JP2022515041A - 新規なアセチルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
本発明は、レチノールの酵素的変換により産生されるレチニルアセテートの製造に関し、前記プロセスは、向上した活性を有する修飾酵素の使用を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、レチノールの酵素的変換を介して産生されるレチニルアセテートの製造に関し、前記プロセスは、向上した活性を有する修飾酵素の使用を含む。
レチニルアセテートは、レチノイド、特にビタミンＡなどの産生に重要な中間体又は前駆物質である。ビタミンＡなどのレチノイドは、食餌によって供給されなければならないヒトの健康に非常に重要且つ不可欠な栄養素の１つである。レチノイドは、とりわけ、視覚、免疫システム及び成長に関して、ヒトの健康を促進する。
レチノイド、特にビタミンＡ及びその前駆物質の現在の化学的製造法は、例えば、高エネルギー消費、複雑な精製工程及び／又は不要な副生成物など、いくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、レチノイド、特にビタミンＡ及びその前駆物質を製造するための、微生物変換工程を含み、より経済的なだけでなくエコロジカルである、アプローチが過去数十年にわたって研究されている。
一般に、レチノイドを産生する生体系は、産業的に扱い難く、且つ／又は工業的規模でのその単離が経済的利益から実現不可能であるような低レベルで化合物が生成される。これに関して、かかる生体系におけるレチノイドの不安定性又は副生成物の比較的高い生成など、いくつかの理由がある。
例えば、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）由来のＡｔｆ１の作用による、アスタキサンチン又はゼアキサンチンなどのカロテノイドのアセチル化が以前に報告されており（国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレット）、例えばゼアキサンチンのアセチル化は９０％までの範囲である。しかしながら、これらのアセチルトランスフェラーゼ酵素は通常、異なるアルコール基質に対して異なる基質特異性を有し、それはアセチル化される分子上のアルコール官能基の局所的な構造環境によって決定される。例えば、ゼアキサンチンなどのカロテノイドにおけるアセチル化されるべきヒドロキシ基は、β－イオノン環構造に位置し、レチノールにおけるアセチル化されるべきヒドロキシ基は、そのイオノン環構造上には位置しないが、分子のポリエン鎖の末端のＣＨ２炭素上の他の端に位置する。アセチル化ヒドロキシのこの異なる局所的分子状況のために、カロテノイドのアセチル化についてのデータからレチノールのアセチル化について予想をつけることは非常に難しい：実施例２に示すように、基質としてＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）由来のＡＴＦ１を使用した結果、ゼアキサンチンの９０％までのアセチル化と比較して、レチニルアセテートはわずか約１０％であった。
意外なことに、本発明者らは、アセチルトランスフェラーゼ、特にＡＴＦ１における特定のアミノ酸を修飾することによって、レチノイドのアセチル化、特にレチニルアセテートの形成を増強することができ、それぞれの野生型と比較して少なくとも約０．２倍、例えば約０．２～約４倍以上の範囲で増加し、特にレチニルアセテートの形成は、グルコース上でのそれぞれの宿主細胞の増殖によって得られる総レチノイドに対して少なくとも５０～９０％の範囲である。
特に、本発明は、配列番号１と少なくとも約２０％、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は１００％までの同一性を有する配列における、アミノ酸置換などの１つ又は複数の修飾を含む、レチニルアセテートへのレチノールのアセチル化に関与する修飾酵素、特に真菌酵素に関する。前記１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１によるポリペプチドにおいて６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置する。
レチノイドを産生するプロセスにおけるかかる修飾酵素の使用であって、前記修飾酵素が適切な宿主細胞、特にレチノール産生することができる真菌宿主細胞において発現される、特に異種発現される、使用によって、適切な培養条件下での８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０時間の、例えば流加培養プロセスなどにおいて、炭素源としてグルコースを用いた発酵で得られる非修飾宿主細胞と比較して、修飾宿主細胞に存在し／修飾宿主細胞によって産生される総レチノイドに対して、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５倍の範囲でレチニルアセテートが増加する、使用。
さらに意外なことには、レチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞における前記修飾アセチルトランスフェラーゼ、特にＡＴＦ１の発現は、前記宿主細胞により産生される総レチノイドの量を増加し、例えば、炭素源としてグルコースを用いた流加発酵、特に適切な培養条件下での８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０時間の流加発酵などで、本明細書で定義される相当する野生型／非修飾酵素を発現するが、同じ条件下で培養された宿主細胞と比較して、少なくとも約１、２、３、４、５、６倍を超えて総レチノイドが増加する。
修飾「アセチルトランスフェラーゼ」、「レチノールアセチル化酵素」、「レチノールアセチル化活性を有する酵素」、「ＡＴＦ」又は「ＡＴＦ１」という用語は、本明細書において区別なく使用され、レチニルアセテートへのレチノールの変換を触媒することができるＥＣ分類［ＥＣ２．３．１．８４］の酵素を意味し、特に総レチノイドに対してアセチル化型を少なくとも約５０～９０％を有する。
本発明による修飾ＡＴＦの産生に使用することができる適切な酵素は、［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］（モチーフは、ｈｔｔｐｓ：
／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ＿ｄｏｃ．ｈｔｍｌで定義される、Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにある）から選択される少なくとも７つのアミノ酸残基の高度に保存された部分アミノ酸配列を含む真菌酵素から入手可能であり、ここで、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、中央のヒスチジンは、酵素の結合ポケットの一部であり、好ましくは、７アミノ酸モチーフは、［ＮＤＥ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、より好ましくは［ＮＤ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、最も好ましくは配列番号１によるポリペプチドにおけるＮ２１８～Ｇ２２４位に相当するＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択される。かかる非修飾酵素の例は、ラカンセア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はウィッカーハモマイセス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）、特にＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、又はＷ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）、例えば配列番号１によるＬｍＡＴＦ１、配列番号５によるＳｂＡＴＦ、配列番号９によるＬｆＡＴＦ１、配列番号７によるＬｆｆＡＴＦ１、配列番号１１によるＷａ１ＡＴＦ１又は配列番号１３によるＷａ３ＡＴＦ１などの酵母から選択され得る。
／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ＿ｄｏｃ．ｈｔｍｌで定義される、Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにある）から選択される少なくとも７つのアミノ酸残基の高度に保存された部分アミノ酸配列を含む真菌酵素から入手可能であり、ここで、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、中央のヒスチジンは、酵素の結合ポケットの一部であり、好ましくは、７アミノ酸モチーフは、［ＮＤＥ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、より好ましくは［ＮＤ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、最も好ましくは配列番号１によるポリペプチドにおけるＮ２１８～Ｇ２２４位に相当するＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択される。かかる非修飾酵素の例は、ラカンセア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はウィッカーハモマイセス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）、特にＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、又はＷ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）、例えば配列番号１によるＬｍＡＴＦ１、配列番号５によるＳｂＡＴＦ、配列番号９によるＬｆＡＴＦ１、配列番号７によるＬｆｆＡＴＦ１、配列番号１１によるＷａ１ＡＴＦ１又は配列番号１３によるＷａ３ＡＴＦ１などの酵母から選択され得る。
本明細書で定義される修飾ＡＴＦは、例えば、限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、レチニルアセテートの産生に対して、特に少なくとも約５０％、好ましくは５２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５又はさらに１００％（前記宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量に対する）の変換率で、レチノールをレチニルアセテートへと変換することができる。好ましい修飾アイソフォームは、本明細書で定義される１つ又は複数の位置の１つ又は複数のアミノ酸置換を含む配列番号１と少なくとも２０％の同一性を有するポリペプチドなどのＡＴＦ１である。
本明細書で定義される酵素は、レチニルアセテートへのレチノールの変換で使用され、基質（つまり、レチノール）は、シス－レチノール、トランス－レチノール又はいずれかの可能な比率のシス－／トランス－レチノールのミックスであり得る。好ましくは、基質として使用されるレチノールミックスは、例えば宿主細胞における総レチノールに対してトランス異性体約６５～９８％など、高いパーセンテージのトランス－レチノールを有する。トランス－レチノール約６５～９８％を有する前記レチノールミックスのアセチル化によって、宿主細胞によって産生される総レチニルアセテートに対してトランス－レチニルアセテートとシス－レチニルアセテートのおよそ同じ比率を有するレチニルアセテートが生じると考えられる。
したがって、本発明は、本明細書で定義される修飾酵素を含み、且つ発現する、本明細書で定義される適切な宿主細胞を使用した、レチニルアセテートへのレチノールの変換に関し、そのレチノールは、トランス－レチノールとシス－レチノールのミックスであり、且つトランス－レチノールのパーセンテージが、総レチノールに対してトランス－レチノール約６５～９８％の範囲である。
レチノールの酵素的触媒と関連して「変換」、「酵素的変換」、「アセチル化」又は「酵素的アセチル化」という用語は、本明細書で区別なく使用され、本明細書で定義される修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の作用を意味する。
「変換率」という用語は、アセチル化型のパーセンテージ、つまり化合物のアセチル化型と非アセチル化型の比率、特にレチニルアセテートなどのレチノールのアセチル化型と、それぞれの宿主細胞中に存在する非アセチル化レチノイドとの比率を意味し、そのアセチル化は、本発明の修飾Ａｔｆ１酵素の作用から生じる。
本発明による適切な宿主細胞は、真菌宿主細胞を包含した。本明細書で使用される、「真菌宿主細胞」という用語は特に、酵母細胞を含み、その細胞は、レチノール産生宿主細胞、特にレチニルアセテート産生宿主細胞、例えばレチニルアセテート産生真菌宿主細胞、限定されないが、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）若しくはサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などである。
修飾ＡＴＦ酵素は単離形態で（例えば、無細胞システムにおいて）使用され得て、或いは、例えばレチノール産生宿主細胞、特に本明細書で定義される真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞において発現され得る。酵素は内因性酵素として、又は異種酵素として発現され得る。好ましくは、本明細書に記載の修飾酵素は、例えばレチノール産生宿主細胞、特に本明細書で定義される真菌宿主細胞などの適切な宿主細胞において異種酵素として導入及び発現される。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６８に相当する位置のアミノ酸置換を含み、例えばトレオニンによるグルタミンの置換を介してなど、前記残基にトレオニンを生じる（Ｑ６８Ｔ）。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えばグルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含むかかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノールに対して少なくとも約５５～７０％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６９及び／又は４０７及び／又は４０９及び／又は４８０に相当する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６９に相当する位置のアミノ酸置換を含み、例えばアスパラギン（Ｈ６９Ｎ）、セリン（Ｈ６９Ｓ）又はアラニン（Ｈ６９Ａ）（好ましくはＨ６９Ａ）によるヒスチジンの置換を介してなど、前記残基にアスパラギン、セリン又はアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含むかかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約６０～８４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基７２及び／又は３１１及び／又は３３４及び／又は４０７及び／又は４０９及び／又は４８０及び／又は４８４に相当する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基７２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アスパラギン（Ｑ７２Ｎ）又はリジン（Ｑ７２Ｋ）によるグルタミンの置換を介してなど、前記残基にアスパラギン又はリジンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含むかかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５～８１％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０７及び／又は４０９及び／又は４８０に相当する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基７３に相当する位置のアミノ酸置換を含み、ロイシン（Ｉ７３Ｌ）によるイソロイシンの置換を介してなど、前記残基にロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含むかかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基１７１に相当する位置のアミノ酸置換を含み、リジン（Ｇ１７１Ｋ）又はアスパラギン（Ｇ１７１Ｎ）によるグリシンの置換を介してなど、前記残基にリジン又はアスパラギンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５～５９％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
更なる一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基１７２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、グリシン（Ｎ１７２Ｇ）によるアスパラギンの置換を介してなど、前記残基にグリシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５３％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基１７４に相当する位置のアミノ酸置換を含み、イソロイシン（Ｖ１７４Ｉ）によるバリンの置換を介してなど、前記残基にイソロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基１７６に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｓ１７６Ａ）又はグリシン（Ｓ１７６Ｇ）によるセリンの置換を介してなど、前記残基にアラニン又はグリシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５～５７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基１７８に相当する位置のアミノ酸置換を含み、バリン（Ｌ１７８Ｖ）によるロイシンの置換を介してなど、前記残基にバリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５３％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基２９１に相当する位置のアミノ酸置換を含み、セリン（Ａ２９１Ｓ）又はグリシン（Ａ２９１Ｇ）によるアラニンの置換を介してなど、前記残基にセリン又はグリシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５１～５２％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基２９２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｇ２９２Ａ）、セリン（Ｇ２９２Ｓ）又はアスパラギン（Ｇ２９２Ｎ）によるグリシンの置換を介してなど、前記残基にアラニン、セリン、又はアスパラギンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５３～５７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基２９４に相当する位置のアミノ酸置換を含み、ロイシン（Ｆ２９４Ｌ）又はバリン（Ｆ２９４Ｖ）によるフェニルアラニンの置換を介してなど、前記残基にロイシン又はバリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５４～５８％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３０１に相当する位置のアミノ酸置換を含み、フェニルアラニン（Ｙ３０１Ｆ）によるチロシンの置換を介してなど、前記残基にフェニルアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３０７に相当する位置のアミノ酸置換を含み、イソロイシン（Ｐ３０７Ｉ）によるプロリンの置換を介してなど、前記残基にイソロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態に従って、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３０８に相当する位置のアミノ酸置換を含み、バリン（Ｔ３０８Ｖ）によるトレオニンの置換を介してなど、前記残基にバリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３１１に相当する位置のアミノ酸置換を含み、メチオニン（Ｔ３１１Ｍ）又はイソロイシン（Ｔ３１１Ｉ）によるトレオニンの置換を介してなど、前記残基にメチオニン又はイソロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５～８２％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０７及び／又は４０９及び／又は４８０に相当する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３１２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｓ３１２Ａ）によるセリンの置換を介してなど、前記残基にアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３２０に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アスパラギン（Ｈ３２０Ｎ）によるヒスチジンの置換を介してなど、前記残基にアスパラギンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３２２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、バリン（Ｙ３２２Ｖ）又はフェニルアラニン（Ｙ３２２Ｆ）によるチロシンの置換を介してなど、前記残基にバリン又はフェニルアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６～５７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
特定の一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３３４に相当する位置のアミノ酸置換を含み、ロイシン（Ｖ３３４Ｌ）によるバリンの置換を介してなど、前記残基にロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約６３～７８％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０７及び／又は４０９及び／又は４８０に相当する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３６２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｓ３６２Ａ）によるセリンの置換を介してなど、前記残基にアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０５に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｓ４０５Ａ）によるセリンの置換を介してなど、前記残基にアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約６１％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
特定の一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０７に相当する位置のアミノ酸置換を含み、イソロイシン（Ｖ４０７Ｉ）によるバリンの置換を介してなど、前記残基にイソロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６～８４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０９及び／又は４８０及び／又は４８４に相当する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
好ましい一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４０９に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｇ４０９Ａ）によるグリシンの置換を介してなど、前記残基にアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）又はＷ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約６３～８４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。相当する非修飾ＡＴＦ１酵素を用いた各プロセスと比較して、少なくとも約２０、３０、４０、５０、７０、１００、２００、３００％以上の範囲の、総レチノイドに対するレチニルアセテートのパーセンテージの増加が得られる。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４８０及び／又は４８４に相当する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の好ましい実施形態に従って、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４８０に相当する位置のアミノ酸置換を含み、グルタミン酸（Ｓ４８０Ｅ）、リジン（Ｓ４８０Ｌ）、メチオニン（Ｓ４８０Ｍ）、フェニルアラニン（Ｓ４８０Ｆ）又はグルタミン（Ｓ４８０Ｑ）によるセリンの置換を介してなど、前記残基にグルタミン酸、リジン、メチオニン、フェニルアラニン又はグルタミンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）又はＷ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５２～８４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。相当する非修飾ＡＴＦ１酵素を用いた各プロセスと比較して、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０％以上の範囲の、総レチノイドに対するレチニルアセテートのパーセンテージの増加が得られる。その変異はさらに、特に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４８４に相当する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換など、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態に従って、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４８３に相当する位置のアミノ酸置換を含み、バリン（Ｌ４８３Ｖ）によるロイシンの置換を介してなど、前記残基にバリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態に従って、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４８４に相当する位置のアミノ酸置換を含み、ロイシン（Ｉ４８４Ｌ）によるイソロイシンの置換を介してなど、前記残基にロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５８～８４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４９０に相当する位置のアミノ酸置換を含み、イソロイシン（Ｖ４９０Ｉ）によるバリンの置換を介してなど、前記残基にイソロイシンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４９２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、バリン（Ｄ４９２Ｖ）によるアスパラギン酸の置換を介してなど、前記残基にバリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５２０に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｉ５２０Ａ）によるイソロイシンの置換を介してなど、前記残基にアラニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５２１に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アラニン（Ｃ５２１Ａ）又はバリン（Ｃ５２１Ｖ）によるシステインの置換を介してなど、前記残基にアラニン又はバリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５４～５８％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５２２に相当する位置のアミノ酸置換を含み、セリン（Ａ５２２Ｓ）又はトレオニン（Ａ５２２Ｔ）によるアラニンの置換を介してなど、前記残基にセリン又はトレオニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５～５９％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５２４に相当する位置のアミノ酸置換を含み、アスパラギン（Ｄ５２４Ｎ）又はセリン（Ｄ５２４Ｓ）によるアスパラギン酸の置換を介してなど、前記残基にアスパラギン又はセリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５２～５８％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
他の実施形態に従って、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５２５に相当する位置のアミノ酸置換を含み、バリン（Ｑ５２５Ｖ）、イソロイシン（Ｑ５２５Ｉ）又はアルギニン（Ｑ５２５Ｒ）によるグルタミンの置換を介してなど、前記残基にバリン、イソロイシン又はアルギニンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６～６７％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
更なる一実施形態において、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５２６に相当する位置のアミノ酸置換を含み、セリン（Ｇ５２６Ｓ）によるグリシンの置換を介してなど、前記残基にセリンが導かれる。前記修飾酵素は、例えばＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｗ．アノマルス（ａｎｏｍａｌｕｓ）又はＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、好ましくはＬ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）などの酵母に由来し得る。例えば、グルコースなどの適切な炭素源を用いた発酵プロセスにおいて、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に前記変異を含む、かかる修飾酵素を使用することによって、特に、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５５％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が生じ得る。その変異はさらに、本明細書で定義される１、２、３、４以上の変異と組み合わせられ得る。
本発明の目的に特に有用なのは、少なくとも２つの変異の組み合わせ、つまり、例えばグルコースなどの適切な炭素源を使用して、宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５２～７４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が導かれる、発酵プロセスにおいて使用される、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基Ｓ４８０Ｌ若しくはＳ４８０ＱとＧ４０９Ａ、Ｑ７２ＫとＧ４０９Ａ、Ｖ３３４ＬとＧ４０９Ａ、Ｔ３１１ＩとＧ４０９Ａ、Ｈ６９Ｎ、Ｈ６９Ｓ若しくはＨ６９ＡとＧ４０９Ａ、Ｖ４０７ＩとＧ４０９Ａに相当する位置の少なくとも２つのアミノ酸置換の組み合わせ、或いは配列番号１によるポリペプチドにおける残基：Ｖ４０７ＩとＴ３１１Ｉ、Ｖ４０７ＩとＨ６９Ｎ、Ｈ６９Ａ若しくはＨ６９Ｓ、Ｖ４０７ＩとＳ４８０Ｌ若しくはＳ４８０Ｑ、Ｖ４０７ＩとＩ４８４Ｌ、Ｖ４０７ＩとＶ３３４Ｌ、又はＶ４０７ＩとＱ７２Ｋに相当する位置での少なくとも２つのアミノ酸置換の組み合わせ、或いは配列番号１によるポリペプチドにおける残基：Ｓ４８０ＱとＴ３１１Ｉ、Ｓ４８０ＱとＱ７２Ｋ、Ｓ４８０ＱとＨ６９Ｎ、Ｈ６９Ｓ、Ｈ６９Ａ、Ｓ４８０ＱとＱ６８Ｔ、Ｓ４８０ＱとＩ４８４Ｉ、又はＳ４８０ＱとＶ３３４Ｌに相当する位置での少なくとも２つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素である。
少なくとも３つの変異の組み合わせ、つまり、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基：Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｉ４８４Ｌ、Ｓ４８０ Ｖ４０７Ｉ Ｖ３３４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｑ６８Ｔ、Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ、Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｑ７２Ｋ、Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｓ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｈ６９Ａ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｈ６９Ｎ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｉ４８４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｑ６８Ｔ、Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ、Ｓ４８０Ｑ Ｖ４０７Ｉ Ｔ３１１Ｉ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｓ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｓ４８０Ｌ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｑ６８Ｔ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｑ７２Ｋ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｉ４８４Ｌ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ、Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｔ３１１Ｉ、若しくはＧ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｖ３３４Ｌに相当する位置の少なくとも３つのアミノ酸置換の組み合わせがさらに好ましく、例えばグルコースなどの適切な炭素源を使用した発酵プロセスにおいて使用され、特に宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５８～７１％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が導かれる。
他の実施形態において、少なくとも４つの変異の組み合わせ、つまり、本明細書で定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基：Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｉ４８４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｑ７２Ｋ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｑ６８Ｔ、Ｓ４８０Ｌ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｔ３１１Ｉ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｉ４８４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｔ３１１Ｉ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｓ、又はＳ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｖ３３４Ｌに相当する位置の少なくとも４つのアミノ酸置換の組み合わせが、例えばグルコースなどの適切な炭素源を使用した発酵プロセスにおいて使用され、特に宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５７～７８％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が導かれる。
また更なる実施形態において、少なくとも５つの変異の組み合わせ、つまり、本明細書に定義されるＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］による７アミノ酸モチーフと共に、配列番号１によるポリペプチドにおける残基Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｓ Ｑ７２Ｋ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ Ｔ３１１Ｉ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ Ｑ７２Ｋ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ Ｑ６８Ｔ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ Ｖ３３４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ｎ Ｉ４８４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ Ｖ３３４Ｌ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ Ｑ７２Ｋ、Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ Ｔ３１１Ｉ、又はＳ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉ Ｈ６９Ａ Ｉ４８４Ｌに相当する位置の少なくとも５つのアミノ酸置換の組み合わせを含む、修飾酵素が好ましく、例えばグルコースなどの適切な炭素源を使用した発酵プロセスにおいて使用され、特に宿主細胞中に存在する総レチノイドに対して少なくとも約５６～８４％など、少なくとも約５０％の範囲でのレチニルアセテートへのレチノールの変換率が導かれる。
本明細書に記載の宿主細胞は、それぞれの野生型酵素を介した変換と比較して、少なくとも約０．２倍、例えば約０．２～約４倍以上の範囲で増加される変換率で、特に、例えば、限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、レチニルアセテートの産生に対して約５０～９０％の範囲の変換率など、少なくとも約５０％、好ましくは５２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５又は１００％の変換率（前記宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量に対して）で、レチニルアセテートへレチノールを変換することができ、適切な宿主細胞は、例えばヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞から選択される細胞などである。適切な条件は、例えば８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０時間の流加発酵における培養であり得る。
本明細書で定義される修飾宿主細胞は、本明細書で定義される修飾ＡＴＦの１つ又は複数のコピーを含み、好ましくはＡＴＦは、前記修飾宿主細胞において異種発現される。本明細書で定義される宿主細胞を得るための修飾は、遺伝子及び／又はタンパク質のより多くのコピー、例えば、例えば、限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、レチニルアセテートの産生に対する前記宿主細胞により産生されたレチノイドの総量に対して、少なくとも約５０％、例えば約５０～９０％の範囲の変換率など、本明細書で定義されるレチニルアセテートの形成に対する選択性を有する修飾ＡＴＦのより多くのコピーを生成し、強いプロモーター、適切な転写及び／若しくは翻訳エンハンサーの使用、又はレチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞への１つ又は複数の遺伝子コピーの導入を含み得て、所定の時間でそれぞれの酵素の蓄積の増加が引き起こされる。宿主細胞に応じてどの技術を使用するかは、当業者には公知である。遺伝子発現の増加及び低減は、例えば、当技術分野で公知のノーザン、サザン又はウェスタンブロット技術などの様々な方法によって測定することができる。
核酸若しくはアミノ酸への変異の生成、つまり変異誘発は、ランダム又は部位特異的変異誘発、例えば放射線、化学治療、若しくは遺伝因子の挿入などの因子によって生じる物理的損傷など、様々な方法で実行され得る。当業者には、変異をどのように導入するかは公知である。
したがって、宿主細胞の染色体ＤＮＡが組み込まれている、本明細書に記載の修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードする発現ベクター又はポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載のレチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。発現ベクター上の異種ポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードする染色体ＤＮＡに組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含む、かかるレチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、組換え又は修飾宿主細胞と呼ばれる。レチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、本明細書に定義される修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードする遺伝子の１つ又は複数のコピー、例えば、本明細書で定義される７アミノ酸モチーフと共に、本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、配列番号１と少なくとも約２０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどを含有し得て、本明細書に定義される前記修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするかかる遺伝子の過剰発現が引き起こされる。遺伝子発現の増加は、例えば、当技術分野で公知のノーザン、サザン又はウェスタンブロット技術などの様々な方法によって測定することができる。
７アミノ酸モチーフを含む本明細書に開示される配列に基づいて、且つ例えば、限定されないが、グルコース、ガラクトース若しくはキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、レチニルアセテートの産生に対する（前記宿主細胞により産生されたレチノイドの総量に対して）、少なくとも約５０％、好ましくは５２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５又は１００％、例えば約５０～９０％の範囲の変換率を特に有する、レチニルアセテート（好ましくは、トランス－アイソフォームで）へのレチノール（好ましくは、トランス－アイソフォームで）のアセチル化に対する選択性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に基づいて、レチニルアセテートへのレチノールの変換に使用することができる、本明細書に定義されるレチノールアセチル化活性を有するポリペプチドをコードする更なる適切な遺伝子を容易に推定することができる。
したがって、本発明は、配列番号１（Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにおけるモチーフ）によるポリペプチドにおける位置Ｎ２１８～Ｇ２２４に相当する［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択される少なくとも７つのアミノ酸残基の部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、例えば配列番号１などの既知の配列と少なくとも２０％、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は１００％までの同一性を有するポリペプチドなどが、それぞれの野生型Ａｔｆ１酵素と比較して、少なくとも約０．２倍、例えば約０．２～約４倍以上の範囲で増加される変換率、特に例えば、限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、レチニルアセテートの産生に対して少なくとも約５０％、好ましくは５２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５又は１００％、例えば約５０～９０％の範囲の変換率（前記宿主細胞により産生されたレチノイドの総量に対して）を有する、修飾Ａｔｆ１酵素を産生するために、本明細書に開示される１つ又は複数のアミノ酸置換の導入に使用され得る、レチノールの変換からのレチニルアセテートの産生に対する選択性を有する、新規なＡＦＴ酵素、特定のＡｔｆ１酵素のスクリーニングプロセスにおけるプローブとして使用される、新規なアセチル化酵素の同定方法に関する。その中央のヒスチジンは酵素の結合ポケットの一部であるが、以下に記載のＮＥＥＤＬＥプロトコルに従って少なくとも約２０～３５％の最長同一性など、低い配列同一性のみを示す、７アミノ酸モチーフを特徴とする、酵母、ＡＴＦ１－ホモログなどの推定真菌の検出に、この方法は特に有用である。
一実施形態において、本発明は、配列番号１によるポリペプチドにおける位置Ｎ２１８～Ｇ２２４に相当する、少なくとも７つのアミノ酸残基の部分アミノ酸配列［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］（Ｐｒｏｓｉｔｅ ｓｙｎｔａｘにおけるモチーフ）を含む、且つ本明細書で定義される、修飾ＡＴＦ１酵素、好ましくは膜結合型酵母ＡＴＦ１酵素の同定プロセスであって、
（１）例えば、配列番号１でのＵＮＩＲＥＦ／ＵＮＩＰＲＯＴ データベースに対するＢＬＡＳＴ検索を介して同定される、限定されないが、ラチャンセア（Ｌａｎｃｈａｎｃｅａ）、ウィッカーハモマイセス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する酵素などの異なる膜結合型酵母ＡＴＦ酵素をアラインメントする工程；
（２）ＡＴＦホモログにおいて相当する位置を同定する工程；
（３）配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換を導入する工程；
（４）ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から好ましくは選択される、レチノール産生宿主細胞におけるレチノールアセチル化活性についてスクリーニングする工程であって、前記宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量に対して、レチニルアセテートの形成に対して少なくとも約５０～９０％の変換率が好ましい、工程；
を含むプロセスに関する。
（１）例えば、配列番号１でのＵＮＩＲＥＦ／ＵＮＩＰＲＯＴ データベースに対するＢＬＡＳＴ検索を介して同定される、限定されないが、ラチャンセア（Ｌａｎｃｈａｎｃｅａ）、ウィッカーハモマイセス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する酵素などの異なる膜結合型酵母ＡＴＦ酵素をアラインメントする工程；
（２）ＡＴＦホモログにおいて相当する位置を同定する工程；
（３）配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換を導入する工程；
（４）ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から好ましくは選択される、レチノール産生宿主細胞におけるレチノールアセチル化活性についてスクリーニングする工程であって、前記宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量に対して、レチニルアセテートの形成に対して少なくとも約５０～９０％の変換率が好ましい、工程；
を含むプロセスに関する。
本発明は特に、レチニルアセテートを産生するプロセスにおける、かかる新規な修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の使用に関し、例えばレチノール長鎖（ＬＣ）アシルなどのレチニルエステルの産生が低減される。このプロセスは、適切なレチノール産生宿主細胞、特に、前記修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素を発現する真菌宿主細胞で実施され得て、好ましくは、前記修飾酵素をコードする遺伝子が異種発現される、つまり前記宿主細胞内に導入される。レチニルアセテートは、（既知の）適切な化学的又はバイオテクノロジーメカニズムの作用によってビタミンＡへとさらに変換することができる。
したがって、本発明は特に、例えば限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量に対して少なくとも約５０～９０％のパーセンテージのレチニルアセテートを含むレチノイドミックスを産生するプロセスであって、例えば、トランス－及びシス－レチノールを含むレチノールミックス（好ましくは、トランス－レチノール形が少なくとも６５～９０％のパーセンテージ）などのレチノールを前記修飾Ａｔｆ１酵素と接触させる工程と、任意に、宿主細胞から形成されたレチニルアセテートを単離及び／又は精製する工程と、を含むプロセスに関し、或いは少なくとも、レチニルアセテートのそのパーセンテージが、それぞれの非修飾Ａｔｆ１酵素と比較して約０．２～約４倍以上の範囲など、少なくとも約０．２倍増加し、例えば、本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素の酵素活性を介して、トランス－レチニルアセテートとしての少なくとも６５％のパーセンテージを含む。特に、本発明は、（ａ）本明細書で定義される修飾Ａｔｆ１酵素のうちの１つをコードする核酸分子を、適切なレチノール産生宿主細、特に本明細書で定義される真菌宿主細胞中に導入する工程と、（ｂ）例えば、トランス－レチノールとしてレチノールを少なくとも約６５～９０％含むレチノールミックスなどのレチノールを、前記発現修飾Ａｔｆ１の作用を介して、好ましくは少なくとも約５０％のレチニルアセテートへと、酵素的変換、つまりアセチル化する工程と、（３）当業者に公知の適切な条件下にて前記レチニルアセテートをビタミンＡへと変換する工程と、を含む、ビタミンＡを産生するプロセスに関する。
「配列同一性」、「同一性％」という用語は本明細書において区別なく使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列同一性のパーセンテージを決定するため、最適な比較の目的で、配列がアラインされることが定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のうちいずれかにギャップが導入されてもよい。そのようなアラインメントを、比較される配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アラインメントは、長さを短くして、例えば約２０、約５０、約１００又はそれより多い核酸／塩基若しくはアミノ酸で行われてもよい。配列同一性とは、２つの配列間の、報告され、アラインされた領域にわたる完全な一致のパーセンテージである。アミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性％は、２つの配列のアラインメントに関してＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定され得る（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３）を使用して決定することができる。アミノ酸配列とヌクレオチド配列の両方とも、このアルゴリズムによってアラインすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実行されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ及びＢｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）２７６－２７７ページ，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列では、置換マトリックスについてＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列では、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択のパラメーターは、ギャップ開始ペナルティが１０、及びギャップ伸長ペナルティが０．５である。これらの異なるパラメーターは全て、わずかに異なる結果を生じさせるが、２つの配列の同一性の全体的なパーセンテージは、異なるアルゴリズムを使用する場合でも大きくは変わらないことを当業者は理解するであろう。
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、問い合わせ配列と本発明の配列との間の配列同一性のパーセンテージは、次のように計算される：［両配列中の同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示すアラインメント中の対応する位置の数］÷［アラインメント中のギャップの総数を減算した後のアラインメントの全長］。本明細書に定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから取得することができ、プログラムのアウトプットに「最長同一性」とラベルされる。比較される両方のアミノ酸配列が、そのアミノ酸のいずれかで異ならない場合には、それらは同一であるか、又は同一性１００％を有する。
本明細書で定義される、修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素は、酵素活性を変化させない更なるアミノ酸置換を保持する酵素、つまり、本明細書で定義される酵素に対して同じ特性を示し、且つレチノイドの総量に対して好ましくは少なくとも５０％の変換率でレチニルアセテートへのレチノールの変換を触媒する、酵素を包含する。かかる変異は、本発明による酵素の（酵素的）活性を変化させない「サイレント変異」とも呼ばれる。
本明細書で定義される、特定のＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素のうちの１つをコードする酵素／ポリヌクレオチドの発現は、レチノイド（レチノールを含む）産生に適しており、且つ本明細書に記載の機能的等価物若しくは誘導体を含む、本明細書に開示の酵素のうちの１つをコードする核酸の発現を可能にする、（微）生物を含むいずれかの宿主系で達成することができる。適切なレチノール産生宿主（微）生物の例は、細菌、藻類、酵母などの真菌類、植物又は動物細胞である。好ましい細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）（エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ））、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディーツィア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、例えばパラコッカス・セアキサンチンファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）である。好ましい真核微生物、特に酵母などの真菌類は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、フィコミセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）などのフィコミセス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、例えばブラケスレア・トリソポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）などのブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。例えばヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞における発現、或いはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）における発現、より好ましくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現が特に好ましい。
宿主細胞に応じて、レチノールのアセチル化のための本明細書で定義されるポリヌクレオチドが、各宿主細胞における発現のために最適化され得る。かかる更なる修飾ポリヌクレオチドをどのように産生するかは、当業者には公知である。本明細書に定義されるポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、かかる宿主最適化核酸分子も包含することが理解される。
したがって一実施形態において、本発明は、前記宿主細胞における発現に対して最適化される、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、レチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関する。特に、レチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞が、酵母、例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも２０％、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は１００％までの同一性を有する、配列における１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、例えば６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位、及びその組み合わせからなる群から選択され、且つ本明細書で定義される、残基に相当する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換の導入などを含む、好ましくは、配列番号１によるポリペプチドにおける位置Ｎ２１８～Ｇ２２４に相当する［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］（「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する）から選択される、高度に保存された部分アミノ酸配列、つまり共通活性部位又は少なくとも７アミノ酸残基の「Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフ」（モチーフは、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ＿ｄｏｃ．ｈｔｍｌに定義される、Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにある）を含む、修飾ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドから選択される。好ましくは、Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフは、［ＮＤＥ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］、より好ましくは［ＮＤ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、最も好ましくは配列番号１によるポリペプチドにおける位置Ｎ２１８～Ｇ２２４に相当するＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され；前記宿主細胞は、限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量に対して好ましくは約５０～９０％の範囲のパーセンテージでレチニルアセテートを産生する。
本発明に関して、生物、例えば微生物、真菌、藻類又は植物などはまた、国際原核生物命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）又は国際藻類・菌類・植物命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａｌｇａｅ，ｆｕｎｇｉ，ａｎｄ ｐｌａｎｔｓ）（メルボルン規約）により定義されている、同じ生理学的性質を有するそのような種のシノニム又はバソニムも含むと理解される。したがって、例えば、ラカンセア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｍｉｒａｎｔｉｎａ）株は、日本に由来するチゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属ＩＦＯ １１０６６株の異名である。
本発明は、レチニルアセテートを産生するプロセスに関し、レチニルアセテートは、本明細書に記載の修飾ＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の作用によって本明細書に開示のレチノールのアセチル化を介して産生され（特に、トランス－レチノールとして少なくとも６５％）、アセチル化酵素は好ましくは、本明細書に記載の適切な条件下にて適切な宿主細胞において異種発現される。産生されたレチニルアセテートは単離され得て、任意に培地及び／又は宿主細胞からさらに精製され得る。本明細書で定義される前記アセチル化レチノイドは、多段階プロセスで構成単位として使用することができ、ビタミンＡが導かれる。ビタミンＡは、単離され得て、当技術分野で公知の培地及び／又は宿主細胞から任意に、さらに精製され得る。
好ましくは、本明細書に記載のＡＴＦ、特にＡｔｆ１酵素の使用によるレチノールのアセチル化によって、限定されないが、グルコース、ガラクトース又はキシロース上での培養などの適切な培養条件下での修飾ＬｍＡＴＦ１の発現によって得られるような、宿主細胞によって産生されるレチノイドミックス中に存在するアセチル化レチノイド、つまりレチニルアセテートの約５０～９０％の範囲の変換率、つまり約５０～９０％の範囲のパーセンテージが得られる。より好ましい実施形態において、少なくとも約６５％のトランス－レチノールのパーセンテージを有するレチノールミックスが、本明細書で定義される修飾酵素を介したアセチル化に対する基質として使用される。
本明細書で定義される非修飾ＡＴＦ１を用いたプロセスと比較して、レチニルアセテートなどのアセチル化レチノイドのパーセンテージは、本明細書で定義される修飾ＡＴＦ１－酵素のうちの１つを含む／発現するレチノール産生宿主細胞を使用した場合には少なくとも約０．２倍、例えば約０．２～約４倍以上の範囲で増加することができる。好ましくは、宿主細胞は、真菌宿主細胞、例えばヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され得る。
レチノールを産生することができる、宿主細胞、つまり微生物、藻類、真菌類、動物若しくは植物細胞は、さらにβカロチンを産生することが可能であり得て、βカロチンはさらにレチナールへと酵素的に変換され得て、レチナールはレチノールへとさらに変換され得る。βカロチンの生合成、及び／又はレチノールへのβカロチンの生物変換のために、どの遺伝子が使用／発現されるべきかは、当業者には公知である。本明細書で定義される修飾ＡＴＦ遺伝子、特にＡＴＦ１遺伝子、及び／又はビタミンＡの生合成に必要な更なる遺伝子をさらに発現することができる、かかる宿主細胞は、適切な栄養素で補足された水性培地中で好気性若しくは無気的条件下にて、且つ各レチノール産生宿主細胞について当業者に公知のように、培養され得る。任意に、かかる培養は、当技術分野で公知の電子の移動に関与するタンパク質及び／又は補因子の存在下にある。本発明の目的に適した炭素源は、グルコース、フルクトース、ラフィノース、ラクトース、ガラクトース、グリセロール、キシロース、アラビノース、スクロース又はマルトースから選択され得て、特にグルコース、ガラクトース又はキシロースから選択され得る。宿主細胞の培養／成長は、回分、半回分、半連続又は連続式、特に半回分式で、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０時間、適切な培養条件下で行われ得る。宿主細胞に応じて、好ましくは、例えばビタミンＡなどのレチノイド、その前駆物質及び／又は誘導体、例えばレチナール、レチノール、レチニルエステル、特にレチニルアセテートの産生は、当業者に公知のように様々である。βカロチンと、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択されるレチノイド産生宿主細胞の培養及び単離は、例えば国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される宿主細胞におけるβカロチン及びレチノイドの産生に関して、例えば米国特許出願公開第２００７０１６６７８２号明細書に、その方法が記載されている。
本明細書で使用する場合、酵素に関する「特異的活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、即ち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。特異的活性は、ある一定時間に規定温度で規定量のタンパク質当たり、消費される基質及び／又は産生される産物の量を規定する。通常、特異的活性は、分当たり、タンパク質ｍｇ当たりに消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）と略される。したがって、特異的活性の単位の定義であるμｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）は、本文書の全体で互換的に使用される。酵素は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で、即ち、本明細書に定義される宿主細胞の中で、又は好適な基質の存在下での適切な（無細胞）システムの中で、その触媒活性を行う場合、活性である。酵素活性をどのように測定するかは当業者には公知であり、レチノールの変換からのレチニルアセテート産生に対して、本明細書で定義されるＡＴＦ、特にＡｔｆ１の能力を評価する分析方法は、例えば国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの実施例４に記載の方法など、当技術分野で公知である。要するに、レチニルアセテート、レチノール、トランス－レチナール、シス－レチナール、βカロチンなどの産物の力価はＨＰＬＣによって測定することができる。
βカロチンの生合成に関与する特定の酵素を含み、且つ生体内で発現され、活性であり、カロテノイド、例えばβカロチンの産生を引き起こす、適切な宿主細胞に関して、カロテノイド産生宿主細胞を産生する遺伝子と方法のどちらも、当技術分野で公知であり、例えば国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットを参照のこと。産生されるカロテノイドに応じて、様々な遺伝子が関与し得る。
本明細書で使用される、「レチノール産生宿主細胞」は宿主細胞であり、それぞれのポリペプチドは生体内で発現され、且つ活性であり、レチナールを介したβカロチンの、レチノールへの酵素的変換によって、レチノイド、例えばビタミンＡ及びレチノールなどのその前駆物質の産生が引き起こされる。これらのポリペプチドは、本明細書で定義される修飾ＡＴＦを含む。ビタミンＡ経路の遺伝子及びレチノイド産生宿主細胞を産生する方法は当技術分野で公知である。レチノイドという用語は、本明細書で定義される修飾アセチル化酵素に対する基質として使用されるレチノールを含む。
本明細書で使用されるレチノイドとしては、アポカロチノイドとしても知られるβカロチン分解産物、限定されないが、レチナール、レチノイン酸、レチノール、レチノイン酸メトキシド（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）、レチニルアセテート、レチニルエステル、４－ケト－レチノイド、３ ヒドロキシ－レチノイド又はその組み合わせが挙げられる。本明細書で使用される長鎖レチニルエステルは、レチノールと脂肪酸との炭化水素エステルとして定義され、その脂肪酸は、少なくとも約８個、例えば９、１０、１２、１３、１５若しくは２０個の炭素原子、及び約２６個まで、例えば２５、２２、２１個以下の炭素原子からなり、好ましくは約６個までの不飽和結合、例えば０、１、２、４、５、６個の不飽和結合を有する。その長鎖レチニルエステルにおける脂肪酸としては、限定されないが、リノール酸、オレイン酸又はパルミチン酸が挙げられる。レチノイドの生合成は、例えば国際公開第Ｏ２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。
本明細書で使用される「レチナール」は、ＩＵＰＡＣ名（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）－３，７－ジメチル－９－（２，６，６－トリメチルシクロヘキセン－１－イル）ノナ－２，４，６，８－テトラエナールで知られている。それは本明細書において区別なく、レチナールデヒド又はビタミンＡアルデヒドと呼ばれ、シス－及びトランス－アイソフォームのどちらも、例えば１１－シスレチナール、１３－シスレチナール、トランス－レチナール及びすべてのトランス－レチナールを包含する。
本明細書で使用される「カロテノイド」という用語は当技術分野でよく知られている。それは、炭素２０個のゲラニルゲラニル二リン酸分子２つのライゲーションによって天然に形成される、長い炭素４０個の共役イソプレノイドポリエンを包含する。これらとしては、限定されないが、フィトエン、リコピン、及びカロチン、例えばβカロチンが挙げられ、４－ケト位置又は３－ヒドロキシ位置でそれらを酸化して、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、又はアスタキサンチンを生成することができる。カロテノイドの生合成は、例えば国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットに記載されている。
本明細書で使用される、「ビタミンＡ」は、水溶液中、固形物及び配合物中に見出されるビタミンＡのいずれかの化学的形態であり得て、レチノール、レチニルアセテート及びレチニルエステルが挙げられる。例えば、その遊離酸形態で解離していない、又はアニオンとして解離している、レチノイン酸も含まれる。
特に、本発明は、以下の実施形態を特徴とする：
（１）配列番号１と少なくとも約２０％、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は１００％までの同一性を有する配列における、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、レチノール－アセチル化酵素、好ましくは酵母酵素などの真菌酵素であって、その１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１によるポリペプチドにおいて６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置し、好ましくは、配列番号１によるポリペプチドにおいてトレオニンである残基６８、アスパラギン、セリン又はアデニンである残基６９、アスパラギン又はリジンである残基７２、ロイシンである残基７３、リジン又はアスパラギンである残基１７１、グリシンである残基１７２、イソロイシンである残基１７４、アラニン又はグリシンである残基１７６、バリンである残基１７８、セリン又はグリシンである残基２９１、アラニン、セリン又はアスパラギンである残基２９２、ロイシン又はバリンである残基２９４、フェニルアラニンである残基３０１、イソロイシンである残基３０７、バリンである残基３０８、メチオニン又はイソロイシンである残基３１１、アラニンである残基３１２、アスパラギンである残基３２０、バリン又はフェニルアラニンである残基３２２、ロイシンである残基３３４、アラニンである残基３６２、アラニンである残基４０５、イソロイシンである残基４０７、アラニンである残基４０９、グルタミン酸、リジン、メチオニン、フェニルアラニン又はグルタミンである残基４８０、バリンである残基４８３、ロイシンである残基４８４、イソロイシンである残基４９０、バリンである残基４９２、アラニンである残基５２０、アラニン又はバリンである残基５２１、セリン又はトレオニンである残基５２２、アスパラギン又はセリンである残基５２４、バリン、イソロイシン又はアルギニン５２５である残基、セリンである残基５２６、及びその組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸を含む、酵素。
（２）配列番号１によるポリペプチドにおける位置Ｎ２１８～Ｇ２２４に相当する、Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにおけるモチーフを有する、［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］（「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する）から選択される、少なくとも７つのアミノ酸残基の高度に保存された部分アミノ酸配列を含む、（１）に記載且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（３）少なくとも約５０～約９０％の範囲の変換率で、レチニルアセテートへのレチノールの変換を触媒する、（１）及び／又は（２）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（４）レチニルアセテートへのレチノールの変換又はアセチル化に対する活性が、前記アミノ酸置換のうちの１つ又は複数を保持しないレチノール－アセチル化酵素と比較して、少なくとも約２０％増加する、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（５）総レチノイドの産生に対する活性が、前記アミノ酸置換のうちの１つ又は複数を保持しないレチノール－アセチル化酵素と比較して、少なくとも約２倍増加する、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（６）配列番号１によるポリペプチドにおける、６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、及び５２６位からなる群から選択され、好ましくは６９、７２、３３４、４０５、４０７、４０９、４８０、４８４、５２５及び５２６位からなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置する単一アミノ酸置換を含む、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（７）配列番号１によるポリペプチドにおける４８０及び４０９、４８０及び４０７、又は４０７及び４０９から選択されるアミノ酸残基に相当する少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（８）配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、３１１、３３４、４８４位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置で１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、（７）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（９）４８０位に相当する残基がリジン又はグルタミンであり、４０９位に相当する残基がアラニンであり、４０７位に相当する残基がイソロイシンであり、６９位に相当する残基がアラニン、アスパラギン又はセリンであり、且つ任意に、７２位のリジン及び／又は３１１位のイソロイシン及び／又は６８位のトレオニン及び／又は３３４位のロイシン及び／又は４８４位のロイシンをさらに含む、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（１０）レチノール産生宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞において発現される、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（１１）（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義される、酵素を含む、レチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞が好ましくは、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義されるレチノール－アセチル化酵素で好ましくは形質転換されている、宿主細胞。
（１２）（１１）に記載の産生宿主細胞を提供する工程と、適切な培養条件下にて適切な培地で前記宿主細胞を培養する工程と、任意に、その培地からレチニルアセテートを単離し、且つ／又は精製する工程と、を含む、レチニルアセテートを産生するプロセス。
（１３）レチノール産生宿主細胞においてレチニルアセテートへのレチノールの変換を少なくとも２０％増加するプロセスであって、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義されるレチノール－アセチル化酵素で、前記宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞を形質転換することを含む、プロセス。
（１４）レチノール産生宿主細胞において総レチノイドの産生を少なくとも２倍増加するプロセスであって、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義されるレチノール－アセチル化酵素で、前記宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞を形質転換することを含む、プロセス。
（１）配列番号１と少なくとも約２０％、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は１００％までの同一性を有する配列における、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、レチノール－アセチル化酵素、好ましくは酵母酵素などの真菌酵素であって、その１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１によるポリペプチドにおいて６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置し、好ましくは、配列番号１によるポリペプチドにおいてトレオニンである残基６８、アスパラギン、セリン又はアデニンである残基６９、アスパラギン又はリジンである残基７２、ロイシンである残基７３、リジン又はアスパラギンである残基１７１、グリシンである残基１７２、イソロイシンである残基１７４、アラニン又はグリシンである残基１７６、バリンである残基１７８、セリン又はグリシンである残基２９１、アラニン、セリン又はアスパラギンである残基２９２、ロイシン又はバリンである残基２９４、フェニルアラニンである残基３０１、イソロイシンである残基３０７、バリンである残基３０８、メチオニン又はイソロイシンである残基３１１、アラニンである残基３１２、アスパラギンである残基３２０、バリン又はフェニルアラニンである残基３２２、ロイシンである残基３３４、アラニンである残基３６２、アラニンである残基４０５、イソロイシンである残基４０７、アラニンである残基４０９、グルタミン酸、リジン、メチオニン、フェニルアラニン又はグルタミンである残基４８０、バリンである残基４８３、ロイシンである残基４８４、イソロイシンである残基４９０、バリンである残基４９２、アラニンである残基５２０、アラニン又はバリンである残基５２１、セリン又はトレオニンである残基５２２、アスパラギン又はセリンである残基５２４、バリン、イソロイシン又はアルギニン５２５である残基、セリンである残基５２６、及びその組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸を含む、酵素。
（２）配列番号１によるポリペプチドにおける位置Ｎ２１８～Ｇ２２４に相当する、Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにおけるモチーフを有する、［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］（「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する）から選択される、少なくとも７つのアミノ酸残基の高度に保存された部分アミノ酸配列を含む、（１）に記載且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（３）少なくとも約５０～約９０％の範囲の変換率で、レチニルアセテートへのレチノールの変換を触媒する、（１）及び／又は（２）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（４）レチニルアセテートへのレチノールの変換又はアセチル化に対する活性が、前記アミノ酸置換のうちの１つ又は複数を保持しないレチノール－アセチル化酵素と比較して、少なくとも約２０％増加する、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（５）総レチノイドの産生に対する活性が、前記アミノ酸置換のうちの１つ又は複数を保持しないレチノール－アセチル化酵素と比較して、少なくとも約２倍増加する、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（６）配列番号１によるポリペプチドにおける、６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、及び５２６位からなる群から選択され、好ましくは６９、７２、３３４、４０５、４０７、４０９、４８０、４８４、５２５及び５２６位からなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置する単一アミノ酸置換を含む、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（７）配列番号１によるポリペプチドにおける４８０及び４０９、４８０及び４０７、又は４０７及び４０９から選択されるアミノ酸残基に相当する少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（８）配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、３１１、３３４、４８４位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置で１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、（７）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（９）４８０位に相当する残基がリジン又はグルタミンであり、４０９位に相当する残基がアラニンであり、４０７位に相当する残基がイソロイシンであり、６９位に相当する残基がアラニン、アスパラギン又はセリンであり、且つ任意に、７２位のリジン及び／又は３１１位のイソロイシン及び／又は６８位のトレオニン及び／又は３３４位のロイシン及び／又は４８４位のロイシンをさらに含む、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（１０）レチノール産生宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞において発現される、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）に記載され、且つ本明細書で定義される、レチノール－アセチル化酵素。
（１１）（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義される、酵素を含む、レチノール産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、前記宿主細胞が好ましくは、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義されるレチノール－アセチル化酵素で好ましくは形質転換されている、宿主細胞。
（１２）（１１）に記載の産生宿主細胞を提供する工程と、適切な培養条件下にて適切な培地で前記宿主細胞を培養する工程と、任意に、その培地からレチニルアセテートを単離し、且つ／又は精製する工程と、を含む、レチニルアセテートを産生するプロセス。
（１３）レチノール産生宿主細胞においてレチニルアセテートへのレチノールの変換を少なくとも２０％増加するプロセスであって、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義されるレチノール－アセチル化酵素で、前記宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞を形質転換することを含む、プロセス。
（１４）レチノール産生宿主細胞において総レチノイドの産生を少なくとも２倍増加するプロセスであって、（１）及び／又は（２）及び／又は（３）及び／又は（４）及び／又は（５）及び／又は（６）及び／又は（７）及び／又は（８）及び／又は（９）及び／又は（１０）に記載され、且つ本明細書で定義されるレチノール－アセチル化酵素で、前記宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞を形質転換することを含む、プロセス。
以下の実施例は、実例となるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものでは一切ない。本出願全体を通して記載される、すべての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に国際公開第２００８０４２３３８号パンフレット、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレット、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレット、米国特許出願公開第２００７０１６６７８２号明細書、国際公開第２０１９０５８０００号パンフレット、国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレット、国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１６０１３０６２８号明細書、国際公開第２００９１２６８９０号パンフレット、国際公開第２０１４１９５３７８号パンフレット、国際公開第２０１２１２５０２７号パンフレット又は国際公開第２０１３１４４２５７号パンフレットの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例］
［実施例１：一般的な方法、株、及びプラスミド］
本明細書に記載のすべての基礎分子生物学及びＤＮＡ操作手順は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。
［実施例１：一般的な方法、株、及びプラスミド］
本明細書に記載のすべての基礎分子生物学及びＤＮＡ操作手順は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。
振とうプレートアッセイ（ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ））。変異体の変換活性を試験するために、通常、０．２５％酵母抽出物８００μｌ、０．５％ペプトン（０．２５Ｘ ＹＰ）に、新たに増殖させたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）１０μｌを接種し、水相中に炭素源として５％グルコースを含むシリコーン油（Ｃｌｅａｒｃｏ，ＰＦＳ－５ｃＳｔ）８００μｌでオーバーレイした。２４ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ ２４ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ Ｗｈａｔｍａｎ ７７０１－５１０２）において形質転換体を増殖させ、マットシール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ． Ｐｌａｔｅ Ｍａｔｓ ２４０１０ＣＭ）で覆い、Ｑｉａｇｅｎ Ａｉｒｐｏｒｅ Ｔａｐｅ Ｓｈｅｅｔｓ（１９５７１）で無菌シールし、３０℃、８００ＲＰＭにて４日間、Ｉｎｆｏｒｓマルチプレート振盪機（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）で振とうした。シリコーン油画分を振とうプレートウェルから取り出し、光ダイオードアレイ検出器を備えたＵＰＬＣ逆相カラムによって分析した。この方法は実施例２でも用いられる。
ローラードラムにおける増殖。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）におけるＡＴＦ酵素の変換活性を試験するために、通常、１％酵母抽出物５ｍｌ、２％ペプトン（１ｘ ＹＰ）を、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の新たなプレートから接種し、水相中に炭素源として２％グルコース又は２％ガラクトース（又は別に指定される）を含む鉱油（Ｄｒａｋｅｏｌ ５，Ｐｅｎｒｅｃｏ，Ｋａｒｎｓ Ｃｉｔｙ，ＰＡ ＵＳＡ）５００μｌでオーバーレイした。３０℃で４日間置かれたローラードラム（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＣ－７）上に置いたガラス培養管（ＶＷＲ ４７７２９－５８３）内で形質転換体のクローン分離株を増殖させた。鉱油画分を培養管から取り出し、光ダイオードアレイ検出器を備えたＵＰＬＣ逆相カラムによって分析した。この方法は実施例２でも用いられた。
ＤＮＡ形質転換。ＹＰＤプレート培地で一晩増殖させて、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を形質転換した。細胞５０μｌをプレートから掻き取り、形質転換ＤＮＡ、通常、組込み形質転換用の通常直鎖ＤＮＡ１μｇ、４０％ＰＥＧ ３５５０ＭＷ、１００ｍＭ酢酸リチウム、５０ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭトリス－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５００μｌ中で４０℃にて３０分間インキュベートすることによって形質転換し、選択培地に直接プレーティングするか、或いはドミナントな抗菌性マーカー選択の場合には、選択培地にプレーティングする前に、３０℃で４時間、ＹＰＤ液体培地上で細胞を増殖させた。酢酸リチウム法を用いて、対数ＹＰＤ増殖細胞から、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株を形質転換し、それを一晩ＹＰＤ培養の継代培養によって増殖させた。１０８細胞／形質転換を収集し、４０％ＰＥＧ ３３５０（ＭＷ）、１００ｍＭ酢酸リチウム、１０ｍＭトリス－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、せん断サケ***ＤＮＡ５μｇ、及び直鎖化形質転換ＤＮＡ２μｇを含有する混合物中に最終体積５００μＬで再懸濁した。この混合物を３０℃で１時間インキュベートし、続いて４２℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、液体ＹＰＤ培地に再懸濁し、３０℃で３時間又は２２℃で一晩増殖させて、ハイグロマイシン１００μｇ／ｍｌを含有する選択培地にプレーティングする前にＨｙｇＲ抗生物質耐性遺伝子の発現が可能となる。本明細書で使用されるＤＮＡ配列の大部分は、それぞれの宿主系における発現に対してコドン最適化され、配列表に示される。
ＤＮＡ分子生物学。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用されるべき遺伝子は、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）においてＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ末端を用いて、表４Ａ～４Ｅ（「変異」欄）又は表５によるアミノ酸置換の導入を用いて合成された。通常、国際公開第２０１９０５８０００号パンフレット（実施例１）に記載のように、ＬｍＡＴＦ１遺伝子（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号３）、ＳｂＡＴＦ１遺伝子（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号６）、ＬｆｆＡＴＦ１（ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化配列番号８）を、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換におけるマーカー選択のために、ＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」、ＭＢ６１５７ＨｙｇＲ、及びＭＢ８３２７ＮａｔＲベクターにサブクローニングした。Ｗａ１ＡＴＦ及びＷａ３ＡＴＦ変異体の産生のために、それぞれのＡＴＦ対立遺伝子（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号１２及び１４）、遺伝子ＤｒＢＣＯ遺伝子（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号１８）、ＦｆＲＤＨ１２遺伝子（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号２２）及び選択マーカーとしてＵＲＡ３を含有するプラスミドを産生した（表５参照）。遺伝子及びマーカーのランダムな非相同的な末端の連結によるクリーンな遺伝子の挿入のために、それぞれのプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ（ＭＢ５０８２）又はＰｖｕＩＩ（ＭＢ６１５７及びＭＢ８３２７）消化物をゲル電気泳動及びＱｉａｇｅｎゲル精製カラムによって精製した。ＦＯＡ含有培地上でＵＲＡ３カセットの環状切除（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｅｘｃｉｓａｎｔ）の選択を可能にするフランキング反復配列のために、ＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」マーカーは再利用することができた。ＮａｔＲ及びＨｙｇＲマーカーは、フランキングｌｏｘ部位のために抗生物質感受性の切除をもたらすＣｒｅリコンビナーゼの一過的発現によって除去することができた。ＮａｔＲマーカー選択を用いて、エピソームＣａｓ９プラスミドＭＢ７４５２（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号２５）を予め形質転換することによって、ＨＯＭ３のＣａｓ９仲介欠失が行われた。続いて、Ｇ４１８Ｒを用いて、ｈｏｍ３切断のためのガイド配列を有するエピソームプラスミドＭＢ８５４９（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号２６）を形質転換した。形質転換体をホモセリン栄養要求性についてスクリーニングし、続いてＨＯＭ３配列にフランキングするプライマーを使用して配列決定し、クリーンなフレームシフトを選択して前方に移動した。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における変異ＡＴＦの発現のために、第１株ＣＡＲ－０００２を以下のように構成した：サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に対してコドン最適化されたキサントフィロマイセス・デンデロース（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）からの３つのカロテノイド遺伝子発現カセット、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔＩを、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－７Ｄ株に形質転換した（ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６（９－１０），ｐ．７０６－７１４，２０００）。国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの実施例９に記載のＣＲＩＳＰＲアプローチを用いて、発現カセットをＩＮＴ１組込み部位に組み込んだ。強力な構成的プロモーター（国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの配列番号１３９、配列番号１４２及び配列番号１４８）及びドナーＤＮＡフランク配列（国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの配列番号１４９及び配列番号１５２）を含有する発現カセットをＣＥＮ．ＰＫ１１３－７Ｄに形質転換した。ＩＮＴ１ゲノム標的（プロトスペーサー）の配列は国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの配列番号１７６に記載される。ＩＮＴ１組込み部位は、染色体ＸＶ上に位置するＮＴＲ１（ＹＯＲ０７１ｃ）とＧＹＰ１（ＹＯＲ０７０ｃ）の間の非コード領域に位置する。ＬｉＡｃ／サケ***（ＳＳ）担体ＤＮＡ／ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５０，ｐ．８７－８６，２００２）を用いて、Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，３５，ｐ．２０１－２１１，２０１８）に記載のＤＮＡ濃縮物を使用してＣＥＮ．ＰＫ１１３－７Ｄ株を形質転換した。続いて、ハイグロマイシンに対する選択を有する、ＤｍＢＣＯの構成的発現カセット（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化配列番号２０；ＴＤＨ３プロモーター、ＰＧＫ１ターミネーター）を含有する、ＳｆｉＩ直鎖状プラスミドＭＢ８４３３（配列番号２７）を用いて、且つＰＣＲアンプリコンを用いて、ＨｓＲＤＨ１２の発現カセット（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化配列番号２４；ＴＤＨ３プロモーター，ＰＧＫ１ターミネーター）を含有し、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に対する選択を有するＵＲＡ３位置にＰＣＲアンプリコンを標的化する、プラスミドＭＢ８４３１（配列番号：２８）由来のプライマーＭＯ１２３０１（配列番号５９）及びＭＯ１２３０２（配列番号６０）を使用して、レチノール産生株ＭＹ４８３４をＣＡＲ－０００２の連続形質転換によって作成した。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）において発現されるＡＴＦ遺伝子（配列番号４によるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化ＬｍＡＴＦ１ｗｔ及び変異体）は、ＨＳＰ２６プロモーター由来の構成的発現のためのＭＢ７６２１（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のＸｂａＩ／ＳｂｆＩ部位へのＸｂａＩ及びＰｓｔＩ末端を用いて、又はＧＡＬ１プロモーター由来の誘導性発現を有するＭＢ７６２１誘導体、ＭＢ９６０６を用いて合成された。ＭＢ９６０６は、ＭＢ７６２１由来のＳｐｅＩ／ＸｂａＩ断片を含有するＨＳＰ２６プロモーターを除去し、ＧＡＬ１プロモーター配列と置き換えることによって作成された。これらのベクターには、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での形質転換中に選択するためのＮａｔＲ遺伝子が使用される。標的化相同的組換によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれのプラスミドのＳｆｉＩ消化物がゲル電気泳動及びキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル精製カラムによって精製された。プラスミドＭＢ７６２１及び誘導体におけるＮａｔＲマーカーは、フランキングｌｏｘ部位のために抗生物質感受性の切除をもたらすＣｒｅリコンビナーゼの一過的発現によって除去された。プラスミドは、標準分子遺伝学技術を用いて作成されるか、又は合成バイオロジー法（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって入手可能である。
配列。使用された、プラスミド、並びにそれぞれの野生型ＬｍＡＴＦ１（Ｌ．ミランティナ（ｍｉｒａｎｔｉｎａ）に由来する）、ＳｂＡＴＦ１（Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）に由来する）、ＬｆｆＡＴＦ１（Ｌ．ファーメンタティ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）に由来する）又はＷａ１ＡＴＦ及びＷａ３ＡＴＦ（どちらもウィッカーハモマイセス・アノマルス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ）に由来する）酵素（本明細書に記載のそれぞれのアミノ酸置換の産生を含む）を含む株を表１及び２に列挙する。それぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列表に示し、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのコドン最適化配列が具体的に示される。
配列番号１による非修飾ＬｍＡＴＦ１、配列番号１１による非修飾Ｗａ１ＡＴＦ及び配列番号１３による非修飾Ｗａ３ＡＴＦに基づいて、１つ又は複数のアミノ酸置換が、表４、５、６及び８に示す選択位置に導入された。アミノ酸置換は、ＳｂＡＴＦ１（例えば、Ｎ３９Ｓ、Ｎ３９Ａ、Ｆ３７３Ａ、Ｋ４９２Ｓ、Ｇ４４４Ｌ、Ｇ４４４Ｆ、Ｇ４４４Ｍ、Ｇ４４４Ｑ、Ｖ３７１Ｉ、Ｖ４９１Ｒ、Ｖ４９１Ｑ－配列番号５による非修飾ＳｂＡＴＦ１に基づいて、単一の変異又は少なくとも２つの変異の組み合わせ）又はＬｆｆＡＴＦ１（例えば、Ｑ２８Ｓ、Ｑ２８Ａ、Ｇ３６３Ａ、Ａ４８２Ｓ、Ｑ４３４Ｌ、Ｑ４３４Ｆ、Ｑ４３４Ｍ、Ｖ３６Ｉ、Ｖ４８１Ｒ、Ｖ４８１Ｑ－配列番号７による非修飾ＬｆｆＡＴＦ１に基づいて、単一の変異又は少なくとも２つの変異の組み合わせ）のアミノ酸配列における相当する位置に導入することができる。プラスミドＭＢ７６２１及びＭＢ９４４２が、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に使用された。
ＵＰＬＣ逆相レチノール法。迅速スクリーニングのために、この方法では、シス異性体を分けず、主要な官能基のみである。オートサンプラーと共にＰＤＡ検出（又は類似の）を有するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを使用して、試料を注入した。Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ １．８ｕｍ Ｐ／Ｎ １８６００３５３９を使用して、レチノイドを分割した。移動相は、ヘキサン１０００ｍＬ、イソプロパノール３０ｍＬ、及びレチノイド関連化合物のための酢酸０．１ ｍＬのいずれかからなった。それぞれの流量は０．６ｍＬ／分であった。カラム温度は２０℃であった。注入体積は５μＬであった。検出器は、２１０～６００ｎｍを集める光ダイオードアレイ検出器であった。表３に従って、検体を検出した。
方法の較正。方法をレチニルアセテートについて較正し、指定のレスポンスファクターを用いて、レチノール及びレチナールをレチニルアセテートに対して定量化する。メスフラスコを使用してストック溶液用に、約２００μｇ／ｍｌにてレチニルアセテートをＴＨＦに溶解する。メスフラスコを用いて、メタノール／ＭＴＢＥ（５０／５０）中でストック溶液の２０倍、５０倍及び１００倍希釈を行った。レチニルアセテートのＵＶ吸光度は、かなり急速に非線形となるため、線形範囲内にとどまるように注意しなければならない。結果として、濃度が低いほど、良くなり得る。レチニルパルミテートも、レチニルエステル較正として使用することができる。約３分時点でのレチニルアセテートのピーク及び約３．５分時点でのレチニルエステル（長鎖レチニルエステル）のピーク。
試料の調製。条件に応じて、様々な方法によって試料を調製した。全ブロス又は洗浄されたブロス試料に関して、ブロスをＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）チューブに入れ、計量し、移動相を加えた。簡潔には、２ｍｌ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）チューブに、十分に混合されたブロス２５μｌ及びＴＨＦ９７５μｌを添加した。次いで、製造元の指示に従って最も高いセッティング３倍で、通常３×１５×７５００ｔｐｍｓにて、試料をＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｃｏｒｐ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）において処理した。洗浄されたペレットについて、試料を１．７ｍｌチューブ内で微量遠心機において１００００ｒｐｍにて１分間回転させ、ブロスをデカントし、水１ｍｌを添加し、混合し、ペレット化し、デカントし、元の体積に戻した。混合物を再びペレット化し、適切な量の移動相中に戻し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ビーズビーティングによって処理した。シリコーン油画分の分析に関しては、試料を４０００ＲＰＭにて１０分間回転させ、オイルをデカントして容積式ピペット（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ），Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）によって上部を除去し、ボルテックスによって混合された移動相へと希釈し、ＵＰＬＣ分析によってレチノイド濃度を測定した。
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発酵条件。発酵は、好ましくはシリコーン油オーバーレイ及び攪拌タンクを使用した上述の条件と同じであり、好ましくは総容積０．５～５Ｌのベンチトップ反応器内のグルコースであった（国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレット）。一般に、半回分攪拌タンク反応器で同じ結果が確認され、生産性の増加によって、レチノイドを産生するシステムの有用性が実証された。好ましくは、発酵は、５％グルコースでバッチし、溶存酸素が約２０％未満に下がった後に、２０％シリコーン油を添加し、フィードを再開して、流加プログラム全体を通して２０％溶存酸素を達成した。
［実施例２：変異ＬｍＡＴＦを発現するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチニルアセテートの産生］
宿主としてのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種ＬｍＡＴＦ１の発現については、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）βカロチンオキシターゼＵｍＣＣＯ１をコードする遺伝子を含む、レチノール産生株ＭＬ１７９６８（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号１６）を、本明細書で定義され、且つヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号３、６、８、１０で示すように、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）上で選択のためのハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＲ）に連結された、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子断片を含有する精製ＰｖｕＩＩ遺伝子断片で形質転換した。プレーティング前に、培養物をＹＰＤ中で４時間増殖させ、抗生物質耐性遺伝子を合成した。振とうプレートアッセイにおいて、具体的には、オーバーレイとしてシリコーン油と共に、０．２５Ｘ ＹＰ中で炭素源として５～１０％グルコースを用いて、分離株をアセチル化についてスクリーニングし、成功した分離株をさらに、グルコースフィード及びシリコーン油オーバーレイを有する半回分攪拌タンク反応器においてスクリーニングし、それによって、生産性の大きな増加が示され、レチノイドの産生の有用性が示された。その結果（振とうプレートアッセイ）を表４に示し、宿主細胞に存在するレチノイドの総量に対するレチニルアセテートのパーセンテージが示され、それぞれの非修飾野生型ＡＴＦを発現する宿主細胞と比較して少なくとも約０．３倍増加する。最初に、ただ１つの単一アミノ酸置換でクローンを試験した（表４Ａ参照）。
宿主としてのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種ＬｍＡＴＦ１の発現については、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）βカロチンオキシターゼＵｍＣＣＯ１をコードする遺伝子を含む、レチノール産生株ＭＬ１７９６８（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号１６）を、本明細書で定義され、且つヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号３、６、８、１０で示すように、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）上で選択のためのハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＲ）に連結された、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子断片を含有する精製ＰｖｕＩＩ遺伝子断片で形質転換した。プレーティング前に、培養物をＹＰＤ中で４時間増殖させ、抗生物質耐性遺伝子を合成した。振とうプレートアッセイにおいて、具体的には、オーバーレイとしてシリコーン油と共に、０．２５Ｘ ＹＰ中で炭素源として５～１０％グルコースを用いて、分離株をアセチル化についてスクリーニングし、成功した分離株をさらに、グルコースフィード及びシリコーン油オーバーレイを有する半回分攪拌タンク反応器においてスクリーニングし、それによって、生産性の大きな増加が示され、レチノイドの産生の有用性が示された。その結果（振とうプレートアッセイ）を表４に示し、宿主細胞に存在するレチノイドの総量に対するレチニルアセテートのパーセンテージが示され、それぞれの非修飾野生型ＡＴＦを発現する宿主細胞と比較して少なくとも約０．３倍増加する。最初に、ただ１つの単一アミノ酸置換でクローンを試験した（表４Ａ参照）。
更なる試験を２つのアミノ酸置換の組み合わせで実施し、その結果を表４Ｂに示す。
更なる変異を導入することによって、上記で試験された二重変異体の一部をさらに修飾し、つまり三重変異を導いた。結果を４Ｃに示す。
次の工程において、更なる単一変異を有する三重変異ＬｍＡＴＦ１－Ｓ４８０Ｑ Ｇ４０９Ａ Ｖ４０７Ｉの組み合わせを試験した。結果を表４Ｄに示す。
最後に、アミノ酸残基Ｓ４８０、Ｇ４０９、Ｖ４０７及びＨ６９の修飾を含む５つのアミノ酸置換の組み合わせを、レチノールのアセチル化について試験した。結果を表４Ｅに示す。
示されるように、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）において１つ又は複数の変異を保持するＬｍＡＴＦ１の使用によって、ＬｍＡＴＦ１野生型を使用した場合の２倍までの範囲でレチニルアセテートのパーセンテージが増加する。
［実施例３：変異ＷａＡＴＦを発現するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチニルアセテートの産生］
宿主としてのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種ＡＴＦの発現に関して、ＭＬ１７５４４、ＭＬ１８６６７の修飾誘導体を表５に示すプラスミドで形質転換したことを除いては、実施例２と同様なアプローチがとられた。それぞれが、指示されるＡＴＦ対立遺伝子（つまり、配列番号１２によるＷａ１ＡＴＦ又は配列番号１４によるＷａ３ＡＴＦ由来のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の野生型又は修飾型）、ＤｒＢＣＯ（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号１８）、及びＦｆＲＤＨ１２（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号２２）からなる。表５ＡからのＳｆｉＩ直鎖状プラスミドを用いたＭＬ１８６６７の形質転換体は、ウラシル原栄養性に対して選択された。形質転換体を振とうプレートにおいて実施例２と同様に増殖させ、野生型ＡＴＦを用いたレチニルアセテートのパーセンテージ（１００％として設定される）に対する変異ＡＴＦを用いてレチニルアセテートのパーセンテージを以下の表５に示す。
宿主としてのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種ＡＴＦの発現に関して、ＭＬ１７５４４、ＭＬ１８６６７の修飾誘導体を表５に示すプラスミドで形質転換したことを除いては、実施例２と同様なアプローチがとられた。それぞれが、指示されるＡＴＦ対立遺伝子（つまり、配列番号１２によるＷａ１ＡＴＦ又は配列番号１４によるＷａ３ＡＴＦ由来のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の野生型又は修飾型）、ＤｒＢＣＯ（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号１８）、及びＦｆＲＤＨ１２（ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化配列番号２２）からなる。表５ＡからのＳｆｉＩ直鎖状プラスミドを用いたＭＬ１８６６７の形質転換体は、ウラシル原栄養性に対して選択された。形質転換体を振とうプレートにおいて実施例２と同様に増殖させ、野生型ＡＴＦを用いたレチニルアセテートのパーセンテージ（１００％として設定される）に対する変異ＡＴＦを用いてレチニルアセテートのパーセンテージを以下の表５に示す。
示されるように、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）おける１つ又は複数の変異を保持するウィッカーハモマイセス・アノマルス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ）ＡＴＦホモログの使用によって、ＬｍＡＴＦ１野生型を用いた場合の２倍までの範囲でレチニルアセテートのパーセンテージが増加する。
［実施例４：変異ＡＴＦを発現するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチニルアセテートの産生］
宿主としてのサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種ＬｍＡＴＦ１（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化配列番号４をベースとする野生型及び変異型）の発現に関して、１００μｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）での選択のために、ヌルセオトリシン耐性マーカー（ＮａｔＲ）を含有する精製ＳｆｉＩ消化遺伝子断片で、レチノール産生株ＭＹ４８３４（実施例１参照）を形質転換した。プレーティングの前に、培養物をＹＰＤにおいて３時間増殖させて、抗生物質耐性遺伝子を合成する。ＬｍＡＴＦ１（ＭＢ９６０６）を欠くが、ＮａｔＲマーカーを有するバックボーン発現プラスミドのために、直鎖状プラスミド２．５～３μｇでの形質転換を並行して行った。形質転換混合物をグルコース上にプレーティングし、上述（実施例１）のように増殖された培養チューブにおけるレチニルアセテートの産生に対してスクリーニングした。増殖後、鉱油オーバーレイを遠心培養液からサンプリングし、ＵＰＬＣ分析にかけた（実施例１参照）。その結果を表６に示し、野生型ＡＴＦを用いたレチニルアセテートのパーセンテージ（１００％として設定される）に対する変異ＡＴＦを用いたレチニルアセテートのパーセンテージを示す。示されるように、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）おける２つ以上の変異を保持するＬｍＡＴＦ１の使用によって、ＬｍＡＴＦ１野生型を用いた場合の２倍までの範囲でレチニルアセテートのパーセンテージが増加する。
宿主としてのサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種ＬｍＡＴＦ１（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化配列番号４をベースとする野生型及び変異型）の発現に関して、１００μｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）での選択のために、ヌルセオトリシン耐性マーカー（ＮａｔＲ）を含有する精製ＳｆｉＩ消化遺伝子断片で、レチノール産生株ＭＹ４８３４（実施例１参照）を形質転換した。プレーティングの前に、培養物をＹＰＤにおいて３時間増殖させて、抗生物質耐性遺伝子を合成する。ＬｍＡＴＦ１（ＭＢ９６０６）を欠くが、ＮａｔＲマーカーを有するバックボーン発現プラスミドのために、直鎖状プラスミド２．５～３μｇでの形質転換を並行して行った。形質転換混合物をグルコース上にプレーティングし、上述（実施例１）のように増殖された培養チューブにおけるレチニルアセテートの産生に対してスクリーニングした。増殖後、鉱油オーバーレイを遠心培養液からサンプリングし、ＵＰＬＣ分析にかけた（実施例１参照）。その結果を表６に示し、野生型ＡＴＦを用いたレチニルアセテートのパーセンテージ（１００％として設定される）に対する変異ＡＴＦを用いたレチニルアセテートのパーセンテージを示す。示されるように、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）おける２つ以上の変異を保持するＬｍＡＴＦ１の使用によって、ＬｍＡＴＦ１野生型を用いた場合の２倍までの範囲でレチニルアセテートのパーセンテージが増加する。
グルコース上で構成的プロモーターから発現されたＬｍＡＴＦ１変異体を含む宿主細胞において増殖させた場合に、同様な結果が得られた。つまり、表６に示すように野生型と比較して、変異を導入すると、レチニルアセテート形成が明らかに増加した。
［実施例５：炭素源としてキシロースを用いて変異ＡＴＦを発現するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチニルアセテートの産生］
この実施例において、炭素源としてキシロースを使用して、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチニルアセテートの産生が実証される。キシロースを使用したレチニルアセテートの産生が、炭素源としてグルコースを使用した産生と比較される。
この実施例において、炭素源としてキシロースを使用して、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレチニルアセテートの産生が実証される。キシロースを使用したレチニルアセテートの産生が、炭素源としてグルコースを使用した産生と比較される。
カロテノイド遺伝子発現カセットの形質転換。キシロース及び酢酸上での株ＲＮ１００１（国際公開第２０１２１２５０２７号パンフレット）の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）エンジニアリングによって、株ＲＮ１０１４（国際公開第２０１４１９５３７８Ａ１号パンフレット）が得られた。株ＲＮ１００１の遺伝子型は、ＭＡＴ ａ、ｕｒａ３－５２、ｌｅｕ２－１１２、ｇｒｅ３：：ｌｏｘＰ、ｌｏｘＰ－Ｐｔｐｉ：：ＴＡＬ１、ｌｏｘＰ－Ｐｔｐｉ：：ＲＫＩ１、ｌｏｘＰ－Ｐｔｐｉ－ＴＫＬ１、ｌｏｘＰ－Ｐｔｐｉ－ＲＰＥ１、デルタ：：ＰａｄｈｌＸＫＳ１Ｔｃｙｃ１－ＬＥＵ２、デルタ：：ＵＲＡ３－Ｐｔｐｉ－ｘｙｌＡ－Ｔｃｙｃ１である。
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に対してコドン最適化されたキサントフィロマイセス・デンデロース（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）からの３つのカロテノイド遺伝子発現カセット、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔＩを株ＲＮ１０１４に形質転換した。国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの実施例９に記載のＣＲＩＳＰＲアプローチを用いて、発現カセットをＩＮＴ１組込み部位に組み込んだ。強力な構成的プロモーター（国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの配列番号１３９、配列番号１４２及び配列番号１４８参照）及びドナーＤＮＡフランク配列（国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの配列番号１４９及び配列番号１５２参照）を含有する発現カセットをＲＮ１０１４に形質転換した。ＩＮＴ１ゲノム標的（プロトスペーサー）の配列は国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの配列番号１７６に記載される。ＩＮＴ１組込み部位は、染色体ＸＶ上に位置するＮＴＲ１（ＹＯＲ０７１ｃ）とＧＹＰ１（ＹＯＲ０７０ｃ）間の非コード領域に位置する。ＬｉＡｃ／サケ***（ＳＳ）担体ＤＮＡ／ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５０，ｐ．８７－８６，２００２）を用いて、Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，３５，ｐ．２０１－２１１，２０１８）に記載のＤＮＡ濃縮物を使用して、株ＲＮ１０１４を形質転換する。
ヌルセオトリシン（ＮａｔＭＸ，Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））２００μｇ及びＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ），Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，オランダ（ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））２００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天（酵母抽出物１０グラム／リットル、ペプトン２０グラム／リットル、ブドウ糖２０グラム／リットル、寒天２０グラム／リットル）上に、形質転換混合物をプレーティングした。プレートにコロニーが現れるまで、その寒天平板を３０℃でインキュベートする。
キサントフィロマイセス・デンデロース（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）由来の３つの遺伝子、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔＩがサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導入且つ過剰発現され、その形質転換体が、着色化合物であり、その結果として着色形質転換体が生じる最終生成物として、βカロチンを有するカロテノイドを産生する （Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．１３，ｐ．４３４２－４３５０，２００７）。うまく形質転換されたＲＮ１０１４細胞の第一の指標は、着色された形質転換体の外観であるｃｒｔドナーＤＮＡ発現カセットの正しい組込みは、ＰＣＲによって、例えば形質転換体から単離されたゲノムＤＮＡを用いて、当業者に公知の方法を使用して確認することができる。ＲＮ１０１４形質転換体におけるカロテノイド産生は、国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの実施例９に記載のように決定することができる。
続いて、Ｃａｓ９を発現するプラスミドｐＣＳＮ０６１（配列番号３１）を維持しながら、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔＩ発現カセットを含有するＰＲＮ１０１４形質転換体から、ガイドＲＮＡ発現プラスミドを除去する。Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌで補足されたＹＰＤ培地においてコロニーを接種し、振盪インキュベータにおいて３０℃にて２５０ｒｐｍで少なくとも２日間、振盪フラスコ中の液体培養物をインキュベートする。Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌで補足されたＹＰＤ－寒天平板上にアリコートを画線し、プレートを３０℃にて少なくとも２日間インキュベートする。Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌで補足されたＹＰＤ寒天平板、並びにＧ４１８ ２００μｇ及びヌルセオトリシン（ＮａｔＭＸ，Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ドイツ）２００μｇ／ｍｌで補足されたＹＰＤ寒天平板上に単一コロニーを再び画線する。そのプレートを３０℃にて少なくとも２日間インキュベートする。ガイドＲＮＡプラスミドの損失を示す、Ｇ４１８及びヌルセオトリシン含有プレート上ではなく、Ｇ４１８含有プレート上で増殖する単一コロニーが選択される。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹＢ及びｃｒｔＩ発現カセット、並びにＣａｓ９を発現するプラスミドｐＣＳＮ０６１を含有する、このＰＲＮ１０１４形質転換体は、ＰＲＮ１０１４＿ｃｒｔＥ＿ｃｒｔＹＢ＿ｃｒｔＩ＋ｐＣＳＮ０６１株と呼ばれる。
ＤｍＢＣＯ、ＨｓＲＤＨ１２及びＬｍＡＴＦ１（野生型及び変異型）ドナーＤＮＡ発現カセットのアセンブリ及び増幅。中間体レチナール及びレチノールを経てレチニルアセテートへとβカロチンを変換するために、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）βカロチンオキシターゼ（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化配列番号２０によるＤｍＢＣＯ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）レチノールデヒドロゲナーゼ（サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化配列番号２４によるＨｓＲＤＨ１２）及びラカンセア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｍｉｒａｎｔｉｎａ）アセチルトランスフェラーゼ（ＬｍＡＴＦ１，配列番号４による野生型、又は変異型）遺伝子を含有する３つの発現カセットをＰＲＮ１０１４＿ｃｒｔＥ＿ｃｒｔＹＢ＿ｃｒｔＩ＋ｐＣＳＮ０６１株に形質転換する。
ＤｍＢＣＯ、ＨｓＲＤＨ１２及びＬｍＡＴＦ１（野生型又は変異型）遺伝子をコードする二本鎖ドナーＤＮＡカセットは、国際公開第２０１３１４４２５７Ａ１号パンフレットの実施例１に記載のバックボーンベクターを受け入れる適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において個々のプロモーター（Ｐ）、ｏｒｆ（Ｏ）及びターミネーター（Ｔ）配列のゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅ）アセンブリ反応を経て作成される。そのプロモーター及びターミネーター配列は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８Ｃ株（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１３，ｐ．３５－４３，１９８６）に由来する。ＴＤＨ３プロモーター及びＥＮＯ１ターミネーター配列、配列番号３３の一部が使用されて、ＤｍＢＣＯが発現される。ＰＧＫ１プロモーター及びＧＰＭ１ターミネーター配列、配列番号３４の一部が使用されて、ＨｓＲＤＨ１２が発現される。ＥＮＯ２プロモーター及びＡＤＨ１ターミネーター配列、配列番号３５～配列番号４２の一部が使用されて、ＬｍＡＴＦ１野生型又は変異配列が発現される。プロモーター、ＯＲＦ及びターミネーターＤＮＡ配列は、合成ＤＮＡ供給業者、例えばＡＴＵＭ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて合成され、別々の標準クローニングベクターにおいて送達される。受け入れバックボーンベクター（国際公開第２０１３１４４２５７Ａ１号パンフレット，実施例１）は、コネクター２５及び２Ａ配列（配列番号３３の一部）、コネクター２Ａ及び２Ｂ配列（配列番号３４の一部）、又はコネクター２Ｂ及び２３配列（例えば、配列番号３５の一部）を含有する。作成された配列は、その５’及び３’末端に５０塩基対（ｂｐ）コネクター配列を含有し、それによって、国際公開第２０１３１４４２５７Ａ１号パンフレットの実施例１に記載のサッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＤＮＡ断片の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）組換えが可能となる。得られる配列の概要を表７に示す。
構築されたＰＯＴカセットは、表７に示すプライマーとのＰＣＲ反応によって、且つ鋳型としてゴールデンゲート反応により生成されるプラスミドを用いて増幅されて、ＰＲＮ１０１４＿ｃｒｔＥ＿ｃｒｔＹＢ＿ｃｒｔＩ＋ｐＣＳＮ０６１株に形質転換するためのドナーＤＮＡ断片が得られる。Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダによって供給される、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの一部，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．カタログ番号Ｍ０４９２Ｓ）がＰＣＲ反応に使用され、製造元の説明書に従って行われる。ＰＣＲ断片のサイズは、アガロース電気泳動標準技術で確認される。ＰＣＲ断片は、製造元の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ（Ｂｉｏｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダによって供給されているＭａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製される。ＤＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮＤ－１０００分光光度計，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定される。
ＤＮＡフランク配列の増幅。ゲノムｇＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ＣＥＮ．ＰＫ系統（例えば、ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｃ、ＭＡＴａ；ｈｉｓ３Ｄ１；ｌｅｕ２－３＿１１２；ｕｒａ３－５２；ｔｒｐ１－２８９；ＭＡＬ２－８ｃ；ＳＵＣ２）の酵母株から、又は酢酸リチウムＳＤＳ法（Ｌｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５０，ｐ．３２５－３２８，２０１１）を用いたＰＲＮ１０１４株から単離される。ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｃ株は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦコレクション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｓｃａｒｆ．ｄｅ，フランクフルト，ドイツ）から入手可能である。
単離されたゲノムＤＮＡは上述のようにＰＣＲ反応において鋳型として使用されて、ゲノム組込み用の、及びコネクター配列を含むゲノムＤＮＡとのオーバーラップを含む、ＤＮＡフランキング配列（配列番号５３及び配列番号５４）のドナーとして使用されるＰＣＲ断片が、表７に示す特定のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを使用して得られる。ドナーＤＮＡフランク配列は、５’又は３’位置に５０ｂｐコネクター配列を含有する。コネクター配列が存在することにより、国際公開第２０１３１４４２５７Ａ１号パンフレットの実施例１に記載のように、ドナーＤＮＡ発現カセットの一部でもあるコネクター配列間のｉｎ ｖｉｖｏ組換えが可能となる。
ガイドＲＮＡ発現カセット。ガイドＲＮＡ発現カセットは、合成ＤＮＡカセットとしてオーダーされる（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，ＢｅｌｇｉｕｍのｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子断片）。そのガイドＲＮＡ発現カセット（配列番号５５）は、ＩＮＴ７０ゲノム標的（プロトスペーサー）配列（配列番号５６）を含む、国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの実施例９に記載の異なる要素からなる。ＩＮＴ７０ガイドＲＮＡ発現カセットは、酵母における形質転換及びｉｎ ｖｉｖｏ組換えで、国際公開第２０１６１１０５１２号パンフレットの実施例９に説明されるヌルセオトリシンに対する選択を可能にする環状ベクターを生じる、ｐＲＮ１１２０ベクター（配列番号３２）を有するオーバーラップ配列を含有する。
ｇＢｌｏｃｋは、製造元の説明書に従ってｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクター（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）にライゲートされる。鋳型としてｇＢｌｏｃｋを含有するＴＯＰベクター、配列番号５７及び配列番号５８で定められる、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）及びプライマーを使用した場合、ガイドＲＮＡ発現カセットＰＣＲ断が、製造元の説明書に従ってＰＣＲ反応において産生される。そのガイドＲＮＡ発現カセットＰＣＲ断片は、製造元の説明書に従ってＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｂｉｏｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダによって市販されている、Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製される。ＮａｎｏＤｒｏｐ （ＮＤ－１０００分光光度計，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＤＮＡ濃度が測定される。
酵母形質転換実験。ＬｉＡｃ／サケ***（ＳＳ）担体ＤＮＡ／ＰＥＧ法（Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，上記参照）を用いて、ＰＲＮ１０１４＿ｃｒｔＥ＿ｃｒｔＹＢ＿ｃｒｔＩ＋ｐＣＳＮ０６１株を形質転換する。
形質転換の前に、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを使用して、プラスミドｐＲＮ１１２０（配列番号３２）を直鎖状にする。次に、ＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｂｉｏｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダによって市販されているＭａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して、製造元の説明書に従って直鎖状ベクターを精製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮＤ－１０００分光光度計，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＤＮＡ濃度が測定される。
様々な形質転換実験の概要を表８に示す。それぞれの形質転換実験において、以下の量のドナーＤＮＡが形質転換混合物に添加される：直鎖状ｐＲＮ１１２０プラスミド１００～１０００ｎｇ、各ドナー発現カセット１００～１０００ｎｇ、各ドナーＤＮＡフランク配列１００～１０００ｎｇ、及びＩＮＴ７０ガイドＲＮＡ発現カセット（配列番号５５）１００～１０００ｎｇ。例えば、直鎖状ｐＲＮ１１２０プラスミド１００ｎｇ、各ドナー発現カセット２００ｎｇ、各ドナーＤＮＡフランク配列１００ｎｇ及びＩＮＴ７０ガイドＲＮＡ発現カセット（配列番号５５）７５０ｎｇが添加される。
ドナーＤＮＡ発現カセット及びＤＮＡフランク配列が集合して、図１に示す標的化ＩＮＴ７０遺伝子座にてすべてのドナーＤＮＡの組込みを可能にする、５０ｂｐ相同的コネクター配列を介してＤＮＡの直鎖状ストレッチを形成する。ＩＮＴ７０組込み部位は、ＣＥＮ．ＰＫゲノムの染色体ＸＩＶ上に位置するＡＡＤ１４（ＹＮＬ３３１ｃ）及びＧＹＰ１（ＹＮＬ３３０ｃ）間の非コード領域に位置する。
ヌルセオトリシン（ＮａｔＭＸ，Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ドイツ）２００μｇ及びＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，オランダ）２００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天（酵母抽出物１０グラム／リットル、ペプトン２０グラム／リットル、ブドウ糖２０グラム／リットル、寒天２０グラム／リットル）上に形質転換混合物をプレーティングする。代替方法として、ＹＰ寒天における炭素源として、ブドウ糖２０グラム／リットルをキシロース２０グラム／リットルに取り換える。３０℃でインキュベーションすると、コロニーが形質転換プレート上に現れる。
増殖実験及び分析。炭素源としてグルコース又はキシロースを用いたレチニルアセテートの産生を実証するために、以下の手順に従う：最初に、表８に記載の形質転換実験から得られる形質転換体を、炭素源として２％グルコース又は２％キシロースで補足された１０ｍｌ ＹＰ（酵母抽出物１０／リットル、ペプトン２０グラム／リットル）培地を含有する振盪フラスコに接種し、十分な増殖が確認されるまで、振盪インキュベータにおいて３０℃及び２５０ｒｐｍにて増殖させる。続いて、光学濃度０．１～１．０が達成されるように、２％キシロースで補足された、振盪フラスコ内の１０ｍｌ ＹＰ培地に、グルコース又はキシロース前培養物のアリコートを移す。また、光学濃度０．１～１．０が達成されるように、２％グルコースで補足された、振盪フラスコ内の１０ｍｌ ＹＰ培地に、グルコース前培養物のアリコートを移す。振盪フラスコとして、バッフル付き振盪フラスコ及びバッフルが付いていない振盪フラスコを使用することができる。液体培養物を鉱油５００μｌ（Ｄｒａｋｅｏｌ ５，Ｐｅｎｒｅｃｏ，Ｋａｒｎｓ Ｃｉｔｙ，ＰＡ ＵＳＡ）でオーバーレイする。培養物を振盪インキュベータにおいて３０℃、振盪速度２５０～８００ｒｐｍで２～４日間増殖させる。培養物からオイル画分を除去し、実施例１に記載のように光ダイオードアレイ検出器を備えたＵＰＬＣ逆相カラムによって分析する。
代替方法としては、Ｓｕｎら（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．８（９），ｐ．２１３１－２１４０，２０１９）によって記載のように、形質転換体を試験する。
表８に記載の各形質転換実験のｐＲＮ１０１４由来形質転換体におけるキシロース及びグルコースからのレチニルアセテートの産生を比較する。キシロース上で増殖するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において変異ＡＴＦ１を発現した場合に、グルコース又はガラクトース上で増殖した場合に得られる、少なくとも～の範囲で、レチニルアセテートのパーセンテージが増加すると予想される。
Claims (14)
- 配列番号１と少なくとも約２０％、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は１００％までの同一性を有する配列における、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、レチニルアセテートへのレチノールのアセチル化に関与する修飾酵素、特に真菌酵素であって、前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、５２６位及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置する、修飾酵素。
- 配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、７３、１７１、１７４、１７６、１７８、２９１、２９２、２９４、３０１、３０７、３０８、３１１、３１２、３２０、３２２、３３４、３６２、４０５、４０７、４０９、４８０、４８３、４８４、４９０、４９２、５２０、５２１、５２２、５２４、５２５、及び５２６位からなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置に位置する単一アミノ酸置換を含む、請求項１に記載の修飾酵素。
- 配列番号１によるポリペプチドにおける４８０と４０９、４８０と４０７、又は４０７と４０９から選択されるアミノ酸残基に相当する位置の少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の修飾酵素。
- 配列番号１によるポリペプチドにおける６８、６９、７２、３１１、３３４、４８４位、及びその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基に相当する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項３に記載の修飾酵素。
- ４８０位に相当する前記置換残基がリジン又はグルタミンであり、４０９位に相当する前記置換残基がアラニンであり、４０７位に相当する前記置換残基がイソロイシンであり、６９位に相当する前記置換残基がアラニン、アスパラギン又はセリンであり、且つ任意に、７２位にリジン及び／又は３１１位にイソロイシン及び／又は６８位にトレオニン及び／又は３３４位にロイシン及び／又は４８４位にロイシンをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾酵素。
- レチニルアセテートへのレチノールの変換又はアセチル化に対する活性が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を含まない各レチノール－アセチル化酵素と比較して、約０．２～４倍の範囲で増加する、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾酵素。
- レチノール産生宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される真菌宿主細胞において発現される、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾酵素。
- 前記修飾酵素は、配列番号１によるポリペプチドにおけるＮ２１８～Ｇ２２４に相当する、Ｐｒｏｓｉｔｅシンタックスにおけるモチーフを有する、［ＮＤＥＨＣＳ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択される、少なくとも７つのアミノ酸残基の高度に保存された部分アミノ酸配列を含み、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、中央のヒスチジンは、酵素の結合ポケットの一部であり、好ましくは、７アミノ酸モチーフが、［ＮＤＥ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、より好ましくは［ＮＤ］－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択され、最も好ましくは配列番号１によるポリペプチドにおけるＮ２１８～Ｇ２２４位に相当するＮ－Ｈ－ｘ（３）－Ｄ－［ＧＡ］から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾酵素。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾酵素を含み、且つそれを発現することができる、レチノイド産生宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞。
- グルコース、フルクトース、ラフィノース、ラクトース、ガラクトース、グリセロール、キシロース、アラビノース、スクロース又はマルトースから選択される、好ましくはグルコース、ガラクトース又はキシロースから選択される炭素源を用いた適切な培養条件下での、請求項９に記載の宿主細胞の培養を含む、レチノイドの産生プロセス。
- 各非修飾酵素を含む宿主細胞と比較して、請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾酵素を発現する宿主細胞を使用した場合に、レチニルアセテートのパーセンテージが約０．２～４倍増加する、請求項１０に記載のプロセス。
- 請求項９に記載のレチノール産生宿主細胞を提供する工程と、適切な培養条件下にて適切な培地で前記宿主細胞を培養する工程と、任意に、前記培地から前記レチニルアセテートを単離し、且つ／又は精製する工程と、を含むレチニルアセテートを産生するプロセス。
- 前記宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくは、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞を、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾酵素で形質転換することを含む、レチノール産生宿主細胞におけるレチニルアセテートへのレチノールの変換を少なくとも約０．３増加するプロセス。
- 前記宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくは、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される宿主細胞を、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾酵素で形質転換することを含む、レチノール産生宿主細胞における総レチノイドの産生を少なくとも２倍増加するプロセス。
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