CN111108194A

CN111108194A - 视黄醇的生产

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Publication number: CN111108194A
Application number: CN201880061519.7A
Authority: CN
Inventors: 娜塔莉·鲍尔奇; 保罗·布洛姆奎斯特; 立德·多顿; 彼得·休斯顿; 伊桑·林; 珍娜·麦克马洪; 约书亚·特鲁哈特; 席琳·维亚罗格
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2020-05-05
Also published as: US20200248151A1; BR112020005757A2; WO2019057998A1; JP2020534808A; EP3688148A1

Abstract

本发明涉及经由视黄醛的转换来生产维生素A醇(视黄醇)的新颖酶促方法，所述方法包括使用具有视黄醛还原酶活性的异源酶，特别地其中所述反应导致至少约90％的视黄醛被转换成视黄醇。所述方法对于维生素A的生物技术生产特别有用。

Description

视黄醇的生产

本发明涉及经由视黄醛(retinal/retinaldehyde)的转换来生产维生素A醇(视黄醇)的新颖酶促方法，所述方法包括使用具有视黄醛还原酶活性的异源酶，特别地其中所述反应导致至少约90％的视黄醛被转换成视黄醇。所述方法对于维生素A的生物技术生产特别有用。

视黄醇是类视黄醇生产方法，特别是诸如维生素A生产方法中的重要中间体/前体。类视黄醇，包括维生素A，是必须经由营养品供应给人类的非常重要且不可缺少的营养因子之一。类视黄醇促进人类的健康，尤其是在视觉、免疫***和生长方面。

目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，包括微生物转换步骤，这将更加经济和环保。

通常，产生类视黄醇的生物***在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不可行的。造成这种情况的原因有一些，包括类视黄醇在此类生物***中的不稳定性或副产物的相对高产量。

因此，改善β-胡萝卜素酶促转换为维生素A的产物特异性和/或生产率是一项持续存在的任务。特别地，期望优化参与视黄醛朝向视黄醇的转换的酶的生产率，即寻找具有高视黄醛还原活性的酶。

令人惊讶地，我们现在能够鉴定特异性的视黄醇脱氢酶(RDH)，所述RDH能够将视黄醛转换为视黄醇，其中总转换率是至少约90％朝向视黄醇生成。

特别地，本发明涉及RDH，优选地真菌RDH，所述RDH在合适的宿主细胞，诸如产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中异源表达，所述RDH具有将视黄醛还原为视黄醇的活性，其中基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇的总量，朝向视黄醇产生的总转换率为至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％，即与由所述宿主细胞产生的所述类视黄醇混合物中存在的视黄醛的量相比，视黄醇的量为至少约90％。

在一个方面中，本发明优选地涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是产生类视黄醇的宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所限定的RDH，所述宿主细胞产生包含视黄醇和视黄醛两者的视黄醛混合物，其中基于所述视黄醇混合物中的类视黄醇(包括视黄醛/视黄醇)的总量，所述视黄醇的百分比是至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％。

术语“视黄醛还原酶”、“视黄醇脱氢酶”、“具有视黄醛还原活性的酶”或“RDH”在本文中可互换使用，并且是指酶[EC 1.1.1.105]，所述酶[EC 1.1.1.105]能够催化视黄醛转换为视黄醇，以及还有产生视黄醛的逆向反应，根据本发明，所述逆向反应的活性将降低到约10％或更低。

与视黄醇的酶促催化有关的术语“转换”、“氧化”、“还原”在本文中可互换使用，并且是指如本文所限定的RDH的作用。

如本文所用，术语“真菌宿主细胞”尤其包括酵母作为宿主细胞，例如耶氏酵母属(Yarrowia)或酵母属(Saccharomyces)。

优选地将如本文所限定的导致总转换率为至少约90％由视黄醛的酶促催化朝向视黄醇产生的RDH引入合适的宿主细胞，即表达为异源酶，或可以表达为内源酶。优选地，如本文所述的酶表达为异源酶。

出于本发明的目的，导致视黄醇形成增加至少约18％，诸如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的任何视黄醛还原酶均可用于如本文所限定的方法中，所述增加是基于使用合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞(特别是真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属的菌株)中存在的内源性RDH的视黄醇形成计算的。

如本文所限定的具有朝向视黄醇形成，即视黄醛还原反应的活性的RDH可以从任何来源获得，诸如植物、动物(包括人)、藻类、真菌(包括酵母)，或细菌。

在一个实施方式中，具有如本文所限定的RDH活性，即总转换率为至少90％朝向视黄醇的多肽，可获自真菌，特别是双核菌亚界(Dikarya)或毛霉亚门(Mycoromycetes)，包括但不限于选自子囊菌门(Ascomycota)或毛霉目(Mucorales)的真菌，优选地获自镰刀菌属(Fusarium)或毛霉属(Mucor)，更优选地是从藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)或卷枝毛霉菌(M.circinelloides)分离的，诸如与藤仓镰刀菌FfRDH12(来源于EXK27040的多肽序列)或卷枝毛霉菌McRDH12(来源于EPB85547.1的多肽序列)具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，例如与根据SEQ IDNO:1的多肽(包括由例如根据SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的多肽)具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。

在另外的实施方式中，具有如本文所限定的RDH活性，即总转换率为至少90％朝向视黄醇的多肽，可获自动物(包括人)，优选地获自大鼠或人，诸如人HsRDH12(来源于NP_689656.2的多肽序列)或大鼠RnRDH12(来源于NP_001101507.1的多肽序列)，例如与由SEQID NO:5或SEQ ID NO:6编码的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。

在一个实施方式中，如本文所述的宿主细胞能够转换视黄醛，其中总转换率为至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％朝向视黄醇产生。优选地，此类转换是从在宿主细胞中产生的包含至少约61％的百分比的反式视黄醛，诸如约61％至90％的反式同种型的视黄醛混合物获得的。视黄醛可以经由以下方式获得：在相应β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，诸如优选地黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)BCO、DmNinaB、或与根据SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性的多肽的催化下，将β-胡萝卜素转换为视黄醛。优选地，要通过如本文所限定的RDH的作用转换为视黄醇的视黄醛混合物包含至少61-65％的反式视黄醛，诸如约61％至90％的反式同种型，然而，根据本发明的RDH的活性/转换率不依赖于反式视黄醛和顺式视黄醛的百分比。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含(1)立体选择性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，即反式特异性BCO，所述BCO催化β-胡萝卜素转换为顺式视黄醛和反式视黄醛的混合物，其中所述视黄醛混合物中至少61％的百分比是反式视黄醛；(2)如本文所限定的特异性RDH，所述特异性RDH催化视黄醛(例如这样的视黄醛混合物，其中基于所述混合物中视黄醛的总量，至少61％的百分比是反式视黄醛)转换为视黄醇，总转换率是至少约90％朝向视黄醇。

如本文所限定的此类BCO的示例可以从任何来源获得，诸如植物、动物、细菌、真菌、藻类。特别有用的立体选择性BCO获自真菌，尤其是双核菌亚界(Dikarya)，包括但不限于选自子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)的真菌，优选地获自镰刀菌属(Fusarium)或黑粉菌属(Ustilago)，更优选地是从藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)或玉米黑粉菌(U.maydis)分离的，诸如FfCarX(来源于AJ854252的多肽序列)、UmCCO1(来源于EAK81726的多肽序列)。此外，特别有用的立体选择性BCO获自昆虫，特别是双翅目(Diptera)，优选地获自果蝇属(Drosophila)，更优选地获自黑腹果蝇(D.melanogaster)，诸如DmNinaB或DmBCO(来源于NP_650307.2的多肽序列)。此外，特别有用的立体选择性BCO获自植物，特别是被子植物(Angiosperms)，优选地获自番红花属(Crocus)，更优选地获自番红花(C.sativus)，诸如CsZCO(来源于Q84K96.1的多肽序列)。此外，特别有用的立体选择性BCO获自真核生物，特别是鱼类(pesces)，优选地获自短担尼鱼属(Danio)或真鮰属(Ictalurus)，更优选地获自斑马鱼(D.rerio)

或斑点叉尾鮰(I.punctatus)，诸如DrBCO1(来源于Q90WH4的多肽序列)、IpBCO(来源于XP_017333634的多肽序列)。

在本发明的一个优选方面中，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，包含(1)立体选择性BCO，所述立体选择性BCO选自果蝇属(Drosophila)，诸如黑腹果蝇(D.melanogaster)，优选地是根据SEQ ID NO:3的多肽，以及(2)如本文所限定的具有朝向视黄醇生成的活性的RDH，所述RDH选自真菌，诸如镰刀菌属(Fusarium)，优选地选自藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)，更优选地是FfRDH12(SEQ ID NO:1)。

用于使如本文所限定的宿主细胞产生更多蛋白质(诸如如本文所限定的具有朝向视黄醇形成的选择性的反式选择性BCO或RDH)和/或基因拷贝的修饰可以包括：使用强启动子、合适的转录和/或翻译增强子，或将一个或多个基因拷贝引入产生类胡萝卜素的宿主细胞中，导致在给定时间内相应酶的积累增加。技术人员知道根据宿主细胞使用哪些技术。基因表达的增加或减少可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。

可以以不同的方式来进行在核酸或氨基酸中生成突变，即诱变，诸如通过随机诱变或定点诱变，由诸如辐射等试剂(agents)引起的物理损伤，化学处理，或***遗传元件。技术人员知道如何引入突变。

因此，本发明涉及如本文所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所述的RDH的表达载体或已整合到宿主的染色体DNA中的编码如本文所述的RDH的多核苷酸。此类产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞被称为重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含在表达载体上或整合到染色体DNA中的编码如本文所述的RDH的异源多核苷酸。产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，可包含编码如本文所限定的RDH的基因的一个或多个拷贝，诸如编码与根据SEQ ID NO:1的多肽具有至少约60％同一性的多肽的多核苷酸，从而导致编码如本文所限定的RDH的此类基因过表达。基因表达的增加可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。

基于如本文所公开的序列和以至少约90％的总转换率将视黄醛还原为视黄醇的偏好，能够容易地推断出编码如本文所限定的具有视黄醛还原活性的多肽的其他合适基因，所述多肽能够用于将视黄醛转换为视黄醇，特别地其中待被转换的视黄醛混合物中反式视黄醛的百分比是至少约61％，诸如所述视黄醛混合物中存在至少约61％至90％的反式视黄醛。因此，本发明涉及一种鉴定新颖视黄醛还原酶的方法，其中将与藤仓镰刀菌RDH12(SEQ ID NO:1)具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性的多肽用作新颖视黄醛还原酶筛选方法中的探针，所述新颖视黄醛还原酶偏好于以至少约90％的总转换率产生视黄醇。任何具有RDH活性的多肽均可用于如本文所述从视黄醛产生视黄醇，只要与反应混合物中视黄醛的量相比，还原作用导致至少约90％的视黄醇即可。因此，要用于根据本发明的方法的合适的RDH包括这样的酶，诸如基于从将视黄醇转换为视黄醛(逆向反应)获得的类视黄醇的总量，所述酶能够产生约10％或更少的视黄醛。

本发明特别地涉及所述新颖视黄醛还原酶在视黄醇生产方法中的用途，其中通过如本文所限定的所述RDH的作用的视黄醛产生已减少或消除，并且其中视黄醇产生已增加，从而导致在类视黄醇混合物中视黄醇与视黄醛之间的比值为至少约9:1。该方法可以用表达所述RDH的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞执行，优选地其中编码所述RDH的基因是异源表达的，即被引入到所述宿主细胞中。视黄醇可以通过(已知的)合适机制的作用而被进一步转换为维生素A。

如本文所用，降低或消除的朝向将视黄醇转换为视黄醛的活性意指相对于朝向视黄醇产生的酶促活性，朝向视黄醛产生的活性降低。如本文所用，使朝向将视黄醇转换为视黄醛的活性降低或消除，即改善朝向将视黄醛还原为视黄醇的产物比，意指类视黄醇混合物中视黄醇与视黄醛之间的产物比为至少约9:1，诸如9.1:1、9.2:1、9.5:1、9.8:1或至多10:1，所述产物比是用如本文所限定的特异性RDH实现的。

类视黄醇混合物中的视黄醛量的减少或消除是指基于经由如本文所限定的RDH的酶促作用产生的类视黄醇的总量，将类视黄醇混合物中的视黄醛限制在约10％或更少。

如本文所限定的视黄醛还原酶的使用导致与未修饰的(仅)携带内源RDH的宿主细胞，诸如没有关于视黄醛还原的进一步遗传修饰，即表达宿主细胞中存在的内源真菌RDH同源物的真菌宿主细胞(诸如耶氏酵母属(Yarrowia)或酵母属(Saccharomyces))相比，总转换率提高至少约18％，例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％。

如本文所用，关于视黄醇产生，特别是关于使用如本文所限定的RDH由视黄醛转换而进行的视黄醇产生的术语“至少约90％”，是指至少约90％，诸如92％、95％、98％或至多100％的视黄醛被转换为视黄醇。关于视黄醛产生，特别是关于使用如本文所限定的RDH由视黄醇转换而进行的视黄醛产生的术语“约10％或更少”，是指所产生的视黄醇的约10％或更少，诸如8％、7％、5％、2％或直至0％被转换回视黄醛。所有这些数字是基于如本文所限定的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞中存在的类视黄醇混合物中的视黄醛和视黄醇的量。

术语“序列同一性”、“％同一性”或“序列同源性”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此限定，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(2000)Rice,Longden和Bleasby,Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。

如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。如果所比较的两个氨基酸序列在他们的任何氨基酸上都没有差异，则它们是相同的或具有100％的同一性。关于本文所限定的源自植物的酶，技术人员知道植物来源的酶可包含叶绿体靶向信号，所述叶绿体靶向信号将经由特定的酶(例如叶绿体加工酶(chloroplast processing enzyme,CPE))被切割。

取决于宿主细胞，如本文所限定的多核苷酸可经优化以在相应宿主细胞中表达。技术人员知道如何生成此类经修饰的多核苷酸。应当理解的是，如本文所限定的多核苷酸还包括此类经宿主优化的核酸分子，只要它们仍表达具有如本文所限定的相应活性的多肽即可。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所限定的RDH的多核苷酸，所述多核苷酸经优化以在所述宿主细胞中表达，而不影响宿主细胞的生长或酶的表达模式。特别地，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，选自耶氏酵母属，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，其中编码如本文所限定的RDH的多核苷酸选自与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多核苷酸。

如本文所限定的RDH还包括带有不改变酶活性的一种或多种氨基酸取代的酶，即所述酶相对于野生型酶显示出相同的性质并且催化视黄醛转换为视黄醇，特别地其中总转换率为至少约90％朝向视黄醇产生。此类突变也称为“沉默突变”，其不改变如本文所述的酶的(酶促)活性。

根据本发明的核酸分子可仅包含由本发明提供的核酸序列的部分或片段，诸如多核苷酸序列或根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，例如可用作探针或引物的片段或编码如本文所限定的RDH的部分的片段。由RDH基因的克隆确定的核苷酸序列允许生成被设计用于鉴定和/或克隆来自其他物种的其他同源物的探针和引物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸，所述基本上纯化的寡核苷酸通常包含优选在高度严格条件下与根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的核苷酸序列的至少约12个或15个，优选约18个或20个，更优选约22个或25个，甚至更优选约30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或75个或更多个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域，或其片段或衍生物。

此类杂交条件的优选的非限制性示例是在约45℃下于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下，优选在55℃下，更优选在60℃下，甚至更优选在65℃下在1x SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。

高度严格条件包括例如在42℃下使用洋地黄毒苷(DIG)标记的DNA探针(通过使用DIG标记***；Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,德国制备)在含有或不含有100μg/ml鲑鱼精DNA的溶液(诸如DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH))，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基硫酸钠、0.1％的N-月桂酰肌氨酸和2％的封闭剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中孵育2h至4天，然后在室温下在2xSSC和0.1％SDS中将滤器(filters)洗涤两次(持续5至15分钟)，以及然后在65-68℃下在0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗涤两次(持续15-30分钟)。

编码如本文所限定的特异性RDH中的一种的多核苷酸/酶的表达可以在任何宿主***中实现，所述宿主***包括适于类胡萝卜素/类视黄醇产生并且允许表达编码如本文所公开的酶(包括如本文所述的功能等同物或衍生物)中的一种的核酸的任何(微)生物。合适的产生类胡萝卜素/类视黄醇的宿主(微)生物的示例是细菌、藻类、真菌(包括酵母)、植物或动物细胞。优选的细菌是以下属的细菌：埃希氏菌属(Escherichia)，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)；链霉菌属(Streptomyces)；泛菌属(Pantoea)(欧文氏菌属(Erwinia))；芽孢杆菌属(Bacillus)；黄杆菌属(Flavobacterium)；聚球藻属(Synechococcus)；乳杆菌属(Lactobacillus)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；微球菌属(Micrococcus)；Mixococcus；短杆菌属(Brevibacterium)；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)；戈登氏菌属(Gordonia)；迪茨氏菌属(Dietzia)；鼠尾菌属(Muricauda)；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)；集胞藻属(Synochocystis)；副球菌属(Paracoccus)，诸如产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)。优选的真核微生物，特别是真菌(包括酵母)，选自酵母属(Saccharomyces)，诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；曲霉属(Aspergillus)，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；毕赤酵母属(Pichia)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；汉逊酵母属(Hansenula)，诸如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；须霉属(Phycomyces)，诸如布氏须霉(Phycomycesblakesleanus)；毛霉属(Mucor)；红酵母属(Rhodotorula)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)；法夫酵母属(Xanthophyllomyces)；发夫酵母属(Phaffia)；布拉霉属(Blakeslea)，诸如三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)；或耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别地，优选的是在真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属中表达，或在埃希氏菌属中表达，更优选地在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。

关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。

如本文所用，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致产生类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素。用于生成产生类胡萝卜素的宿主细胞的基因和方法是本领域已知的，参见例如WO2006102342。取决于要产生的类胡萝卜素，可以涉及不同的基因。

如本文所用，产生类视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致经由β-胡萝卜素的酶促转换经由视黄醛和视黄醇产生类视黄醇，例如维生素A及其前体。这些多肽包括如本文所限定的RDH。维生素A途径的基因和生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域已知的。优选地，β-胡萝卜素经由β-胡萝卜素氧化酶的作用被转换为视黄醛，所述视黄醛经由如本文所限定的RDH的作用被进一步转换为视黄醇，并且所述视黄醇经由乙酰转移酶(诸如ATF1)的作用被转换为乙酸视黄酯(retinol acetate)。乙酸视黄酯可以是从宿主细胞中分离出来的选定的类视黄醇。

本发明涉及一种生产视黄醇的方法，特别地其中经由通过如本文所述的RDH的作用进行视黄醛还原而得到的总转换率为至少90％，其中所产生的类视黄醇混合物中的视黄醛的量为约10％或更少，其中视黄醛还原酶优选地在如本文所述的合适条件下在合适的宿主细胞中异源表达。可以从培养基和/或宿主细胞中分离产生的视黄醇，并任选地进一步纯化。在另一个实施方式中，视黄醇可以在产生维生素A的多步方法中用作前体。如本领域中已知的，可以从培养基和/或宿主细胞中分离维生素A，并任选地进一步纯化。

因此，本发明涉及一种降低类视黄醇混合物中视黄醛的百分比或提高类视黄醇混合物中视黄醇的百分比的方法，其中视黄醇是经由使如本文所限定的RDH中的一种与视黄醛接触而生成的，从而产生了百分比为至少约90％的视黄醇或约35％或更少的视黄醛的视黄醇/视黄醛混合物。特别地，所述方法包括(a)将编码如本文所限定的RDH中的一种的核酸分子引入如本文所限定的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别地真菌宿主细胞中，(b)经由所述表达的RDH的作用将视黄醛酶促切割为视黄醇，其中基于类视黄醇混合物中视黄醛和视黄醇的总量，视黄醇的百分比是至少90％，以及任选地(3)在技术人员已知的合适条件下将视黄醇，优选地反式视黄醇转换为维生素A。

宿主细胞，即微生物、藻类、真菌、动物或植物细胞，能够表达产生β-胡萝卜素的基因、如本文所限定的RDH基因、任选地编码β-胡萝卜素氧化酶的基因和/或任选地生物合成维生素A所需的其他基因，所述宿主细胞可以如技术人员关于不同宿主细胞所已知的那样在需氧或厌氧条件下在补充有适当营养物的水性培养基中培养。任选地，如本文所限定，所述培养是在参与电子转移的蛋白质和/或辅因子存在下进行的。宿主细胞的培养/生长可以以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。如本领域技术人员所已知的，取决于宿主细胞，优选地类视黄醇(诸如维生素A)和前体(诸如视黄醛、视黄醇)的产生可变化。选自耶氏酵母属的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008042338中。关于在选自大肠杆菌的宿主细胞中的类视黄醇产生，方法描述于例如Jang等人，MicrobialCell Factories,10:95(2011)中。在例如WO2014096992中公开了在酵母宿主细胞(诸如酿酒酵母)中生产β-胡萝卜素和类视黄醇的具体方法。

如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内和在限定温度下每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性表示为每mg蛋白质每分钟消耗的底物或形成的产物的μmol数。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，在本文件全文中可互换地使用μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义。如果酶在体内，即在如本文所限定的宿主细胞内，或在合适的底物存在下的***内，执行其催化活性，则所述酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文所限定的RDH的活性。评估如本文所限定的合适RDH用于由视黄醛转换进行视黄醇产生的能力的分析方法是本领域已知的，诸如在WO2014096992的实施例4中所述。简而言之，产物(诸如视黄醇、反式视黄醛、顺式视黄醛、β-胡萝卜素等)的滴度可通过HPLC测量。

如本文所用的类视黄醇包括β-胡萝卜素切割产物，也称为脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲醇盐(retinoicmethoxide)、视黄醇乙酸酯(retinyl acetate)、视黄酯(retinyl ester)、4-酮-类视黄醇、3羟基-类视黄醇，或它们的组合。包含视黄醛和视黄醇的混合物在本文中被称为“类视黄醇混合物”，其中关于视黄醇的百分比“至少约90％”或关于视黄醛的百分比“约10％或更少”是指此类类视黄醇混合物中的视黄醇与视黄醛的比值。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338中。

如本文所用的视黄醛是以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛已知的。视黄醛在本文中可互换地称为维生素A醛，并且包括顺式同种型和反式同种型两者，诸如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。

如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域公知的。它包括通过两个具有20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接而自然形成的长的40个碳缀合的类异戊二烯多烯。这些类胡萝卜素包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素，所述类胡萝卜素可以在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。

如本文所用的维生素A可以是水溶液中存在的维生素A的任何化学形式，诸如未解离的，其游离酸形式，或解离为阴离子。如本文所用的该术语包括生物技术维生素A途径中的所有前体或中间体。它还包含维生素A乙酸酯。

特别地，本发明的特征在于以下实施方式：

-一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]，所述宿主细胞产生包含视黄醛和视黄醇的类视黄醇混合物，其中与所述类视黄醇混合物中存在的视黄醛的量相比，视黄醇的百分比是至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中要经由所述视黄醇脱氢酶的作用而被还原的视黄醛包括反式视黄醛和顺式视黄醛的混合物，其中所述视黄醛混合物中的反式视黄醛的百分比在至少约61％至98％，优选地至少约61％至95％，更优选地至少约61％至90％的范围内。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含异源视黄醇脱氢酶。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自真菌，包括酵母，更优选地选自酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、布拉霉属(Blakeslea)或耶氏酵母属(Yarrowia)，甚至更优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)或副球菌属(Paracoccus)。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述视黄醇脱氢酶选自真菌，优选地镰刀菌属，更优选地藤仓镰刀菌，最优选地选自藤仓镰刀菌RDH12，特别地选自与根据SEQ ID NO:1的多肽或由根据SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的序列具有至少60％同一性的多肽。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述视黄醇被进一步转换为维生素A。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞还包含选自果蝇属的反式选择性β-胡萝卜素氧化酶，所述反式选择性β-胡萝卜素氧化酶催化β-胡萝卜素转换为视黄醛混合物，其中基于所述混合物中的视黄醛的总量，所述混合物包含至少约61％，优选地65％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的反式同种型视黄醛，更优选地选自与根据SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％同一性的序列。

-一种经由视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]的酶促活性生产包含视黄醇和视黄醛的类视黄醇混合物的方法，所述方法包括使视黄醛与所述视黄醇脱氢酶接触，其中所述类视黄醇混合物中视黄醇与视黄醛的比值为至少约9:1。

-一种降低由视黄醇脱氢酶的酶促作用产生的类视黄醇混合物中的视黄醛的量的方法，所述方法包括使视黄醛与如本文所限定的视黄醇脱氢酶接触，其中由所述酶促作用产生的所述类视黄醇混合物中的视黄醛的量与视黄醇的量相比，在约10％或更少的范围内。

-一种提高由视黄醇脱氢酶的酶促作用产生的类视黄醇混合物中的视黄醇的量的方法，所述方法包括使视黄醛与如本文所限定的视黄醇脱氢酶接触，其中由所述酶促作用产生的所述类视黄醇混合物中的视黄醇的量与视黄醇的量相比，在至少约90％的范围内。

-如上文和本文所限定的方法，所述方法使用所述产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]，所述宿主细胞产生包含视黄醛和视黄醇的类视黄醇混合物，其中与所述类视黄醇混合物中存在的视黄醛的量相比，视黄醇的百分比是至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％。

-一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将编码如本文所限定的视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中；

(b)将视黄醛酶促转换为类视黄醇混合物，所述类视黄醇混合物包含比值为至少约9:1的视黄醇和视黄醛；

(c)在合适的培养条件下将视黄醇转换为维生素A。

-如上文和本文所限定的视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]用于产生包含比值为至少约9:1的视黄醇和视黄醛的类视黄醇混合物的用途，其中所述视黄醇脱氢酶在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中异源表达。

以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文，特别是WO2006102342、WO2008042338或WO2014096992。

实施例

实施例1：通用方法、菌株和质粒

本文所述的所有基本分子生物学和DNA操纵程序通常是根据Sambrook等人(编著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:New York(1989)或Ausubel等人(编著)Current Protocols in MolecularBiology.Wiley:New York(1998)执行的。

摇板试验。通常，向800μl的0.075％酵母提取物、0.25％的蛋白胨(0.25X YP)接种10μl新近生长的耶氏酵母属，并覆盖200μl的Drakeol 5矿物油碳源，5％的矿物油中的玉米油和/或5％的水相中的葡萄糖。使转化体在24孔板(Multitron，30℃，800RPM)中在含有20％十二烷的YPD培养基中生长4天。将矿物油级分从摇板孔中移出，并使用光电二极管阵列检测器在正相柱上通过HPLC进行分析。

DNA转化。通过在YPD板培养基上过夜生长来转化菌株，从板上刮下50μl细胞，然后通过在含有1μg转化DNA(通常是用于整合转化的线性DNA)、40％PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA的500μl中在40℃下孵育60分钟来转化，随后直接铺板到选择性培养基上，或者在显性抗生素标记物选择的情况下，使细胞在30℃下在YPD液体培养基上生长4小时，然后再铺板到选择性培养基上。

DNA分子生物学。在pUC57载体中以NheI和MluI末端合成基因。通常，将基因亚克隆到MB5082‘URA3’、MB6157HygR和MB8327NatR载体中，以用于解脂耶氏酵母转化中的标记物选择，如在WO2016172282中所述。为了通过基因和标记物HindIII/XbaI(MB5082)或PvuII(MB6157和MB8327)的随机非同源末端连接来进行干净的基因***，分别通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱进行纯化。

质粒列表。表1、表2和序列表中列出了要使用的质粒、菌株、核苷酸和氨基酸序列。将核苷酸序列ID NO:2、ID NO:4、ID NO:5、ID NO:6和ID NO:7进行密码子优化以在耶氏酵母属中表达。

表1：用于构建携带异源RDH基因的菌株的质粒列表。序列ID NO是指***物。有关更多详细信息，请参见文本。

表2：携带异源RDH基因的用于产生类视黄醇的耶氏酵母属菌株的列表。有关更多详细信息，请参见文本。

正相视黄醇方法。使用附接到Waters 717自动进样器的Waters 1525二元泵来注入样品。使用配有安全硅胶保护柱套件的150×4.6mm的Phenomenex Luna 3μSilica(2)来解析(resolve)类视黄醇。对于虾青素相关化合物，流动相由1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成；或者对于玉米黄质相关化合物，流动相由1000mL己烷、60mL异丙醇和0.1mL乙酸组成。所述流动相的流速各自为每分钟0.6 mL。柱温是环境温度。注入体积是20μL。检测器是从210 nm至600 nm进行收集的光电二极管阵列检测器。根据表3检测分析物。

表3：使用正相视黄醇方法的分析物列表。有关更多详细信息，请参见文本。

样品制备。根据条件，通过各种方法制备样品。对于全培养液或经洗涤的培养液样品，将培养液置于经称重的

管中，并加入流动相，根据制造商的用法说明书在

匀浆器(Bertin Corp,Rockville,MD,USA)中在最高设置3X下处理样品。在经洗涤的培养液中，将样品在微量离心机中的1.7ml管中以10000rpm旋转1分钟，将培养液倾析出，加入1ml水，混合，沉淀，然后倾析出，并定容至初始体积，将混合物再次沉淀，并用适量的流动相定容，并通过

珠磨进行处理。为了分析矿物油级分，将样品以4000RPM旋转10分钟，并通过正排量移液器(Eppendorf,Hauppauge,NY,USA)将油从顶部移出，在流动相中稀释，通过涡旋混合，并通过HPLC分析测量类视黄醇浓度。

发酵条件。发酵与前述条件相同，使用矿物油覆盖和搅拌罐，将玉米油加入总体积为0.5L至5L的台式反应器中(见WO2016172282)。通常，在补料分批搅拌罐反应器中观察到了相同的结果，具有提高的生产率，证明了该***用于生产类视黄醇的效用。

实施例2：在解脂耶氏酵母中产生类视黄醇

通常，用纯化的HinDIII/XbaI片段转化β胡萝卜素菌株ML17767，所述纯化的HinDIII/XbaI片段来源于含有与URA3启动子连接的视黄醇脱氢酶(RDH)基因片段的质粒。在摇板试验中筛选6至8个分离株中降低的视黄醇:视黄醛比值，并将成功的分离株在补料分批搅拌罐反应器中运行8天，显示该方法的生产率提高了一个数量级，这表明了在大规模生产中的效用。使用镰刀菌属RDH12同源物时获得了最佳结果，其中在如上所述进行摇瓶孵育8天后，仅2％或残留量的视黄醛保留。如在下表中所指示的，来源于镰刀菌属序列的分离株显示出增加的视黄醇还原。

实施例3：在酿酒酵母中产生类视黄醇

通常，根据本领域已知的标准方法(诸如，如在US20160130628或WO2009126890中所述)，用编码诸如香叶基香叶基合酶、八氢番茄红素合酶、番茄红素合酶、番茄红素环化酶等酶的异源基因转化β-胡萝卜素菌株，所述β-胡萝卜素菌株被构建用于产生β-胡萝卜素。此外，当用β-胡萝卜素氧化酶基因转化时，能够产生视黄醛。此外，当用视黄醇脱氢酶转化时，则能够产生视黄醇。用这种方法，获得了关于特异性或朝向视黄醇的生产率的相似结果。

实施例4：由β-胡萝卜素产生视黄醇

除了实施例2、3和4中所述的单一修饰之外，还构建了同时携带异源FtRDH12的菌株。如前所述进行类视黄醇的发酵和分析。

为了表达来自黑腹果蝇DmNinaB(DmBCO1；SEQ ID NO:3)的异源BCO，用纯化的线性DNA片段转化β胡萝卜素菌株ML17544，所述纯化的线性DNA片段是通过对包含与URA3营养标记物连接的经密码子优化的片段的β胡萝卜素氧化酶(BCO)进行HindII和XbaI介导的限制性内切核酸酶切割而得到的。转化DNA来源于MB6702果蝇属NinaB BCO基因，由此使用经密码子优化的序列(SEQ ID NO:4)。然后使基因生长，在摇板分析中筛选6-8个分离株，将表现良好的分离株在补料分批搅拌罐反应中运行8-10天。如WO2014096992中所述使用标准参数通过HPLC检测顺式视黄醛和反式视黄醛，但使用用于类视黄醇分析物的纯化标准品进行校准。基于视黄醛的总量，异源表达来自黑腹果蝇的BCO(SEQ ID NO:3)导致视黄醛混合物中反式视黄醛的量为61％的反式视黄醛(未示出)。

异源FtRDH12的存在使分析物中检测到的视黄醛的量从20％降低至4％，这很好地表明了镰刀菌属RDH12的特异性视黄醛还原活性(参见实施例2)，并且反式视黄醇的百分比仍在至少61％的范围内。

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 视黄醛的生产

<130> 32577-WO-PCT

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 325

<212> PRT

<213> 藤仓镰刀菌（Fusarium fujikuroi）

<400> 1

Met Thr Thr Lys Tyr Thr Ser Val His Glu Ser Pro Asn Gly Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ala Arg Pro Thr Ala Ser Gln Ile Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Glu

20 25 30

Gly Glu Leu Ser Gly Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Cys Ser Ser Gly

35 40 45

Ile Gly Val Glu Thr Ala Arg Ala Ile Tyr Arg Thr Gly Ala Thr Leu

50 55 60

Tyr Leu Thr Ala Arg Asp Val Asp Lys Ala Lys Thr Val Leu Pro Asp

65 70 75 80

Leu Val Asp Thr Ser Arg Val His Phe Leu His Leu Asp Leu Asn Ser

85 90 95

Leu Glu Ser Val Arg Gly Phe Ala Glu Asn Phe Lys Ser Lys Ser Thr

100 105 110

Gln Leu His Ile Leu Ile Glu Asn Ala Gly Val Met Ala Cys Pro Glu

115 120 125

Gly Arg Thr Val Asp Gly Phe Glu Thr Gln Phe Gly Ile Asn His Leu

130 135 140

Ala His Phe Leu Leu Phe Tyr Leu Leu Lys Asp Thr Leu Leu Asn Ser

145 150 155 160

Ser Thr Pro Ala Phe Asn Ser Arg Val Val Ile Leu Ser Ser Cys Ala

165 170 175

His Gln Ala Gly Ser Val His Leu Asn Asn Leu Ser Leu Glu Gly Gly

180 185 190

Tyr Glu Pro Trp Lys Ser Tyr Gly Gln Ser Lys Thr Ala Asn Leu Trp

195 200 205

Thr Ala Arg Glu Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ala Ser Gly Ile His Ser

210 215 220

Trp Ala Val His Pro Gly Ser Ile Ala Thr Glu Leu Gln Arg His Val

225 230 235 240

Ser Asp Glu Leu Lys Gln Lys Trp Ala Asp Asp Lys Glu Gly Ala Lys

245 250 255

Leu Trp Lys Ser Thr Glu Gln Gly Ala Ala Thr Thr Val Leu Ala Ala

260 265 270

Val Ser Pro Glu Leu Glu Gly Lys Gly Gly Leu Tyr Leu Glu Asp Thr

275 280 285

Gln Val Ala Lys Pro Pro Ala Arg Gly Met Phe Gly Val Ala Asp Trp

290 295 300

Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Pro Ser Lys Leu Trp Ala Lys Ser Leu Glu

305 310 315 320

Leu Leu Lys Leu Gln

325

<210> 2

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的

<400> 2

atgaccacta agtacacttc cgttcacgag tctcccaacg gccctggtga cgctcgaccc 60

accgcttccc agattatcga cgattacaac cttgagggag agctttctgg caagactgtt 120

ctcgtcaccg gctgttcctc tggtattggt gttgagactg cccgagctat ttaccgaact 180

ggtgccaccc tttacctcac tgcccgagat gtcgataagg ccaagaccgt tcttcccgac 240

cttgttgaca cttcccgagt ccactttctc caccttgacc ttaactctct ggagtctgtt 300

cgaggttttg ctgagaactt caagtctaag tccactcagc ttcacattct catcgagaac 360

gctggcgtga tggcctgtcc cgagggccga accgtcgatg gttttgagac tcagtttggt 420

atcaaccacc ttgctcactt tctcctcttt tacctcctca aggataccct tctcaactct 480

tctacccccg ctttcaactc ccgagttgtc atcctctctt cttgtgctca ccaggctggt 540

tccgttcacc ttaacaacct gtctcttgag ggtggatacg agccttggaa gtcttacggc 600

cagtccaaga ctgccaacct ttggactgcc cgagagatcg agaagcgatt tggtgcttcc 660

ggtatccact cttgggctgt tcaccccggt tccatcgcta ctgagcttca gcgacacgtt 720

tccgacgagc ttaagcagaa gtgggctgac gataaggagg gtgccaagct gtggaagtcc 780

accgagcagg gtgccgccac cactgtcctt gctgctgttt cccctgagct tgagggtaag 840

ggcggtcttt accttgagga tacccaggtt gccaagcccc ctgcccgagg aatgtttggt 900

gttgctgact gggcttacga tgaggatggc ccctctaagc tctgggccaa gtctcttgag 960

ctccttaagc tccagtaa 978

<210> 3

<211> 620

<212> PRT

<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）

<400> 3

Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp Phe Phe Ala Val

1 5 10 15

Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly

20 25 30

Asn Gly Arg Leu Tyr Pro Asn Cys Ser Ser Asp Val Trp Leu Arg Ser

35 40 45

Cys Glu Arg Glu Ile Val Asp Pro Ile Glu Gly His His Ser Gly His

50 55 60

Ile Pro Lys Trp Ile Cys Gly Ser Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Ser

65 70 75 80

Trp Lys Val Gly Asp Met Thr Phe Gly His Leu Phe Asp Cys Ser Ala

85 90 95

Leu Leu His Arg Phe Ala Ile Arg Asn Gly Arg Val Thr Tyr Gln Asn

100 105 110

Arg Phe Val Asp Thr Glu Thr Leu Arg Lys Asn Arg Ser Ala Gln Arg

115 120 125

Ile Val Val Thr Glu Phe Gly Thr Ala Ala Val Pro Asp Pro Cys His

130 135 140

Ser Ile Phe Asp Arg Phe Ala Ala Ile Phe Arg Pro Asp Ser Gly Thr

145 150 155 160

Asp Asn Ser Met Ile Ser Ile Tyr Pro Phe Gly Asp Gln Tyr Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Glu Thr Pro Phe Met His Arg Ile Asn Pro Cys Thr Leu Ala

180 185 190

Thr Glu Ala Arg Ile Cys Thr Thr Asp Phe Val Gly Val Val Asn His

195 200 205

Thr Ser His Pro His Val Leu Pro Ser Gly Thr Val Tyr Asn Leu Gly

210 215 220

Thr Thr Met Thr Arg Ser Gly Pro Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Phe Pro

225 230 235 240

His Gly Glu Gln Met Phe Glu Asp Ala His Val Val Ala Thr Leu Pro

245 250 255

Cys Arg Trp Lys Leu His Pro Gly Tyr Met His Thr Phe Gly Leu Thr

260 265 270

Asp His Tyr Phe Val Ile Val Glu Gln Pro Leu Ser Val Ser Leu Thr

275 280 285

Glu Tyr Ile Lys Ala Gln Leu Gly Gly Gln Asn Leu Ser Ala Cys Leu

290 295 300

Lys Trp Phe Glu Asp Arg Pro Thr Leu Phe His Leu Ile Asp Arg Val

305 310 315 320

Ser Gly Lys Leu Val Gln Thr Tyr Glu Ser Glu Ala Phe Phe Tyr Leu

325 330 335

His Ile Ile Asn Cys Phe Glu Arg Asp Gly His Val Val Val Asp Ile

340 345 350

Cys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Met Ile Asn Cys Met Tyr Leu Glu Ala

355 360 365

Ile Ala Asn Met Gln Thr Asn Pro Asn Tyr Ala Thr Leu Phe Arg Gly

370 375 380

Arg Pro Leu Arg Phe Val Leu Pro Leu Gly Thr Ile Pro Pro Ala Ser

385 390 395 400

Ile Ala Lys Arg Gly Leu Val Lys Ser Phe Ser Leu Ala Gly Leu Ser

405 410 415

Ala Pro Gln Val Ser Arg Thr Met Lys His Ser Val Ser Gln Tyr Ala

420 425 430

Asp Ile Thr Tyr Met Pro Thr Asn Gly Lys Gln Ala Thr Ala Gly Glu

435 440 445

Glu Ser Pro Lys Arg Asp Ala Lys Arg Gly Arg Tyr Glu Glu Glu Asn

450 455 460

Leu Val Asn Leu Val Thr Met Glu Gly Ser Gln Ala Glu Ala Phe Gln

465 470 475 480

Gly Thr Asn Gly Ile Gln Leu Arg Pro Glu Met Leu Cys Asp Trp Gly

485 490 495

Cys Glu Thr Pro Arg Ile Tyr Tyr Glu Arg Tyr Met Gly Lys Asn Tyr

500 505 510

Arg Tyr Phe Tyr Ala Ile Ser Ser Asp Val Asp Ala Val Asn Pro Gly

515 520 525

Thr Leu Ile Lys Val Asp Val Trp Asn Lys Ser Cys Leu Thr Trp Cys

530 535 540

Glu Glu Asn Val Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Pro Ser Pro Asp

545 550 555 560

Pro Lys Ser Glu Asp Asp Gly Val Ile Leu Ala Ser Met Val Leu Gly

565 570 575

Gly Leu Asn Asp Arg Tyr Val Gly Leu Ile Val Leu Cys Ala Lys Thr

580 585 590

Met Thr Glu Leu Gly Arg Cys Asp Phe His Thr Asn Gly Pro Val Pro

595 600 605

Lys Cys Leu His Gly Trp Phe Ala Pro Asn Ala Ile

610 615 620

<210> 4

<211> 1863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的

<400> 4

atggccgctg gtgttttcaa gtcttttatg cgagatttct ttgctgttaa gtacgatgag 60

cagcgaaacg acccccaggc cgagcgactg gacggcaacg gacgactgta ccccaactgc 120

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tag 1863

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<213> 人工序列

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<223> 耶氏酵母属密码子优化的

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Claims

1.一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞包含视黄醇脱氢酶[EC1.1.1.105]，优选地异源视黄醇脱氢酶，所述宿主细胞产生包含视黄醛和视黄醇的类视黄醇混合物，其中与所述类视黄醇混合物中存在的视黄醛的量相比，视黄醇的百分比是至少约90％，优选地92％、95％、97％、98％、99％或甚至100％。

2.根据权利要求1所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中要经由所述视黄醇脱氢酶的作用而被还原的视黄醛包括反式视黄醛和顺式视黄醛的混合物，其中所述视黄醛混合物中的反式视黄醛的百分比在至少约61％至98％，优选地至少约61％至95％，更优选地至少约61％至90％的范围内。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述视黄醇脱氢酶选自真菌，优选地镰刀菌属(Fusarium)，更优选地所述视黄醇脱氢酶是藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)视黄醇脱氢酶(FtRDH)。

4.根据权利要求3所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述FtRDH选自与根据SEQID NO:1的多肽具有至少约60％同一性的多肽。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，诸如选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属(Paracoccus)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)和布拉霉属(Blakeslea)；优选地选自真菌，包括酵母，更优选地选自酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、须霉属、毛霉属、红酵母属、掷孢酵母属、法夫酵母属、发夫酵母属、布拉霉属和耶氏酵母属(Yarrowia)，最优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述视黄醇被进一步转换为维生素A。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞还包含选自果蝇属的立体选择性β-胡萝卜素氧化酶，所述立体选择性β-胡萝卜素氧化酶催化β-胡萝卜素转换为视黄醛混合物，其中基于所述混合物中的视黄醛的总量，所述混合物包含至少约61％，优选地68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％的反式同种型视黄醛，更优选地选自与根据SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％同一性的序列。

8.一种经由视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]的酶促活性生产包含视黄醇和视黄醛的类视黄醇混合物的方法，所述方法包括使视黄醛与所述视黄醇脱氢酶接触，其中所述类视黄醇混合物中视黄醇与视黄醛的比值为至少约9:1。

9.一种降低由视黄醇脱氢酶的酶促作用产生的类视黄醇混合物中的视黄醛的量的方法，所述方法包括使视黄醛与视黄醇脱氢酶接触，其中由所述酶促作用产生的所述类视黄醇混合物中的视黄醛的量与视黄醇的量相比，在约10％或更少的范围内。

10.一种提高由视黄醇脱氢酶的酶促作用产生的类视黄醇混合物中的视黄醇的量的方法，所述方法包括使视黄醛与视黄醇脱氢酶接触，其中由所述酶促作用产生的所述类视黄醇混合物中的视黄醇的量与视黄醇的量相比，在至少约90％的范围内。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，所述方法使用根据权利要求1至7中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞。

12.一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将编码视黄醇脱氢酶[EC 1.1.1.105]的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞中；

(c)在合适的培养条件下将视黄醇转换为维生素A。

13.根据权利要求1至7中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞用于产生包含比值为9:1的视黄醇和视黄醛的类视黄醇混合物的用途。