ser Leu
165 170 175
Ser Leu Cys Ala Thr Leu Ala Glu Phe Leu Cys Gly Phe Asp Val Glu
180 185 190
Pro Gln Phe Lys Glu Pro Tyr Leu Ala Thr Ser Leu Gln Asp Phe Trp
195 200 205
Gly Arg Arg Trp Asn Ile Ile Val Ser Ser Val Leu Arg Ser Thr Val
210 215 220
Tyr Ala Pro Thr Arg Asn Ile Ala Ser Tyr Leu Ile Gly Ser Arg Trp
225 230 235 240
Ala Tyr Phe Pro Ala Ile Ile Ala Thr Phe Val Val Ser Gly Val Met
245 250 255
His Asp Val Val Tyr Tyr Val Tyr Met Met His Met Tyr Pro Lys Trp
260 265 270
Asp Met Thr Gly His Phe Val Leu His Gly Ile Cys Glu Ala Leu Glu
275 280 285
Val Glu Met Lys Cys Lys Arg Ser Arg Ser Asp Lys Trp Arg Arg His
290 295 300
Pro Ala Val Asp Trp Val Met Val Met Gly Phe Val Met Gly Thr Ser
305 310 315 320
Val Ser Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Arg Asp Asn Val Asp Gln Ile
325 330 335
Val Ala Glu Glu Tyr Ser Ile Leu Phe Asn Phe Val Arg Glu Lys Ile
340 345 350
Val Met Leu Gly Thr Arg Phe Val Cys Gly Asn
355 360
<210> 28
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的EaCAcT
<400> 28
atgatggatg ctcaccagga gatcaagaac ttcatcaagg tttgggtgca ggctatggtg 60
tgtctttctt acgcttacta cttctcctct cgacttccca agggactcct tcgacttctc 120
tctcttctcc ctgttcttta ccttctcctt atcgctcccc ttaacatttc ctctttcatt 180
ctttcttcta tcaccggctt cttccttgct tggcttacca ctttcaaggt catctctttt 240
gctttcgatc agggtcctct ctaccctctc cctcagaacc tccttcactt catttccatt 300
gcttgtctcc ctatcactat caagcgaaac ccctctccta agctcaagtc caccactaac 360
ccttctccta tttctcacct tctcaagaag gcttttatgt cttttccctc taaggttctt 420
ttccactggg tcattgctca cctttaccag tacaagaagt acatggaccc taacgtggtc 480
ctcgttatct actgttgtca cgtttacgtt atgcttgaca tttctctctc tctgtgtgct 540
accctggctg agtttctctg tggttttgac gttgagcctc agtttaagga gccttacctt 600
gctacttctc ttcaggactt ttggggccga cgatggaaca ttattgtctc ttctgtcctg 660
cgatccactg tttacgctcc cactcgaaac attgcttctt accttattgg atctcgatgg 720
gcttactttc ccgctattat tgctactttc gttgtgtctg gagttatgca cgatgtcgtg 780
tactacgttt acatgatgca catgtaccct aagtgggata tgactggtca cttcgtcctt 840
cacggaattt gtgaggctct ggaggtggag atgaagtgta agcgatctcg atctgacaag 900
tggcgacgac accctgctgt cgattgggtg atggtgatgg gttttgtcat gggtacttct 960
gtttccctcc ttttcgtccc tctccttcga gataacgtcg atcagattgt tgctgaggag 1020
tactctattc tctttaactt tgttcgagag aagattgtca tgcttggtac tcgatttgtc 1080
tgtggaaact aa 1092
<210> 29
<211> 459
<212> PRT
<213> 苹果(Malus domestica)
<400> 29
Met Met Pro Phe Ser Val Leu Gln Val Lys Arg Leu Gln Leu Glu Leu
1 5 10 15
Ile Thr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Gln Glu Ala Lys Phe Leu Ser Asp
20 25 30
Ile Asp Asp Gln Glu Gly Leu Arg Phe Gln Val Pro Val Ile Met Cys
35 40 45
Tyr Lys Asp Asn Pro Ser Leu Asn Lys Asn Cys Asn Pro Val Lys Val
50 55 60
Ile Arg Glu Ala Leu Ser Arg Ala Leu Val Tyr Tyr Tyr Pro Leu Ala
65 70 75 80
Gly Arg Leu Lys Glu Gly Pro Asn Arg Lys Leu Met Val Asp Cys Asn
85 90 95
Gly Glu Gly Ile Leu Phe Val Glu Ala Ser Ala Asp Val Thr Leu Glu
100 105 110
Gln Leu Gly Asp Lys Ile Leu Pro Pro Cys Pro Leu Leu Glu Glu Phe
115 120 125
Leu Phe Asn Phe Pro Gly Ser Asp Gly Ile Ile Gly Cys Pro Leu Leu
130 135 140
Leu Val Gln Val Thr Cys Leu Thr Cys Gly Gly Phe Ile Leu Ala Leu
145 150 155 160
Arg Val Asn His Thr Met Cys Asp Ala Pro Gly Leu Leu Leu Phe Leu
165 170 175
Thr Ala Ile Ala Glu Met Ala Arg Gly Ala His Ala Pro Ser Ile Leu
180 185 190
Pro Val Trp Glu Arg Glu Leu Leu Phe Ser Arg Asp Pro Pro Arg Ile
195 200 205
Thr Cys Ala His His Glu Tyr Glu Asp Val Ile Asp His Ser Asp Gly
210 215 220
Leu Tyr Ala Ser Ser Asn Gln Ser Asn Met Val Gln Arg Ser Phe Tyr
225 230 235 240
Phe Gly Ala Lys Glu Met Arg Val Leu Arg Lys Gln Ile Pro Pro His
245 250 255
Leu Ile Ser Thr Cys Ser Thr Phe Asp Leu Ile Thr Ala Cys Leu Trp
260 265 270
Lys Cys Arg Thr Leu Ala Leu Asn Ile Asn Pro Lys Glu Ala Val Arg
275 280 285
Val Ser Cys Ile Val Asn Ala Arg Gly Lys His Asn Asn Val Arg Leu
290 295 300
Pro Leu Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ala Phe Pro Ala Ala Ile Ser
305 310 315 320
Lys Ala Glu Pro Leu Cys Lys Asn Pro Leu Gly Tyr Ala Leu Glu Leu
325 330 335
Val Lys Lys Ala Lys Ala Thr Met Asn Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Val
340 345 350
Ala Asp Leu Leu Val Leu Arg Gly Arg Pro Gln Tyr Ser Ser Thr Gly
355 360 365
Ser Tyr Leu Ile Val Ser Asp Asn Thr Arg Ala Gly Phe Gly Asp Val
370 375 380
Asn Phe Gly Trp Gly Gln Pro Val Phe Ala Gly Pro Ala Lys Ala Leu
385 390 395 400
Asp Leu Ile Ser Phe Tyr Val Gln His Lys Asn Asn Thr Glu Asp Gly
405 410 415
Ile Leu Val Pro Met Cys Leu Pro Ser Ser Ala Met Glu Arg Phe Gln
420 425 430
Gln Glu Leu Glu Arg Ile Thr Gln Glu Pro Lys Glu Asp Ile Cys Asn
435 440 445
Asn Leu Arg Ser Thr Arg Ile Met Ser Met Met
450 455
<210> 30
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的MdATF
<400> 30
atgatgccct tctctgttct ccaggttaag cgacttcagc ttgagcttat tacccctgcc 60
aagcccactc tccaggaggc taagtttctc tctgacatcg acgatcagga gggccttcga 120
tttcaggttc ctgtcattat gtgttacaag gataaccctt ctcttaacaa gaactgtaac 180
cctgttaagg tgattcgaga ggctctttcc cgagctcttg tttactacta ccctctcgct 240
ggacgactta aggagggtcc taaccgaaag ctcatggtcg attgcaacgg tgagggtatt 300
ctgttcgttg aggcttctgc tgatgttacc cttgagcagc ttggtgataa gattcttccc 360
ccttgtcctc tccttgagga gttccttttc aactttcccg gttctgatgg tattattggt 420
tgtcctctcc ttctcgttca ggtcacttgc cttacctgtg gaggctttat tcttgccctt 480
cgagtcaacc acactatgtg tgatgctcct ggtctgctcc tgttcctgac cgccatcgct 540
gagatggccc gaggagctca cgctccttct attcttcccg tttgggagcg agagcttctc 600
ttttcccgag atccccctcg aattacttgt gctcaccacg agtacgagga cgttattgac 660
cactctgacg gtctttacgc ttcttccaac cagtctaaca tggttcagcg atctttctac 720
tttggtgcca aggagatgcg agttcttcga aagcagattc ctccccacct tatttctacc 780
tgctctacct ttgaccttat taccgcttgt ctttggaagt gtcgaaccct tgctcttaac 840
attaacccta aggaggctgt tcgagtttct tgcattgtta acgcccgagg aaagcacaac 900
aacgttcgac ttccccttgg ttactacgga aacgcttttg cttttcccgc tgctatctct 960
aaggccgagc ctctctgtaa gaaccccctt ggttacgctc ttgagcttgt caagaaggct 1020
aaggctacta tgaacgagga gtaccttcga tctgtggctg atctccttgt tcttcgagga 1080
cgacctcagt actcttctac cggatcttac cttattgttt ctgataacac ccgagctggt 1140
tttggtgatg ttaactttgg ttggggacag cccgtttttg ctggacccgc caaggccctt 1200
gaccttattt ccttctacgt tcagcacaag aacaacactg aggatggtat tcttgttcct 1260
atgtgtctcc cttcctccgc tatggagcga tttcagcagg agcttgagcg aattactcag 1320
gagcctaagg aggatatttg taacaacctt cgatctactc gaatcatgtc tatgatgtaa 1380
<210> 31
<211> 465
<212> PRT
<213> 矮牵牛(Petunia x hybrida)
<400> 31
Met Cys Pro Lys Leu Ala Arg Ile Asn Ser Tyr Met Gly Asn Thr Asp
1 5 10 15
Phe His Val Thr Val Lys Lys Lys Glu Val Val Ala Ala Val Leu Pro
20 25 30
Met His His Glu His Trp Leu Pro Met Ser Asn Leu Asp Leu Leu Leu
35 40 45
Pro Pro Leu Asp Phe Gly Val Phe Phe Cys Tyr Lys Arg Ser Lys Ile
50 55 60
Asn Asn Asp Thr Lys Asp Asp Asp Glu Thr Ile Lys Lys Ala Leu Ala
65 70 75 80
Glu Thr Leu Val Ser Phe Tyr Ala Leu Ala Gly Glu Val Val Phe Asn
85 90 95
Ser Leu Gly Glu Pro Glu Leu Leu Cys Asn Asn Arg Gly Val Asp Phe
100 105 110
Phe His Ala Tyr Ala Asp Ile Glu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Tyr His
115 120 125
Pro Asp Val Ser Val His Glu Lys Leu Ile Pro Ile Lys Lys His Gly
130 135 140
Val Leu Ser Val Gln Val Thr Gly Leu Lys Cys Gly Gly Ile Val Val
145 150 155 160
Gly Cys Thr Phe Asp His Arg Val Ala Asp Ala Tyr Ser Ala Asn Met
165 170 175
Phe Leu Val Ala Trp Ala Ala Ile Ala Arg Lys Asp Asn Asn Ile Asn
180 185 190
Thr Val Ile Pro Ser Phe Arg Arg Ser Leu Leu Asn Pro Arg Arg Pro
195 200 205
Pro Gln Phe Asp Asp Ser Phe Ile Asp Ser Thr Tyr Val Phe Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Pro Lys Gln Pro Asn Asp Val Leu Thr Ser Arg Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Ile Asn Ser Gln Glu Ile Asn Leu Leu Gln Ser Gln Ala Thr Arg Asn
245 250 255
Gly Ser Lys Arg Ser Lys Leu Glu Cys Phe Ser Ala Phe Leu Trp Lys
260 265 270
Thr Ile Ala Glu Gly Gly Ile Asp Asp Ser Lys Arg Cys Lys Leu Gly
275 280 285
Ile Val Val Asp Gly Arg Gln Arg Leu Arg His Asp Ser Ser Thr Thr
290 295 300
Met Lys Asn Tyr Phe Gly Asn Val Leu Ser Val Pro Tyr Thr Glu Ala
305 310 315 320
Ser Val Gly Gln Leu Lys Gln Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Asp Leu
325 330 335
Val His Thr Cys Leu Asp Asn Val Ala Asn Glu His His Phe Pro Ser
340 345 350
Leu Ile Asp Trp Val Glu Leu His Arg Pro Arg Gln Ala Ile Val Lys
355 360 365
Val Tyr Cys Lys Asp Glu Cys Asn Asp Glu Ala Ala Ile Val Val Ser
370 375 380
Ser Gly Leu Arg Phe Pro Leu Ser Gln Val Asn Phe Gly Trp Gly Cys
385 390 395 400
Pro Asp Phe Gly Ser Tyr Ile Phe Pro Trp Gly Gly Gln Thr Gly Tyr
405 410 415
Val Met Pro Met Pro Ser Pro Asn Lys Asn Gly Asp Trp Ile Val Tyr
420 425 430
Met His Leu Gln Lys Lys His Leu Asp Leu Val Glu Thr Arg Ala Pro
435 440 445
His Ile Phe His Pro Leu Thr Ala Cys Tyr Leu Asp Leu Thr Ala Thr
450 455 460
Tyr
465
<210> 32
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的PhATF
<400> 32
atgtgcccta agctcgctcg aattaactct tacatgggaa acactgactt tcacgttacc 60
gtcaagaaga aggaggttgt ggctgctgtt ctccctatgc accacgagca ctggcttccc 120
atgtccaacc ttgaccttct ccttccccct ctcgactttg gtgttttctt ctgctacaag 180
cgatctaaga ttaacaacga taccaaggat gacgatgaga ctattaagaa ggctcttgct 240
gagactctcg tttcttttta cgctcttgct ggagaggtgg ttttcaactc tctcggagag 300
cccgagcttc tctgtaacaa ccgaggagtt gatttctttc acgcttacgc tgatattgag 360
ctcaacaacc ttgaccttta ccaccccgat gtctctgttc acgagaagct gattcctatc 420
aagaagcacg gcgttctctc tgttcaggtc actggcctta agtgtggagg tatcgttgtt 480
ggatgcactt tcgatcaccg agttgctgat gcttactctg ctaacatgtt ccttgttgct 540
tgggctgcta ttgctcgaaa ggataacaac attaacactg ttatcccttc tttccgacga 600
tccctcctta accctcgacg acctccccag tttgacgatt cctttatcga ctccacctac 660
gttttccttt cttctccccc taagcagcct aacgatgtcc tcacttcccg agtgtactac 720
attaactctc aggagattaa cctccttcag tctcaggcta ctcgaaacgg atctaagcga 780
tctaagctgg agtgtttctc cgcctttctc tggaagacta ttgctgaggg aggtattgac 840
gattctaagc gatgtaagct cggaattgtt gtcgatggcc gacagcgact gcgacacgac 900
tcttctacca ccatgaagaa ctactttggc aacgttcttt ctgttcctta cactgaggct 960
tctgttggac agctcaagca gactcccctt ggtaaggttg ctgaccttgt tcacacttgc 1020
ctcgataacg ttgctaacga gcaccacttt ccctctctca ttgactgggt tgagcttcac 1080
cgacctcgac aggctattgt taaggtttac tgtaaggatg agtgtaacga tgaggctgcc 1140
atcgttgtct cctctggact ccgatttccc ctttctcagg ttaactttgg ctggggctgt 1200
cctgactttg gctcttacat tttcccttgg ggcggtcaga ctggttacgt gatgcctatg 1260
ccttctccca acaagaacgg tgattggatt gtttacatgc accttcagaa gaagcacctt 1320
gaccttgtcg agactcgagc ccctcacatc ttccaccccc ttaccgcttg ttacctcgat 1380
ctcactgcta cttactaa 1398
<210> 33
<211> 559
<212> PRT
<213> Lachancea mirantina
<400> 33
Met Gly Asp Leu Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ala His Pro Glu Leu Ser
1 5 10 15
Glu Arg Pro Ser Ile Met Pro Ser Met Ser Asp Ile Gln Asp Pro Ser
20 25 30
Gly Asp Asp Lys Ala Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Gly Leu Pro Gln
35 40 45
Leu Glu Leu Ala Gly His Ala Arg Arg Leu Gly His Leu Glu Asn Phe
50 55 60
Phe Ala Val Gln His Arg Gln Gln Ile Tyr Ser Ser Phe Ala Val Phe
65 70 75 80
Cys Glu Phe Asp Thr Ala Cys Ser Leu Ala Gln Leu Ala Ser Ala Val
85 90 95
Arg Asn Val Cys Leu Ser Asn Pro Leu Leu Leu His Thr Val Glu Pro
100 105 110
Lys His Pro Asp Ile Ala Gly Phe Tyr His Ser Asp Glu Tyr Leu Ser
115 120 125
Arg Pro Trp Pro Gln His Asp Tyr Met Arg Val Leu Arg Glu Val His
130 135 140
Val Ala Asp Val Val Met Asn Gly Gln Lys Glu His Ala His Val Val
145 150 155 160
Arg Asp Ala Val Asp Val Phe Gln Ala His Gly Asn Gln Val Thr Ser
165 170 175
Glu Leu Leu Glu Leu Met Thr Gln Ile Glu Ile Pro His Ala Ser Gln
180 185 190
Thr Arg Pro Ser Trp Arg Leu Leu Cys Phe Pro His Gly Glu Ala Asn
195 200 205
Arg Trp Arg Thr Phe Ala Phe Val Ser Asn His Cys Ser Ser Asp Gly
210 215 220
Leu Ser Gly Leu Asn Phe Phe Arg Asp Leu Gln Lys Glu Leu Ala His
225 230 235 240
Gly Pro Thr Ser Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Ser Gly Val Ile
245 250 255
Phe Asp Tyr Ala Gln Asp Ala Ala Thr Leu Pro Lys Leu Pro Pro Pro
260 265 270
Ile Asp Gln Lys Leu Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Lys Ala Leu Leu Gly
275 280 285
Leu Leu Ala Gly Lys Phe Val Arg Glu Lys Leu Gly Tyr Val Ser Ala
290 295 300
Ala Pro Pro Thr Thr Pro Thr Ser Asp Leu Ala His Pro Glu Gly His
305 310 315 320
Gln Tyr Tyr Cys Tyr Leu Val Asn Val Pro Thr Ser Ser Val Ala His
325 330 335
Ile Lys Thr Gln Val Arg Glu Asn Val Pro His Lys Cys Thr Leu Thr
340 345 350
Pro Phe Leu Gln Ala Cys Trp Leu Val Ser Leu Phe Lys Tyr Gly Arg
355 360 365
Val Phe Ser Gly Ser Trp Leu Glu Arg Tyr Thr Asp Val Leu Val Ala
370 375 380
Met Asn Thr Arg Gln Leu Leu Pro Glu Asp Leu Glu Leu Gln Arg Gln
385 390 395 400
Tyr Arg Tyr Gly Ser Asn Val Gly Gly Val Arg Tyr Asn Tyr Pro Ile
405 410 415
Ala Pro Leu Asp Val Arg Asp Asn Asp Gln Lys Phe Trp Ser Leu Val
420 425 430
Glu Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Ser Asp Ala Arg Asp Lys Asn Asp Tyr
435 440 445
Leu Tyr Ala Leu Gly Ala Leu Met Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Lys
450 455 460
Asn Val Asp Ala Val Val Asn Asp Thr Ile Leu Asn Gln Arg Arg Ser
465 470 475 480
Gly Thr Leu Ile Ser Asn Val Gly Tyr Val Arg Asp Glu Gln Pro Thr
485 490 495
Ala Phe Ala Ile Lys Asn His Val Phe Ser Gln Gly Val Gly Ala Asn
500 505 510
Arg Asn Ala Phe Val Leu Asn Ile Cys Ala Thr Asp Gln Gly Gly Leu
515 520 525
Asn Ile Ala Ile Ser Ile Ala Lys Gly Thr Leu Ala Ser Arg Gln Glu
530 535 540
Gly Gln Glu Leu Cys Asp Ile Phe Lys Ser Thr Leu Leu Arg Phe
545 550 555
<210> 34
<211> 1680
<212> DNA
<213> Lachancea mirantina
<400> 34
atgggtgatc tcgacgcgag gggaacatca gcgcacccgg agctctcgga gaggccaagc 60
atcatgccct cgatgtcgga tatccaggac ccaagcggcg acgacaaggc cacgccccgc 120
ggctccgccg cggggctgcc gcagctcgag ctcgccggcc acgcccggcg cctgggccat 180
ttggagaatt tcttcgccgt ccagcaccgg cagcagatct attccagttt cgccgtgttc 240
tgcgagttcg acaccgcgtg ctcgctcgcg cagctcgcgt ccgctgtgcg aaacgtgtgt 300
ctttcgaacc cgctgctgct gcacaccgtc gagcccaagc acccggacat cgccggcttc 360
taccactccg acgaatatct gtcccgaccc tggccccagc acgactacat gcgcgttttg 420
cgcgaggtcc acgtcgccga cgtggtgatg aacggccaga aagagcacgc gcatgtcgtg 480
cgcgacgccg tcgacgtttt ccaagcgcat ggaaaccagg tcaccagcga gctgctcgag 540
ctcatgaccc agattgagat cccgcacgct tcccaaacga gacccagctg gaggttgctg 600
tgtttcccac acggcgaggc caaccggtgg cgcacgtttg cgtttgtatc caatcattgt 660
tccagcgacg gtctctcggg tctgaacttc tttcgggacc tgcaaaagga gctcgcgcac 720
ggccccacct cgggggcccc cggggccccg ggggcctccg gcgtcatctt cgactacgcc 780
caggacgccg caacactgcc caaactgccc ccacccattg accaaaaact cgattaccgt 840
ccgtccaaga aggccctttt gggacttttg gccggcaagt tcgtgcgtga aaaactcggc 900
tacgtatcgg ccgccccgcc aacgaccccg acctccgatt tggcgcaccc agaaggtcac 960
caatactact gctaccttgt aaacgtaccg acatctagtg tggcccacat caaaacgcaa 1020
gtgcgcgaaa atgtcccgca caaatgcacg ctgacgccat tcttacaggc atgctggctc 1080
gtgtcactgt tcaagtatgg tcgcgttttt tccggctcct ggctcgaacg atacacggac 1140
gttctcgtcg ctatgaacac ccggcaactg ttgcccgaag atttggaatt gcaacgccag 1200
taccgttacg gtagtaacgt gggaggggta cgttacaatt atccaatcgc accgctcgac 1260
gtccgcgaca acgaccagaa attctggtcc ctggtggaga gttaccgact ggcccttagc 1320
gacgcacgcg acaaaaatga ttacttgtac gcattgggtg ctctaatgct tccagagatc 1380
tacgaaaaaa aaaacgtcga tgctgtggtc aatgacacaa ttctgaacca gcgtcgttcc 1440
ggaacgttga tcagtaacgt cggctacgtg cgcgatgaac agcccactgc gtttgcaatt 1500
aagaatcatg tcttttcaca aggcgttggc gccaacagaa acgcatttgt gcttaacata 1560
tgtgccacgg accaaggcgg cctaaatatc gccatcagta tcgccaaggg aaccttggcg 1620
tctcgtcaag aaggccaaga actttgcgac atctttaaat caacgttact gcgattctaa 1680
<210> 35
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的LmATF1
<400> 35
atgggtgatc tcgatgcccg aggaacctct gctcaccccg agctctctga gcgaccttct 60
attatgcctt ctatgtctga tattcaggac ccttctggtg atgacaaggc tactccccga 120
ggatctgctg ctgggctgcc ccagcttgag cttgctggac acgcccgacg acttggccac 180
cttgagaact tctttgctgt ccagcaccga cagcagattt actcttcttt tgctgttttt 240
tgtgagtttg acactgcttg ttctctcgct cagcttgctt ctgctgtgcg aaacgtttgt 300
ctttctaacc cccttctcct tcacactgtt gagcctaagc accctgacat cgctggattc 360
taccactctg acgagtacct ttcccgacct tggcctcagc acgattacat gcgagttctt 420
cgagaggttc acgtcgctga cgttgttatg aacggacaga aggagcacgc tcacgttgtt 480
cgagatgctg ttgacgtttt tcaggctcac ggaaaccagg ttacttctga gctccttgag 540
cttatgactc agattgagat tcctcacgct tctcagactc gaccctcttg gcgacttctc 600
tgttttcccc acggagaggc taaccgatgg cgaacctttg cttttgtttc taaccactgt 660
tcttctgatg gtctttctgg tcttaacttc tttcgagatc tccagaagga gcttgctcac 720
ggccccacct ctggtgctcc tggtgccccc ggagcttccg gagttatttt cgattacgct 780
caggacgctg ctaccctgcc caagctgccc cctcccattg atcagaagct cgattaccga 840
ccttctaaga aggctcttct cggccttctc gctggcaagt tcgttcgaga gaagctcggt 900
tacgtttctg ctgctcctcc cactacccct acctctgacc ttgctcaccc tgagggtcac 960
cagtactact gttaccttgt taacgttccc acttcttctg ttgcccacat taagactcag 1020
gtgcgagaga acgttcctca caagtgtact ctcactccct ttctccaggc ttgttggctt 1080
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gttcgagata acgatcagaa gttctggtcc cttgttgagt cttaccgact tgccctttct 1320
gatgcccgag ataagaacga ttacctttac gctcttggtg ctcttatgct ccctgagatt 1380
tacgagaaga agaacgttga tgctgttgtt aacgatacca ttcttaacca gcgacgatct 1440
ggaaccctta tttctaacgt tggttacgtt cgagatgagc agcccactgc ttttgctatt 1500
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tgtgctaccg atcagggtgg tcttaacatc gctatttcta ttgctaaggg aacccttgct 1620
tctcgacagg agggacagga gctttgtgat atttttaagt ctactctcct tcgattttaa 1680
<210> 36
<211> 536
<212> PRT
<213> 酵郎香菌(Lachancea fermentata)
<400> 36
Met Ile Ile Ile Leu Thr Lys Pro Lys Phe Pro Ser Ser Asn Ser Arg
1 5 10 15
Ser Leu Glu Ile Lys Leu Asn Asn Met Pro Pro Gly Thr Leu Leu Arg
20 25 30
Glu Met Ile Glu Asn Gly His Ala Arg Pro Met Gly Ser Ile Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Gly Ile Phe Asn Arg Gln Lys Leu Tyr Arg Asn Phe Ser Met
50 55 60
Phe Ala Glu Ile Asn Asp Phe Cys Asn Glu Arg Gln Leu Arg Ala Ala
65 70 75 80
Leu Arg Asn Leu Cys Leu Lys Asn Pro Ile Leu Leu His Thr Ile Val
85 90 95
Pro Glu Ile Trp Pro Phe Asn Glu Lys Tyr Tyr Leu Ser Asp Glu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Met Pro Arg Ser Gln His Glu Phe Ile Ala Ile Leu Pro Glu
115 120 125
Leu Asp Leu Ser Asp Ile Leu Ala Asn Lys Gln Thr Gln Tyr Gln Gln
130 135 140
Val Leu Glu Lys Ala Phe Arg Glu Phe Glu Ser Ser Asn Phe Cys Tyr
145 150 155 160
Thr Ser Glu Val Tyr Lys Leu Ile Ala Thr Ile Ser Ile Pro Tyr Val
165 170 175
Gly Pro Ser Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Glu Lys Arg Gly Thr Glu
180 185 190
Trp Arg Lys Phe Ile Phe Ile Ser Asn His Cys Leu Cys Asp Gly Arg
195 200 205
Ser Ala Ala Asn Phe Phe His Asp Leu Lys Glu Glu Leu Asn Cys Asn
210 215 220
Ile Asp Asn Arg Leu Thr Val Thr Thr Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Asp
225 230 235 240
His Tyr Leu Leu Pro Lys Leu Pro Glu Pro Leu Glu Lys Arg Ile Asp
245 250 255
Phe Arg Pro Pro Trp Ser Tyr Phe Pro Lys Tyr Leu Val Trp Glu Pro
260 265 270
Ile Val Asn His Phe Lys Phe Ser Ser Asn Cys Ala Thr Ser Arg Leu
275 280 285
Asp Glu Ser Phe Asp Gly Lys Thr Leu Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ile
290 295 300
Asp Val Gln Val Leu Glu Lys Val Arg Gln Leu Ile Lys Ala Asn Val
305 310 315 320
His Glu Gly Gly Thr Ile Thr Pro Phe Leu Glu Ile Cys Trp Leu Ile
325 330 335
Ser Leu His Lys Trp Gly Ala Phe Ser Gly Lys Ser Trp Thr Lys Cys
340 345 350
Leu Thr Asp Val Phe Val Pro Val Asp Val Arg Asn Leu Leu Pro Asp
355 360 365
Asp Asp Asp Ile Arg Lys Ser Tyr Arg Tyr Gly Cys Asn Val Ala Ala
370 375 380
Ile Glu Leu Asn Pro Trp Ile Ser Gln Leu Asp Val Glu Lys Asn Ser
385 390 395 400
Asp Glu Phe Trp Ala Leu Val Ser Gln Asn Gln Asn Lys Ile Thr Ser
405 410 415
Leu Leu Gln Lys Lys Glu Gln Leu Asn Leu Ile Gly Phe Asn Thr Leu
420 425 430
Asp Ile Val Glu Lys Asn Phe Asn Leu Asp Arg Glu Leu Cys Val His
435 440 445
Thr Leu Asn Lys Pro Arg Gln Gly Thr Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ile
450 455 460
Phe Pro Gln Asn Ser Gln Glu Arg Asp Arg Tyr Ser Leu Glu Asn Leu
465 470 475 480
Ile Phe Gly Gln Phe Gln Gly Ser Phe Arg Glu Ser Phe Ser Met Cys
485 490 495
Val Cys Ser Thr Asp Arg Lys Gly Met Asn Ile Val Leu Thr Thr Thr
500 505 510
Ser Asp Leu Ile Pro Asn Ser Lys Ser Trp Glu Asp Leu Cys Ser Thr
515 520 525
Phe Lys Ser Ile Ile Ser Asp Thr
530 535
<210> 37
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的LfATF1
<400> 37
atgatcatta ttctcactaa gcctaagttc ccttcctcca actctcgatc cctggagatc 60
aagctgaaca acatgccccc tggtactctc ctgcgagaga tgatcgagaa cggacacgcc 120
cgacctatgg gctccattga gaacatttac ggaattttta accgacagaa gctctaccga 180
aacttttcta tgtttgccga gatcaacgac ttttgtaacg agcgacagct tcgagccgcc 240
ctgcgaaacc tgtgtcttaa gaaccctatt ctccttcaca ccattgtccc cgagatttgg 300
cctttcaacg agaagtacta cctgtctgac gagtactact gtatgcctcg atctcagcac 360
gagtttatcg ctattctgcc cgagctcgac ctgtccgata ttctggccaa caagcagacc 420
cagtaccagc aggttctgga gaaggctttc cgagagttcg agtcctccaa cttttgttac 480
acctctgagg tgtacaagct gattgctact atttctatcc cttacgtggg cccctcttgg 540
cgacttattt gcctccctga gaagcgagga accgagtggc gaaagttcat cttcatttcc 600
aaccactgtc tctgtgatgg tcgatccgcc gccaactttt tccacgacct gaaggaggag 660
ctgaactgta acattgacaa ccgacttacc gtcactacca ttttctctta cgagcgagat 720
cactaccttc tccccaagct gcccgagccc ctggagaagc gaattgattt ccgaccccct 780
tggtcttact ttcccaagta ccttgtctgg gagcccatcg tgaaccactt caagttctcc 840
tctaactgcg ctacttcccg actcgatgag tctttcgacg gtaagactct ccttaccgag 900
attattaaca ttgacgtgca ggtccttgag aaggttcgac agctcatcaa ggccaacgtg 960
cacgagggtg gtactatcac ccctttcctt gagatttgtt ggctcatttc ccttcacaag 1020
tggggagctt tctctggtaa gtcctggact aagtgcctca ccgatgtttt tgttcccgtc 1080
gatgtccgaa accttctccc tgacgacgat gacatccgaa agtcttaccg atacggctgt 1140
aacgttgctg ctatcgagct taacccttgg atctctcagc tcgatgtcga gaagaactcc 1200
gatgagtttt gggcccttgt ttcccagaac cagaacaaga tcacctccct cctccagaag 1260
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ctcgaccgag agctctgcgt ccacactctc aacaagcccc gacagggtac tctcctgtcc 1380
aacctgggta ttttccctca gaactcccag gagcgagatc gatactccct ggagaacctg 1440
atttttggtc agtttcaggg ttccttccga gagtctttct ctatgtgtgt ctgttccacc 1500
gatcgaaagg gaatgaacat tgttctcacc actacctctg atctcatccc caactccaag 1560
tcctgggagg acctttgctc taccttcaag tctattatct ccgacactta g 1611
<210> 38
<211> 515
<212> PRT
<213> 酵郎香菌
<400> 38
Met Tyr Glu Ser Leu Gln Thr Leu Ile Glu Arg Gly His Ala Arg Arg
1 5 10 15
Leu Gly His Val Glu Asn Tyr Phe Val Leu Ala Gln Arg Gln Asp Leu
20 25 30
Tyr Arg Val Phe Ala Tyr Tyr Gly Glu Phe Gly Glu Pro Cys Ser Leu
35 40 45
Arg Gln Leu Thr Gln Ala Leu Arg Ser Met Cys Leu Gln Gln Pro Val
50 55 60
Leu Leu Cys Gln Val Lys Pro Gln Glu Arg Pro Asp Leu Glu Leu Tyr
65 70 75 80
Tyr Arg Ser Glu Glu Tyr Leu Ser Thr Pro Gly Gln Asp Arg Asp Tyr
85 90 95
Ile Ala Leu Ala Asn Lys Val Arg Ile Ser Asp Val Leu Ile Asn Asn
100 105 110
Gln Thr Glu Tyr Ala Glu Val Met His Lys Val Met Glu Glu Tyr Glu
115 120 125
Ala Asn Gly His Asn Phe Thr Ser Lys Ile Phe Glu Ile Leu Ala Pro
130 135 140
Ile Arg Ile Ser His Thr Asp Pro Asn Lys Leu Asn Trp Arg Leu Leu
145 150 155 160
Ala Leu Pro Gly Glu Ile Pro Gly Glu Trp Asn Lys Phe Val Phe Leu
165 170 175
Ser Asn His Ile Leu Lys Asp Gly Ser Ser Gly Ala His Phe Phe Ile
180 185 190
Asp Leu Lys Asp Ser Leu Asn Ser Leu Pro Ser Asp Leu Gln Asp Thr
195 200 205
Asp Arg Ile Phe Asp Tyr Lys Ser Asp Tyr Lys Phe Val Lys Glu Ile
210 215 220
Pro Val Pro Ile Asp Glu Val Leu Asp Tyr Lys Pro Asn Leu Lys Gln
225 230 235 240
Ile Ala Asn Val Phe Ser Thr Gln Leu Val Arg Glu Lys Leu Gly Tyr
245 250 255
Leu Ser Pro Ala Pro Thr Ile Thr Arg Tyr Thr Asp Ala Glu Asn Asn
260 265 270
Thr Asn Glu Tyr His Thr Cys Phe Ile Asn Phe Thr Pro Glu Glu Val
275 280 285
Asp Ser Ile Lys Lys Lys Ile Lys Asp Arg Ala Gly Pro Ser Cys Thr
290 295 300
Met Thr Pro Phe Leu Gln Ala Cys Trp Leu Val Ser Leu Tyr Lys Ser
305 310 315 320
Gly Lys Val Phe Thr Lys Ser Phe Lys Glu Trp Phe Val Asp Met Met
325 330 335
Ile Pro Met Tyr Thr Pro Gln Met Leu Ser Asp Gly Glu Gln Thr Arg
340 345 350
Ala Asp Tyr Arg Tyr Gly Cys Asn Val Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Tyr
355 360 365
Leu Ile Ser Ser Leu Asn Val Gly Asn Asn Ser Lys Lys Phe Trp Lys
370 375 380
Leu Val Ser Tyr Tyr Asn Asp Val Phe Arg Asp Ser Lys Ala Ser Asn
385 390 395 400
Ser Tyr Leu Tyr Leu Ile Gly Met Ile Met Leu Asp Pro Ala Trp Lys
405 410 415
Glu Lys Asn Leu Asp Ala Thr Val Leu Gln Asn Leu Leu Gly Arg His
420 425 430
Arg Gln Gly Thr Val Leu Ser Asn Val Gly Phe Phe Ser Val Asn Gly
435 440 445
Glu Pro Gln Asp Ala Phe His Leu Lys Asn Leu Leu Phe Thr Gln Thr
450 455 460
Val Gly Ser Tyr Thr Phe Ala Phe Asn Leu Asn Val Cys Ser Thr Asp
465 470 475 480
Val Ala Gly Met Asn Val Gly Ala Ser Val Ser Lys Gly Thr Leu Pro
485 490 495
Thr Arg Asn Asp Trp Glu Glu Leu Cys Glu Ile Phe Lys Thr Thr Val
500 505 510
Leu Gln Met
515
<210> 39
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 耶氏酵母属密码子优化的LffATF1
<400> 39
atgtacgagt cccttcagac tctcatcgag cgaggacacg ctcgacgact cggccacgtg 60
gagaactact ttgttctcgc tcagcgacag gatctctacc gagttttcgc ttactacgga 120
gagttcggag agccttgctc ccttcgacag ctcactcagg ccctccgatc tatgtgtctt 180
cagcagcctg ttctgctctg ccaggtcaag ccccaggagc gacctgacct cgagctttac 240
taccgatctg aggagtacct gtctactccc ggacaggatc gagattacat cgctcttgct 300
aacaaggtgc gaatctccga tgtccttatc aacaaccaga ctgagtacgc tgaggtcatg 360
cacaaggtta tggaggagta cgaggctaac ggccacaact ttacctctaa gatttttgag 420
attctcgccc ctattcgaat ctctcacacc gatcccaaca agctgaactg gcgactcctt 480
gctcttcccg gagagatccc tggtgagtgg aacaagtttg tcttcctttc caaccacatt 540
cttaaggatg gctcctctgg cgctcacttt ttcattgatc tcaaggattc tctgaactct 600
ctcccttctg acctccagga taccgaccga attttcgatt acaagtccga ctacaagttt 660
gttaaggaga tccccgtccc tatcgatgag gttcttgact acaagcctaa ccttaagcag 720
attgctaacg tcttttctac tcagcttgtt cgagagaagc tgggttacct ctctcctgct 780
cctaccatta ctcgatacac cgatgctgag aacaacacta acgagtacca cacttgcttt 840
attaacttta cccctgagga ggttgattct atcaagaaga agattaagga tcgagccggc 900
ccttcttgca ctatgacccc tttccttcag gcttgctggc tggtttccct ttacaagtcc 960
ggcaaggttt tcactaagtc tttcaaggag tggttcgtgg acatgatgat ccctatgtac 1020
accccccaga tgctctctga cggcgagcag acccgagctg actaccgata cggctgtaac 1080
gttggaggta ctcgatacaa ctacctcatc tcctctctta acgttggaaa caactccaag 1140
aagttttgga agctggtttc ttactacaac gatgtcttcc gagactctaa ggcctccaac 1200
tcttaccttt accttatcgg aatgatcatg cttgaccctg cttggaagga gaagaacctg 1260
gacgccactg tccttcagaa cctccttggt cgacaccgac agggcactgt tctgtctaac 1320
gttggattct tttctgtgaa cggagagccc caggatgctt ttcaccttaa gaaccttctc 1380
tttacccaga ctgttggttc ttacaccttt gctttcaacc tcaacgtctg ctctactgac 1440
gtggccggaa tgaacgttgg cgcttctgtg tctaagggca ccctgcccac tcgaaacgac 1500
tgggaggagc tttgcgagat cttcaagact accgttctcc agatgtaa 1548
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MO11984
<400> 40
agtacataca gtcgtcgtag tgc 23
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MO11985
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cacacggtct caccgttttt ctgggccttg ag 32
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物MO11986
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cacacggtct caacggcatt cctttattat ctggcttaca actaca 46
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MO11987
<400> 43
cacacggtct cagtactact ccggtgacaa ggatttcc 38

Claims (11)

1.一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：
(a)立体选择性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，所述宿主细胞产生包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中由所述宿主细胞产生的所述混合物中反式视黄醛的百分比是至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％；以及
(b)乙酰转移酶(ATF)[EC 2.3.1.84]，优选地具有乙酰转移酶1(Atf1)活性的酶，所述酶催化视黄醇，优选地反式视黄醇转换为视黄醇乙酸酯混合物，其中基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇的总量，至少10％的百分比是乙酰化的视黄醇，即视黄醇乙酸酯。
2.根据权利要求1所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述乙酰转移酶[EC2.3.1.84]，优选地具有乙酰转移酶1活性的酶，催化视黄醇转换为视黄醇乙酸酯混合物，其中所述混合物包含至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的反式同种型视黄醇乙酸酯，诸如至少65-90％的反式同种型视黄醇乙酸酯。
3.根据权利要求1或2所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞还包含优选异源的视黄醇脱氢酶(RDH)[EC 1.1.1.105]，所述RDH能够将视黄醛转换为视黄醇，总转换率为至少约90％朝向视黄醇生成，优选地选自真菌，更优选地选自镰刀菌属(Fusarium)，诸如与根据SEQ ID NO:19的多肽具有至少60％同一性的多肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞还包含对内源性酰基转移酶活性的修饰，其中已经降低或消除了所述内源性酰基转移酶活性，优选地[EC 2.3.1]活性，更优选地酰基转移酶[EC 2.3.1.20]活性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述BCO选自真菌、植物或动物，优选地选自镰刀菌属、黑粉菌属(Ustilago)、番红花属(Crocus)、果蝇属(Drosophila)、短担尼鱼属(Danio)、真鮰属(Ictalurus)、狗鱼属(Esox)、矛尾鱼属(Latimeria)，更优选地选自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、番红花(Crocus sativus)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(Daniorerio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、白斑狗鱼(Esox lucius)、矛尾鱼(Latimeriachalumnae)，甚至更优选地选自与根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7的多肽具有至少约60％同一性的多肽或与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽序列具有至少约50％同一性的多肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述乙酰转移酶选自植物，动物，包括人，藻类，真菌，包括酵母，或细菌，优选地选自酵母属(Saccharomyces)、草莓属(Fragaria)、埃希氏菌属(Escherichia)、卫矛属(Euonymus)、苹果属(Malus)、矮牵牛属(Petunia)或拉茜斯酵母属(Lachancea)，更优选地选自与根据SEQID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQID NO:33、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的多肽具有至少约60％同一性的多肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞产生视黄醇乙酸酯混合物，所述视黄醇乙酸酯混合物包含至少约65％，优选地68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的反式视黄醇乙酸酯同种型，诸如至少65-90％的反式视黄醇乙酸酯同种型。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，诸如选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属(Paracoccus)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)和布拉霉属(Blakeslea)；优选地选自真菌，包括酵母，更优选地选自酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、须霉属、毛霉属、红酵母属、掷孢酵母属、法夫酵母属、发夫酵母属、布拉霉属和耶氏酵母属(Yarrowia)，最优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞在将β-胡萝卜素转换为维生素A的方法中的用途。
10.一种产生反式视黄醇乙酸酯的方法，所述方法包括在合适的培养条件下在水性培养基中培养根据权利要求1至9中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞；以及从所述培养基和/或宿主细胞分离并任选地进一步纯化所述反式视黄醇乙酸酯。
11.一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将编码立体选择性BCO、乙酰转移酶[EC 2.3.1.84]、任选地视黄醇脱氢酶[EC1.1.1.105]的核酸分子引入合适的宿主细胞中；
(b)任选地降低或消除(a)的所述细胞的内源性酰基转移酶活性[EC 2.3.1]；
(c)将β-胡萝卜素酶促转换为类视黄醇，基于所产生的类视黄醇的总量，所述类视黄醇包含至少10％的百分比的视黄醇乙酸酯，所述视黄醇乙酸酯包含至少65％的百分比的反式同种型；以及
(d)在合适的培养条件下将所述视黄醇乙酸酯转换为维生素A。
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