CN105339490A - 乙酰转移酶及其用于产生类胡萝卜素的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乙酰转移酶、编码它的核酸序列、包含这些序列的表达构建体和载体、用其转化的微生物及其用途。

Description

乙酰转移酶及其用于产生类胡萝卜素的用途
发明背景
本发明涉及新型乙酰转移酶、编码它的核酸序列、包含这些序列的表达构建体和载体、用其转化的微生物和用于微生物法产生类胡萝卜素(如玉米黄质、虾青素、叶黄素或β-隐黄素)的方法。
类胡萝卜素是颜色在黄色至红色范围内的有机色素，其由一些生物包括光合生物(例如，植物、藻类、蓝藻)和一些真菌天然产生。
类胡萝卜素如叶黄素、玉米黄质或虾青素是在人和牲畜饮食中作为色素物质和维生素A衍生物的前体的非常重要的添加剂。此外，类胡萝卜素具有促进健康的作用如增强免疫应答，而且由于其抗氧化剂特性的原因具有预防癌症的作用，这使其用作感兴趣的保健品(nutraceutical)。因此用于制备类胡萝卜素的经济方法和具有增加的类胡萝卜素含量的食品至关重要。用于制备类胡萝卜素的特别经济的方法是生物技术方法，其利用来自产生类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成的生物合成基因和蛋白。
发明概述
本发明涉及分别包含氨基酸序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14的蛋白或多肽，或源自这些序列通过氨基酸的取代、***或缺失并与序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14在氨基酸水平具有至少50％同源性的序列。
发明人令人惊讶地发现将根据本发明的编码乙酰转移酶的基因并入能够产生特定的包含至少一个羟基的类胡萝卜素(例如，玉米黄质或虾青素)的宿主细胞可改变宿主细胞中的类胡萝卜素概貌，从而产生乙酰化形式的类胡萝卜素，与未用编码根据本发明的蛋白或多肽的基因转化的菌株相比，其允许细胞中类胡萝卜素化合物(乙酰化加非乙酰化形式)的积累增加/增强。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体和包含所述多核苷酸的重组宿主细胞，并涉及产生所述多肽的方法。
本发明还提供改进的***，特别是用于生物产生类胡萝卜素的转化微生物，其中表达至少一种具有乙酰转移酶活性的异源多肽。
在一个优选的实例中，本发明提供产生一种或多种类胡萝卜素的含油真菌(包括，例如，酵母)。本发明还提供构建这种酵母和真菌的方法，使用这种酵母和真菌以产生类胡萝卜素的方法，和制备含类胡萝卜素的组合物(如食品或饲料添加剂，或营养补充剂)的方法、在这种含油酵母或真菌中产生的类胡萝卜素的使用。特别是，本发明提供用于生成包含编码本发明多肽的多核苷酸的酵母和真菌的***和方法。
序列表概要
SEQIDNO:1是编码来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的乙酰转移酶ATF1的未优化DNA序列。
SEQIDNO:2是编码来自贝酵母(S.bayanus)的乙酰转移酶ATF1的未优化DNA序列。
SEQIDNO:3是编码来自S.mikatae的乙酰转移酶ATF1的未优化DNA序列。
SEQIDNO:4是编码来自S.kudriavzevii的乙酰转移酶ATF1的未优化DNA序列。
SEQIDNO:5是从SEQIDNO:1推导的氨基酸序列。
SEQIDNO:6是从SEQIDNO:2推导的氨基酸序列。
SEQIDNO:7是从SEQIDNO:3推导的氨基酸序列。
SEQIDNO:8是从SEQIDNO:4推导的氨基酸序列。
SEQIDNO:9是编码来自酿酒酵母的乙酰转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中表达的DNA序列。
SEQIDNO:10是编码来自贝酵母乙酰转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵母中表达的DNA序列。
SEQIDNO:11是编码来自S.mikatae乙酰转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵母中表达的DNA序列。
SEQIDNO:12是编码来自S.kudriavzevii乙酰转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵母中表达的DNA序列。
SEQIDNO:13是编码来自S.arboricolus乙酰转移酶ATF1的未优化DNA序列。
SEQIDNO:14是从SEQIDNO:13推导的氨基酸序列。
SEQIDNO:15是编码来自S.arboricolus乙酰转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵母中表达的DNA序列。
SEQIDNO:16是编码来自贝酵母乙酰转移酶ATF1的使用P.denitrificansPD1222密码子表优化用于在Paracoccuszeaxanthinifaciens中表达的DNA序列。
SEQIDNO:17编码来自酿酒酵母乙酰转移酶ATF1的使用P.denitrificansPD1222密码子表优化用于在Paracoccuszeaxanthinifaciens中表达的DNA序列。
SEQIDNO:18是编码来自酿酒酵母乙酰转移酶ATF1的移除内部NdeI位点的未优化DNA序列。
定义
分离的多肽：术语“分离的多肽”意指相对于天然发现的多肽由人工进行修饰的多肽。在一个方面中，所述多肽为至少1％纯，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯，和至少90％纯，如通过SDS-PAGE确定的。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指制备物，其包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与所述制备物天然或重组结合的其他多肽材料。优选地，所述多肽按制备物中存在的全部多肽材料的重量计为至少92％纯，例如，至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、至少99.5％纯，和100％纯。本发明的多肽优选为基本上纯的形式。这可例如通过由已知的重组方法或由经典的纯化方法制备多肽来实现。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度使用如在EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,TrendsGenet.2000,16:276-277)的Needle程序，优选3.0.0或以后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的任项参数为缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下：
(相同的残基x100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核酸序列之间的序列同一性的程度使用如在EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)的Needle程序，优选3.0.0或以后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来确定。使用的任选参数为缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下：
(相同的脱氧核糖核酸x100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有乙酰转移酶活性。
等位变体：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种可替换形式中的任何。等位变异通过突变自然出现，且可导致种群内的多态性。基因突变可为沉默的(在编码的多肽中无变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指相对于天然发现的多核苷酸由人工进行修饰的多核苷酸。在一个方面中，所述分离的多核苷酸为至少1％纯，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、至少90％纯和至少95％纯，如通过琼脂糖凝胶电泳确定的。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任何组合。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指无其他外来或不想要的核苷酸且其处于适用于基因工程多肽产生***中的形式的多核苷酸制备物。因此，基本上纯的多核苷酸包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与其天然或重组结合的其他多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，所述多核苷酸为按重量计至少90％纯，例如，至少92％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯，和至少99.5％纯。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，其通常以ATG起始密码子或可替换的起始密码子如CTG和TTG开始并以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可为DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”意指可由自真核细胞获得的成熟、剪接的mRNA分子通过反转录制备的DNA分子。cDNA缺乏可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。原始的初级RNA转录物是mRNA前体，其通过一系列步骤，包括剪接进行加工，然后作为成熟的剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或经修饰以自然界中本不存在的方式包含核酸的区段，或其可为合成的。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列：术语“调控序列”意指用于表达编码本发明多肽的多核苷酸所需的全部组件。每个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可为天然或外来的，或调控序列彼此间可为天然或外来的。所述调控序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，所述调控序列包括启动子，和转录和翻译终止信号。出于引入促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区连接的特定限制位点的目的，所述调控序列可与接头一起提供。
可操作连接：术语“可操作连接”意指构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列适当位置使得调控序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并与提供其表达的额外核苷酸可操作连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导、接合等易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲代细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生突变而与亲代细胞不同。
变体：术语“变体”意指具有乙酰转移酶活性的多肽，其在一个或多个(几个)位置包含改变(即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、***和/或缺失)的。取代意指用不同氨基酸替代占据位置的氨基酸，缺失意指去除占据位置的氨基酸的，而***意指在占据位置的氨基酸邻近添加1-3个氨基酸。
发明详述
下文的乙酰转移酶意指根据本发明的蛋白或酶，其将乙酰基团转移至类胡萝卜素或包含至少一个羟基的类胡萝卜素衍生物(例如至玉米黄质或虾青素)，其包含氨基酸序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14，或源自这些序列通过氨基酸的取代、***或缺失并与序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14在氨基酸水平具有至少50％同源性的序列。
描述于SEQIDNO:5的氨基酸序列源自SEQIDNO:1中描述的cDNA序列的翻译，描述于SEQIDNO:6的氨基酸序列源自SEQIDNO:2中描述的cDNA序列的翻译，描述于SEQIDNO:7的氨基酸序列源自SEQIDNO:3中描述的cDNA序列的翻译，描述于SEQIDNO:8的氨基酸序列源自SEQIDNO:4中描述的cDNA序列的翻译，且描述于SEQIDNO:14的氨基酸序列源自SEQIDNO:13中描述的cDNA序列的翻译。
取代意指通过一个或多个氨基酸被一个或多个氨基酸替代。所述替代优选为称为保守的那些，其中替代的氨基酸具有与原始氨基酸相似的性质，例如，用Asp替代Glu、用Asn替代Gln、用Ile替代Val、用Ile替代Leu、用Thr替代Ser。
缺失是用直接的键/连接基(linkage)替代氨基酸。优选的用于缺失的位置是多肽的末端和单独的蛋白结构域之间的连接。
***是向多肽链中引入氨基酸，形式上存在用一个或多个氨基酸替代直接的键/连接基。
两个蛋白间的同源性意指每个蛋白全长上氨基酸的同一性，其用计算机程序GAP(UWGCG,UniversityofWisconsin,GeneticComputerGroup,programalgorithmofNeedleman和Wunsch(J.Mol.Biol.1970,48:443-453)的辅助通过比较进行计算，设置如下参数：
缺口权重：12
长度权重：4
平均匹配：2.912
平均错配：-2.003
与序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14在氨基酸水平具有至少50％同源性的蛋白意指该蛋白的序列与序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14在使用上述程序算法用上组参数的比较中具有至少50％、优选60％、特别优选70％的同一性。
可如下文所述通过编码来自天然或遗传操纵的生物的这些蛋白的适当的核酸的基因表达来制备乙酰转移酶。
本发明进一步涉及用于将乙酰基团转移至类胡萝卜素或包含至少一个羟基的类胡萝卜素衍生物(如例如玉米黄质、β-隐黄素、3'-羟基海胆酮、3-羟基海胆酮、侧金盏花黄质(4-酮玉米黄质)、虾青素、芬尼黄质(金盏花红素)、α-隐黄素或叶黄素，或其具有多至40C原子的衍生物)的方法。优选地，所述类胡萝卜素或类胡萝卜素衍生物在分子中包含至少一个3-羟基-β-紫罗兰酮或至少一个3-羟基-4-酮-β-紫罗兰酮或至少一个3-羟基-ε-紫罗兰酮或至少一个3-羟基-4-酮-ε-紫罗兰酮结构元件，如例如，3-羟基-6-乙烯基-β-紫罗兰酮、3-羟基-4-酮-6-乙烯基-β-紫罗兰酮、3-羟基视黄醇、3-羟基-4-酮视黄醇、3-羟基视黄醛、3-羟基-4-酮视黄醛、3-羟基视黄酸、3-羟基-4-酮视黄酸或叶黄素。
本发明还涉及用于编码根据本发明的乙酰转移酶之一的核酸序列。优选的核酸具有序列SEQIDNO:1、SQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:13。
而且，本发明涉及根据序列SEQIDNO:1、SQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:13的核酸的功能类似物，其通过添加、取代、***和/或缺失单个或多个核苷酸获得，其进一步编码具有预期特异性的乙酰转移酶。
本发明还涵盖那些核酸序列，其包含所谓沉默突变或其与依照特定来源或宿主生物的密码子选择特定提及的序列和所述核酸序列的天然存在的变体相比而经过修饰。
本发明还涵盖由遗传密码的简并而获得的核酸序列的修饰(即，相应氨基酸序列中无任何变化)或保守的核苷酸取代(即，用相同电荷、大小、极性和/或溶解性的另一氨基酸替代相应的氨基酸)，和通过核苷酸添加、***、倒位或缺失修饰的序列，该序列编码根据本发明的具有“修饰的底物概貌”的乙酰转移酶，和相应的互补序列。
本发明进一步涉及包含在调节核酸序列的遗传控制下的根据本发明的核酸序列的表达构建体；和包含至少一个这些表达构建体的载体。
本发明还涉及重组核酸分子。“重组核酸分子”主要指核酸分子或核酸序列包含来自两种或更多种不同遗传来源的核酸分子。根据本发明，所述重组核酸分子可为表达构建体，即，与表达调控序列可操作连接的编码根据本发明具有乙酰转移酶的多肽的核酸序列，或为整合入宿主染色体的相同的核酸序列。
优选地，根据本发明的构建体涵盖所述编码序列的5'-上游启动子和3'-下游终止子，和任选地，其他惯用的调节元件，并在每种情况中与编码序列可操作连接。可操作连接可理解为意指启动子、编码序列、终止子和(如果合适的话)其他调节元件以这样的方式顺序安排，使得各调节元件可满足其对于编码序列表达的意欲的功能。可操作连接的序列的实例为靶向序列，或其他翻译增强子、增强子、多聚腺苷酸化信号等。进一步的调节元件涵盖选择性标志、扩增信号、复制起点等。
除了人工调节序列，天然调节序列仍可存在于实际的结构基因上游。如何合意，该天然调节可由遗传修饰关闭，且该基因的表达可增强或降低。然而，所述基因构建体也可在构建中更加简单，即在结构基因上游未***额外的调节信号且并未移除天然启动子及其调节。取而代之，对天然调节序列以这样的方式进行突变使得调节不再发生且所述基因表达增加或降低。一个或多个拷贝的核酸序列可存在于所述基因构建体中。
合适的启动子的实例为：有利地采用于革兰氏阴性细菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、I-PR或I-PL启动子；和革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母启动子ADC1、MFa、Ac、P-60、CYC1、GAPDH、TEF1或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素或菜豆蛋白启动子。特别的优选给予使用诱导型启动子，例如光-特别是温度-诱导型启动子，如PrP1启动子。
原则上，可使用具有其调节序列的所有天然启动子。此外，也可以有利的方式使用合成的启动子。
上述调节序列意欲允许蛋白表达和核酸序列的靶向表达。依赖于宿主生物，其可意指例如，基因仅在诱导发生后表达或过表达，或其立即和/或组成型地表达和/或过表达。
所述调节序列或因子可优选对表达具有阳性效果且以这种方式增加或降低后者。因此，调节元件的增强可在转录水平通过使用强转录信号如启动子和/或“增强子”有利地发生。此外，翻译可通过改善例如mRNA的稳定性得以增强。
通过将合适的启动子与合适的乙酰转移酶核苷酸序列和终止子信号或多聚腺苷酸化信号融合来生成表达盒。为此，使用惯用的重组和克隆技术，例如，如它们在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和inT.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)和inAusubel,F.M.等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中所述的。
对于在合适的宿主生物中表达，所述重组核酸构建体或基因构建体有利地***宿主特异性载体，其允许所述宿主中最优的基因表达。载体为本领域的技术人员熟知且可以在例如“CloningVectors”(PouwelsP.H.等编,Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。载体应理解为意指不仅是质粒，还有本领域的技术人员已知的所有其他载体如例如，噬菌体、病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、质粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或染色体复制。
根据本发明的载体允许转化的重组微生物(例如，用至少一个根据本发明的载体转化)的生成且其可用于产生突变体。将上述根据本发明的重组构建体有利地引入合适的宿主生物并进行表达。其优选使用本领域的技术人员已知的通常的克隆和转染方法以在上述表达***中带来上述核酸的表达。合适的***描述于，例如，currentprotocolsinmolecularbiology,F.Ausubel等编,WileyInterscience,NewYork1997中。
合适的宿主生物原则上为允许表达根据本发明的核酸、其等位变体和其功能等价物或衍生物的所有生物。优选的初始生物是那些天然能够合成类胡萝卜素的那些。然而，由于引入类胡萝卜素生物合成基因而能够合成类胡萝卜素的初始生物也是合适的。初始生物意指原核或真核生物如，例如，微生物或植物。优选的微生物为细菌、酵母、藻类或真菌。
因此，本发明进一步涉及用于制备下文描述的遗传修饰的微生物的方法，其中将根据本发明的乙酰转移酶基因引入初始生物的基因组。初始生物意指在根据本发明的遗传修饰前的生物。
根据本发明的乙酰转移酶基因原则上可通过本领域的技术人员已知的所有方法引入下文所述的初始生物，由此对其进行遗传修饰。
通过转化、转染、接合、电穿孔、使用所谓粒子枪或通过显微注射将它们有利地引入初始生物或其细胞。
技术人员可在Sambrook,J.等(1989)Molecularcloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,byF.M.Ausubel等(1994)Currentprotocolsinmolecularbiology,JohnWileyandSons,byD.M.Glover等,DNACloningVol.1,(1995),IRLPress(ISBN019-963476-9),byKaiser等(1994)MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPressorGuthrie等,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,1994,AcademicPress的教科书中找到用于微生物的适当方法。
可提及的有利方法的实例是那些如通过同源或异源重组引入DNA的那些，例如使用URA3基因，特别是来自阿舒囊霉属(Ashbya)的URA3基因，如德国申请DE19801120.2中所述，和/或通过下文描述的REMI方法(＝"限制酶介导的整合)。
REMI技术是基于用相同的限制内切酶在两末端剪切的线性DNA构建体，连同用于该DNA构建体的此限制的限制内切酶一起共转化入生物。所述限制性内切酶随后切割生物的基因组DNA，所述生物中已引入DNA构建体连同限制酶。这导致细胞自身修复机制的激活。这些修复机制可修复由内切酶引起的基因组DNA中的链断裂，且在此过程中还以一定频率将共转化的DNA构建体并入基因组。通常，在该过程中将限制裂解位点保留在DNA的两端。
Bolker等(Mol.Gen.Genet.,1995,248:547-552)描述了用于真菌***诱变的此技术。VonSchiestl和Petes(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88:7585-7589)使用了该方法以查明在酵母属中是否存在异源重组。Brown等(Mol.Gen.Genet.1996,251:75-80)描述了用于诱导型报告基因的稳定转化和调节表达的该方法。
可能的是使用REMI方法以在基因组中的转录活性位点处定位根据本发明的核酸片段或根据本发明的上述乙酰转移酶基因。
可能且是有利的是将核酸连同至少一个报告基因克隆入DNA构建体，所述构建体被引入基因组。该报告基因应通过生长、荧光、化学或生物发光试验或通过光度测量使检测轻而易举。可提及的报告基因的实例为抗生素抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、葡糖苷酶基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、脂肪酶基因、酯酶基因、过氧化物酶基因、β-内酰胺酶基因、乙酰-、磷酸-或腺苷酸转移酶基因。这些基因使得可能容易地测量和定量转录活性和由此的基因表达。这意味着可能在基因组中识别位点，其具有区别为多至因数2的生产力。
如果意欲向生物中引入多个基因，如例如，类胡萝卜素生物合成的更多基因，其可与报告基因一起全部引入单一载体中，或在每种情况中可将各单独的基因与报告基因引入一个载体，再引入生物中，能够同时或连续引入多个载体。还能够使用REMI技术***编码各种活性的基因片段。
原则上适于将根据本发明的乙酰转移酶基因或核酸构建体整合入初始生物的基因组的限制酶全部为本领域的技术人员已知的。由于限制酶在待整合的基因组或载体中剪切过于频繁，仅识别4个碱基对作为限制裂解位点的限制酶是较不优选的，而优选的酶识别6、7、8或更多碱基对作为裂解位点，如BamHI、EcoRI、BglII、SphI、SpeI、XbaI、XhoI、NcoI、SalI、ClaI、KpnI、HindIII、SacI、PstI、BpnI、NotI、SrfI或SfiI，仅提及几个可能的酶。有利的是使用的酶在待引入的DNA中不再具有裂解位点，这增加了整合的效力。通常，在REMI混合物中使用5至500U，优选10至250，特别优选10至100U的酶。所述酶有利地用于水溶液，其包含用于稳定渗透压的物质(例如糖如蔗糖、海藻糖或葡萄糖，多元醇如甘油或聚乙二醇)、在pH5至9、优选6至8、特别优选7至8的范围具有有利缓冲能力的缓冲剂(如Tris、MOPS、HEPES、MES或PIPES)和/或稳定核酸的物质(如Mg、Cu、Co、Fe、Mn或Mo的无机或有机盐)。适于存在的其他物质还可能为如EDTA、EDDA、DTT、β-巯基乙醇或核酸酶抑制剂。然而，还可能在无这些添加的情况下实施REMI技术。
所述方法在5至80℃，优选10至60℃，特别优选20至40℃的温度范围实施。其他已知的用于使细胞膜脱稳定化的方法适于所述方法，如，例如，电穿孔、与装载的泡融合或用多种碱金属或碱土金属盐如锂、铷或钙盐脱稳定化，锂盐为优选的。
本发明进一步涉及相应的遗传修饰的生物，当初始生物包含乙酰转移酶基因的情况下，其通过遗传修饰而使根据本发明的乙酰转移酶基因的表达与野生型生物相比增加；或在初始生物不包含乙酰转移酶基因的情况下，其通过遗传修饰引起根据本发明的乙酰转移酶基因的表达。
遗传修饰的生物意指生物，其中(优选通过上述方法之一)已***根据本发明的乙酰转移酶基因或核酸构建体。
遗传修饰的生物包含至少一种根据本发明的乙酰转移酶基因或至少一种根据本发明的核酸构建体。取决于初始生物，所述核酸可存在于染色体内或染色体外。
与野生型相比优选地改变遗传修饰的生物中的类胡萝卜素代谢。
优选的生物为重组细菌、植物、真菌或酵母。在一个具体的实施方案中，所述重组真菌是含油的(oleaginous)，因为它可将脂质积累至其干细胞重量的至少约20％；并产生至少一种选自下组的类胡萝卜素：表氧化玉米黄质(antheraxanthin)、金盏花红素(adonirubin)、侧金盏花黄质(adonixanthin)、虾青素(astaxanthin)、角黄素(canthaxanthin)、capsorubrin、β-隐黄素(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、4-酮-γ-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、脱氧屈曲黄素(deoxyflexixanthin)、硅藻黄质(diatoxanthin)、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素(didehydrolycopene)、岩藻黄素(fucoxanthin)、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异胡萝卜素(isorenieratene)、β-异胡萝卜素、山莴苣黄素(lactucaxanthin)、叶黄素(lutein)、番茄红素(lycopene)、myxobactone、新黄质(neoxanthin)、链孢红素(neurosporene)、羟基链孢红素、多甲藻素(peridinin)、八氢番茄红素(phytoene)、视紫红质(rhodopin)、视紫红质葡糖苷、4-酮玉红黄质(4-ketorubixanthin)、管藻黄质(siphonaxanthin)、球形烯(spheroidene)、球形酮(spheroidenone)、螺菌黄质(spirilloxanthin)、红酵母烯(torulene)、4-酮-红酵母烯、3-羟基-4-酮-红酵母烯、尿酸酯(uriolide)、尿酸醋酸酯(uriolideacetate)、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质-β-二葡糖苷、玉米黄质、C30类胡萝卜素及其组合，且可将产生的类胡萝卜素积累至其干细胞重量的至少约1％。甚至更优选地，重组真菌是选自下组的属的成员：曲霉属(Aspergillus)、布拉霉属(Blakeslea)、葡萄孢属(Botrytis)、假丝酵母属(Candida)、尾孢属(Cercospora)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、镰孢属(Fusarium)(赤霉属(Gibberella))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)、须霉属(Phycomyces)、毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、柄锈菌属(Puccinia)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、小核菌属(Sclerotium)、木霉属(Trichoderma)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Xanthophyllomyces(发夫酵母属(Phaffia))和耶氏酵母/西洋蓍霉属(Yarrowia)或为选自下组的菌种：土曲霉(Aspergillusterreus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、日本假丝酵母(Candidajaponica)、铁红假丝酵母(Candidapulcherrima)、拉考夫假丝酵母(Candidarevkaufi)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、烟草尾孢(Cercosporanicotianae)、Cryptococcuscurvatus、刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)、秀丽小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)、藤仓镰孢(Fusariumfujikuroi)(玉米赤霉(Gibberellazeae))、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、Lipomyceslipoferus、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)、葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)、布拉克须霉(Phycomycesblakesleanus)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pucciniadistincta、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、对圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、胶红酵母(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、Rhodotorulapinicola、纤细红酵母(Rhodotorulagracilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)、里氏木霉(Trichodermareesei)、皮肤丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullulans)、Xanthophyllomycesdendrorhous(红发夫酵母(Phaffiarhodozyma))和解脂耶氏酵母/解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)。
在这些天然的含油株中，一些还天然地产生类胡萝卜素而一些则不产生，这些株可通过引入如美国专利7851199中公开的类胡萝卜素生物合成基因被额外地用作宿主细胞。
在一个具体的实施方案中，所述重组细菌是革兰氏阴性或阳性。***宿主包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)和副球菌属(Paracoccus)。重组的细菌宿主可为任何芽孢杆菌目(Bacillales)，其包括但不限于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。重组细菌宿主还可为任何链霉菌属(Streptomyces)，其包括但不限于不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)。重组细菌宿主还可为任何副球菌属(Paracoccus)，包括但不限于脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、善变副球菌(Paracoccusversutus)、Paracoccuscarotinifaciens、马氏副球菌(Paracoccusmarcusii)和产玉米素副球菌(Paracoccuszeaxanthinifaciens)。所述重组细菌产生至少一种选自下组的类胡萝卜素：表氧化玉米黄质(antheraxanthin)、金盏花红素(adonirubin)、侧金盏花黄质(adonixanthin)、虾青素(astaxanthin)、角黄素(canthaxanthin)、capsorubrin、β-隐黄素(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、ψ-胡萝卜素、4-酮-γ-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄素、脱氧屈曲黄素(deoxyflexixanthin)、硅藻黄质(diatoxanthin)、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素(didehydrolycopene)、岩藻黄素(fucoxanthin)、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异胡萝卜素(isorenieratene)、β-异胡萝卜素、山莴苣黄素(lactucaxanthin)、叶黄素(lutein)、番茄红素(lycopene)、myxobactone、新黄质(neoxanthin)、链孢红素(neurosporene)、羟基链孢红素、多甲藻素(peridinin)、八氢番茄红素(phytoene)、视紫红质(rhodopin)、视紫红质葡糖苷、4-酮玉红黄质(4-ketorubixanthin)、管藻黄质(siphonaxanthin)、球形烯(spheroidene)、球形酮(spheroidenone)、螺菌黄质(spirilloxanthin)、红酵母烯(torulene)、4-酮-红酵母烯、3-羟基-4-酮-红酵母烯、尿酸酯(uriolide)、尿酸醋酸酯(uriolideacetate)、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质-β-二葡萄糖苷、玉米黄质，C30类胡萝卜素及其组合。
在其他实施方案中，本发明提供产生类胡萝卜素的方法，所述方法包括在允许类胡萝卜素产生的条件下培养真菌或细菌，和分离产生的类胡萝卜素的步骤。
根据本发明遗传修饰的微生物的培养以本身已知的方式发生，如适当的野生型的培养，例如在合适的培养基中(如例如，在琼脂平板上或在悬浮培养物中)的微生物的情况，或在土壤或合适的营养培养基中的植物的情况。收获意指在微生物的情况中微生物的分离，和在植物的情况中植物(适当时，包含类胡萝卜素的特定的植物部分)的切断。类胡萝卜素以本身已知的方式分离，例如，通过生物细胞的破坏，类胡萝卜素的提取，和通过化学或物理分离方法如提取或层析对类胡萝卜素的随后的纯化。
下列实施例对本发明进行了阐述。
实施例
下列表1描述某些在下列例示中使用的解脂耶氏酵母菌株：
表1：解脂耶氏酵母菌株
以如美国专利7,851,199中所述的ML350和ATCC201249开始，通过引入在组成型启动子控制下的异源基因，加上数代杂交构建了耶氏酵母菌株ML9863和ML9335。GGS基因和截短的HMG基因("HMG-tr")源自分别对应天然香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranylpyrophosphatesynthase)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(hydroxymethylglutaryl-CoAreductase)基因的耶氏酵母属序列。carRP和carB基因源自卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)，且它们分别编码双功能性八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶。合成crtW基因以编码Parvularculabermudensis的胡萝卜素酮酶。从自养黄杆菌(Xanthobacterautotrophicus)(Xa)扩增crtZ基因，或进行合成以编码粉尘克罗诺杆菌(Cronobacterpulveris)(之前称为粉尘肠杆菌(Enterobacterpulveris))(Ep)或肠杆菌科细菌DC404(Dc)的胡萝卜素羟化酶。这些基因有时但不总是与营养缺陷标志(URA3、LEU2、URA2、LYS1、ADE1)或loxP位点、HygR或NatR标志的残留相关。
表2：质粒
本文描述的所有基础分子生物学和DNA操纵过程基本上根据Sambrook等或Ausubel等(J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis(编).1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress:NewYork；F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith,K.Struhl(编).1998.CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley:NewYork)实施。
实施例1a：编码酿酒酵母的乙酰转移酶ATF1的pMB6532的产生
酿酒酵母的ATF1基因根据耶氏酵母属密码子偏好进行密码子优化，且从头合成SEQIDNO:9中详明的DNA片段。在从头合成的过程中，将包含NheI限制位点和用于允许有效翻译的典型Kozak序列的序列5'-TGCTAGCCACAAAA添加至紧接ATG的上游。将包含MluI限制位点的序列ACGCGT-3'添加至紧接终止密码子的下游。该序列使用NheI和MluI裂解并连接至用NheI和MluI剪切的pMB6157以产生pMB6532。由pMB6532的Sc-ATF1基因编码的所得蛋白描述于SEQIDNO:5中。此质粒随后用EcoRV裂解，并通过***来自相同质粒的2.35kbSspI-PvuII片段复制的含Sc-ATF1的盒以生成pMB6563，其编码侧翼为HygR标志的Sc-ATF1的收敛转录物。通过用SspI和BamHI裂解并将其连接至来自pMB6200的1.3kbSspI-BamHI片段使用赋予诺尔丝菌素抗性的NatR标志替换在该质粒中的HygR，以产生pMB6608。
实施例1b：向能够产生玉米黄质的耶氏酵母中的引入酿酒酵母乙酰转移 酶ATF1
用包含在组成型启动子控制下的两个Sc-ATF1拷贝和用于潮霉素抗性的可选择标志HygR的MB6563的PvuII片段转化菌株ML11218。在30℃生长3-4天后从转化平板(YPD+100mg/L潮霉素)选择10个潮霉素抗性转化体。当在30℃于YPD中生长4天时，大多数转化体产生14-17％的单乙酰化玉米黄质和42-57％的双乙酰化玉米黄质(作为总玉米黄质的百分比)。游离的玉米黄质产生为总玉米黄质的27-42％。选择一个菌株ML12641用于进一步工程化。
用XbaI处理的MB6608转化菌株ML12641，所述MB6608包含在组成型启动子控制下的两个Sc-ATF1拷贝和诺尔丝菌素的可选择性标志NatR。在30℃生长3-4天后从转化平板(YPD+100mg/L诺尔丝菌素)选择10个诺尔丝菌素抗性转化体。当在30℃于YPD中生长4天时，几个转化体产生9-16％的单乙酰化玉米黄质和56-80％的双乙酰化玉米黄质(作为总玉米黄质的百分比)。游离的玉米黄质产生为总玉米黄质11-28％。选择一个菌株ML12735用于进一步的分析并用于在补料分批发酵罐中的培养。
菌株ML12735使用补料分批工艺在发酵罐中生长。当与不携载任何Sc-ATF1基因拷贝的菌株ML11218比较时，总(游离的加上酯化的)玉米黄质产生增加为两倍。另外，图1表明菌株ML11218中的玉米黄质产生在发酵早期大幅增加，然后随玉米黄质生产停止为停滞/平台期。相对地，即使菌株ML12735在发酵过程的初期具有相似的生产概貌，玉米黄质产生持续增加超过ML11218所到达的极限，且与菌株ML11218不同，所述发酵将其生产力保持延长的时间。
实施例1c：向能产生虾青素的耶氏酵母中引入酿酒酵母乙酰转移酶ATF1
用已经用XbaI处理的MB6563(其包含侧翼为HygR标志的ATF1的收敛转录物)转化菌株ML12526。在30℃生长3-4天后从转化平板(YPD+100mg/L潮霉素)选择五个潮霉素抗性转化体。随后在30℃于YPD摇瓶中生长3-4天后，转化体产生22-29％的单乙酰化虾青素和16-56％的双乙酰化虾青素(作为总虾青素的百分比)。游离的虾青素产生为总虾青素的19-59％。选择一个菌株ML12707用于进一步的分析并用于在补料分批发酵罐中培养。
菌株ML12707使用补料分批方法在发酵罐中生长。图2表明与不携带任何Sc-ATF1基因拷贝的菌株ML12562相比，菌株ML12707中虾青素产生的速率在发酵早期较高且在运行结束时达到更高效价。
实施例2a：分别编码贝酵母、S.kudriavzevii和S.arboricolus乙酰转移 酶ATF1的pMB6732、pMB6733和pMB6812的产生。
生成用于表达来自不同酵母属菌种的ATF1基因的质粒，如表2所述。根据耶氏酵母密码子偏好对贝酵母(Sb)、Saccharomyceskudriavzevii(Sk)和Saccharomycesarboricolus(Sa)的ATF1基因进行密码子优化，且从头合成分别在SEQIDNO:10、12和15中详明的DNA片段。在不同ATF1基因从头合成的过程中，将包含NheI限制位点和允许有效翻译的典型Kozak序列的序列5'-TGCTAGCCACAAAA添加至紧接ATG的上游。将包含MluI限制位点的序列ACGCGT-3'添加至紧接终止密码子的下游。使用NheI和MluI裂解所述序列并连接至用NheI和MluI剪切的pMB6157以分别产生pMB6732、pMB6733和pMB6812。获得的由pMB6732、pMB6733和pMB6812的ATF1基因编码的蛋白分别描述于SEQIDNO:6、8和14。
实施例2b：携带贝酵母乙酰转移酶ATF1的两个拷贝的pMB6832的产生
如前文所述还将贝酵母ATF1***两个其他携带组成型启动子的载体(pMB6655和pMB6674)以生成pMB6769和pMB6771，且经由来自携带一个盒的pMB6769的PvuII-SspI片段转入携带另一个盒和抗潮霉素标志的EcoRV裂解的pMB6771而将两个不同的盒组合以产生pMB6832。
实施例2c：向能够产生玉米黄质的耶氏酵母株引入来自贝酵母、S. kudriavzevii和S.arboricolus的乙酰转移酶ATF1基因
用已用XbaI处理的MB6732(Sb-ATF1)、MB6733(Sk-ATF1)和MB6812(Sa-ATF1)独立转化菌株ML11218。在30℃生长3-4天后从转化平板(YPD+100mg/L潮霉素)选择每种质粒的十个潮霉素抗性转化体。随后在30℃于YPD摇瓶中生长3-4天后，分析转化体的玉米黄质产生并与对照菌株ML11218相比。携带贝酵母ATF1的转化体(pMB6732)产生4-16％的单乙酰化玉米黄质和46-85％的双乙酰化玉米黄质(作为总玉米黄质的百分比)。游离的玉米黄质产生为总玉米黄质的8-38％。一个携带S.kudriavzeviiATF1的转化体(pMB6733)产生约3％的单乙酰化玉米黄质且无双乙酰化玉米黄质(作为总玉米黄质的百分数)。含有S.arboricolusATF1的转化体(pMB6812)产生20-22％的单乙酰化玉米黄质和30-45％的双乙酰化的玉米黄质(作为总玉米黄质的百分比)。游离的玉米黄质产生为总玉米黄质的34-49％。
选择贝酵母ATF1用于进一步的研究并用来调查其在发酵罐中的乙酰化能力。用携带贝酵母ATF1的两个拷贝的pMB6832的PvuII片段转化菌株ML11218。在30℃生长3-4天后从转化平板(YPD+100mg/L潮霉素)选择每种质粒的六个潮霉素抗性转化体。随后在30℃于YPD摇瓶中生长3-4天后，转化体产生5-6％的单乙酰化玉米黄质和83-90％的双乙酰化玉米黄质(作为玉米黄质的百分比)。游离的玉米黄质产生为总玉米黄质的4-14％。选择一个菌株ML13129用于进一步的分析并用于在补料分批发酵罐中培养。
菌株ML13129使用补料分批方法在发酵罐中生长。当与不携带任何Sb-ATF1基因拷贝的菌株ML11218比较时，总(游离的加酯化的)玉米黄质产生增加为1.8倍。此外，图3表明两个菌株中的玉米黄质产生在发酵早期具有相似的生产概貌，但ML11218中生产进入停滞/平台期且玉米黄质产生停止。相对地，玉米黄质产生在ML13129中持续增加超过ML11218所到达的极限并接近其水平的几乎双倍。
实施例2d：向能够产生虾青素的耶氏酵母中引入来自贝酵母和S. kudriavzevii的乙酰转移酶ATF1基因
用已用XbaI处理的MB6732(Sb-ATF1)和MB6733(Sk-ATF1)独立转化菌株ML12526。在30℃生长3-4天后，从转化平板(YPD+100mg/L潮霉素)选择每种质粒的十个抗潮霉素转化体。随后在30℃于YPD摇瓶中生长3-4天后，分析转化体的虾青素产生并与对照菌株ML12526相比。携带Sb-ATF1质粒pMB6732的转化体产生16-30％的单乙酰化虾青素和57-76％的双乙酰化虾青素(作为总虾青素的百分比)。游离的虾青素产生为总虾青素的8-37％。携带Sk-ATF1质粒pMB6733的转化体产生9-24％的单乙酰化虾青素和1-6％的双乙酰化虾青素(作为总虾青素的百分比)。游离的虾青素产生为总虾青素的70-90％。选择携带Sb-ATF1质粒pMB6732的一个菌株ML12819用于进一步分析并用于在补料分批发酵罐中的培养。菌株ML12819使用补料分批的方法在发酵罐中生长。图4表明菌株ML12819中虾青素产生的速率与不携带Sb-ATF1基因的菌株ML12562相比类似，但在运行结束时达到更高的效价。
实施例3a：编码天然的和密码子优化的贝酵母和酿酒酵母ATF1的 pMB6976、pMB6977、pMB6978和pMB6979的产生
使用脱氮副球菌PD1222密码子使用表对贝酵母和酿酒酵母ATF1基因进行密码子优化用于在副球菌属菌种(Paracoccussp.)的菌株R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114(专利US20070202579A1、US7232679B2)中的表达，且从头合成了分别于SEQIDNO:16和SEQIDNO:17中详明的DNA片段。也从头合成了描述于SEQIDNO:2和SEQIDNO:18中的未经密码子优化的贝酵母和酿酒酵母ATF1基因。野生型酿酒酵母ATF1基因包含在从头合成过程中除去的NdeI位点。在从头合成的过程中，将序列5'-CAT添加至紧接ATG的上游以产生NdeI限制位点。将包含HindIII限制位点的序列AAGCTT-3'添加至紧接终止密码子的下游。密码子优化和非密码子优化版本的贝酵母和酿酒酵母ATF1都在副球菌属的crtE启动子的调控下使用已用NdeI和HindIII裂解的质粒pRK-PcrtE-crtE(源自pRK415,Keen,等,Gene.1988,70:191-197)克隆以产生pMB6976(Sb-ATF1野生型)、pMB6977(Sc-ATF1野生型)、pMB6978(Sb-ATF1密码子优化型)和pMB6979(Sc-ATF1密码子优化型)。
pMB6976和pMB6978中由Sb-ATF1基因编码的所得蛋白在SEQIDNO:6中详明。pMB6977和pMB6979中由Sc-ATF1基因编码的所得蛋白在SEQIDNO:5中详明。
下表3描述了在下列示例中使用的大肠杆菌菌株：
表3：大肠杆菌菌株
菌株 引入的基因 如何构建
MB7006 无 转化
MB7007 Sb-ATF1(野生型) 转化
MB7008 Sc-ATF1(野生型) 转化
MB7009 Sb-ATF1(密码子优化型) 转化
MB70010 Sc-ATF1(密码子优化型) 转化
下表4描述在下列示例中使用的副球菌属菌株：
表4：产玉米素副球菌菌株
实施例3b：经由接合向能够产生玉米黄质的副球菌属菌株中引入贝酵母 和酿酒酵母ATF1
将携带不同ATF1基因的质粒pMB6975(pRK415对照质粒)和质粒pMB6976、pMB6977、pMB6978和pMB6979转入大肠杆菌菌株S17-1以产生菌株MB7706、MB7007、MB7708、MB7709和MB7710。大肠杆菌菌株S17-1是在其染色体中包含转移基因的迁移宿主。将载体pRK415用作表达质粒且其携带将其移入副球菌属所需的转移基因。经由与大肠杆菌菌株MB7706-MB7710的接合和在100mg/L利福平和2.5mg/L四环素上的选择将质粒pMB6975-pMB6979单独引入副球菌属菌种的菌株R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114(RifR)。将产生的副球菌属外接合体(exconjugant)命名为R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7006、R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7007、R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7008、R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7009和R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7010。
选择携带不同ATF1基因的六个副球菌属外接合体和携带对照质粒的六个外接合体并在28℃200rpm于F-培养基(10g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、30g/lNaCl、10g/lD-葡萄糖、5g/lMgSO4·7H2O，pH7.0)上生长24小时并分析类胡萝卜素产生。收获一毫升培养液，离心(spindown)并如对于解脂耶氏酵母样品对所述细胞沉淀提取类胡萝卜素。除游离的玉米黄质、β-隐黄素和胡萝卜素外，携带优化的和未优化的贝酵母和酿酒酵母ATF1基因的所有副球菌属菌株产生乙酰化的玉米黄质和β-隐黄素。无ATF1的对照菌株R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7006不产生乙酰化的玉米黄质或乙酰化的β-隐黄素。
选择分别携带来自酿酒酵母的野生型和密码子优化的ATF1基因的两种典型副球菌属外接合体R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7008-11和R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7010-9用于更详细的分析，并与对照菌株R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114+pMB7006-10相比。菌株如上文所述在F-培养基上生长。收获五百微升的全培养液并冻干48小时。提取并分析类胡萝卜素，如对于解脂耶氏酵母样品所述。图5显示携带ATF1的菌株产生约10％的单乙酰化的玉米黄质和约4％双乙酰化的玉米黄质(作为总玉米黄质的百分比)。携带ATF1的菌株相比对照株(55％和43％更多的总玉米黄质)还产生74％和65％更多的羟基化产物(乙酰化和游离的玉米黄质，和β-隐黄素)。
实施例4：从解脂耶氏酵母和副球菌属细胞提取类胡萝卜素并通过HPLC 定量胡萝卜素产生
根据之前美国专利号7,851,199B2中描述的方法对生成的菌株实施摇瓶测试和类胡萝卜素分析。
对于通过HPLC和HPLCDADMS定量来自耶氏酵母属和副球菌属的乙酰化类胡萝卜素，使用下述方法：
正相类胡萝卜素方法
使用附接于Waters717自动采样器的Waters1525二元泵注射样品。使用具有安全二氧化硅保护装置柱套组的PhenomenexLuna3μSilica(2),150x4.6mm柱解析类胡萝卜素。使用购自CaroteNature(GmbH,ImBudler8,CH-4419Lupsingen,Switzerland)或从DSMNutritionalProductsLtd接受的合成的类胡萝卜素样品作为参照标准。基于Kaewkoola和Krisnangkura,ChemPhysLipids.2010,163:685-688和Kaewkool,等,Eur.J.LipidSci.Technol.2009,111:474-480中综述的实验合成虾青素和玉米黄质的乙酰化化合物。大致上，将100mg/L的类胡萝卜素溶于乙酸乙酯且添加氢氧化钠或氢氧化钾的过量碱。允许样品在室温于暗处放置并在1-5天定期地分析。然后将合成的乙酰化组分用作保留时间标志，但定量是基于非乙酰化的化合物。除了玉米黄质和虾青素，所有其他乙酰化的化合物仅通过UV光谱特征来鉴定。流动相由1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成用于虾青素相关化合物，或由1000mL己烷、60mL异丙醇和0.1mL乙酸组成用于玉米黄质相关化合物。每次运行的流速为0.6mL每分钟。
柱温度为环境温度。注射体积为20μL。检测器为收集210至600nm的光电二极管阵列检测器。
使用该方法的玉米黄质相关化合物的典型色谱图示于图6：
1：胡萝卜素
2：乙酰化的β-隐黄素
3：双乙酰化的玉米黄质
4：β-隐黄素
5：单乙酰化的玉米黄质
6：玉米黄质
使用上述方法的虾青素相关化合物的典型色谱图示于图7：
1：胡萝卜素
2：双乙酰化的侧金盏花黄质
3：单乙酰化的侧金盏花黄质
4：双乙酰化的虾青素
5：金盏花红素
6：单乙酰化的虾青素
7：虾青素
HPLCDADMS方法
对于通过HPLCDADMS测定乙酰化玉米黄质，将样品在冰冷的提取溶剂(包含0.01％丁基羟基甲苯(BHT)的己烷和乙酸乙酯50/50v/v混合物)中重悬。用装备WatersX-BridgeC18柱(3.5μm，2.1x50mm)和ThermoBasic8保护柱(2.1x10mm)的Alliance2795HPLC(Waters)***并使用在25℃解析类胡萝卜素。用可靠的类胡萝卜素样品作为标准。流动相和流动速率示于下文(溶剂A＝乙酸乙酯；溶剂B＝水；溶剂C＝甲醇；溶剂D＝乙腈)。注射体积为10μL。检测器为与MicroMassQuattroMicro质谱仪串联的Waters996光电二极管阵列检测器。质谱仪以用于正离子模式中的单离子监测的默认设置进行操作。使用的锥电压为35V。对于玉米黄质的保留时间为1.09分钟，最大吸光度在450nm具有阳离子模式中的单同位素质量569.4。单乙酰化的玉米黄质的保留时间为2.68分钟，最大吸光度在450nm具有阳离子模式中的单同位素质量611.4。双乙酰化的玉米黄质的保留时间为3.08分钟，最大吸光度在450nm具有阳离子模式中的单同位素质量653.4。对于其他类胡萝卜素的保留时间为：β-隐黄素，3.2分钟；番茄红素，3.6分钟；γ-胡萝卜素，3.8分钟；和β-胡萝卜素，3.95分钟。

Claims (15)

1.一种具有乙酰转移酶活性的多肽，选自下组：
a.SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14的多肽；
b.源自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14通过氨基酸的取代、***或缺失并与SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:14的序列在氨基酸水平具有至少50％同源性的多肽。
2.权利要求1的多肽，其中所述蛋白具有用于将类胡萝卜素分子转变成相应的部分或完全乙酰化的类胡萝卜素分子的酶活性，所述类胡萝卜素分子具有(a)至少一个β-紫罗兰酮和/或至少一个ε-紫罗兰酮环，和(b)至少一个环相关羟基。
3.权利要求2的多肽，其中所述蛋白具有用于将玉米黄质、虾青素、叶黄素和β-隐黄素分别转变成玉米黄质单或二乙酸酯、虾青素单或二乙酸酯、叶黄素单或二乙酸酯和β-隐黄素乙酸酯的酶活性。
4.一种编码权利要求1的多肽的分离的核酸。
5.权利要求4的分离的核酸，其由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:13中描述的序列组成。
6.一种核酸构建体或表达载体，其包含与一个或多个(几个)调控序列可操作连接的权利要求4或5的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主细胞中的产生。
7.一种能产生类胡萝卜素的转化的微生物，其中表达至少一种具有乙酰转移酶活性的异源多肽。
8.根据权利要求7的转化的微生物，其中表达权利要求4或5的核酸或权利要求6的核酸构建体。
9.权利要求7或8的用于产生类胡萝卜素的转化的微生物，其类胡萝卜素代谢与野生型不同。
10.权利要求7至9任一项的转化的微生物，其中所述微生物是含油株。
11.权利要求10的转化的微生物，其中所述含油株是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的菌株。
12.权利要求7至9任一项的转化的微生物，其中所述微生物是细菌。
13.权利要求12的转化的微生物，其中所述细菌菌株是Paracoccuszeaxanthinifaciens的菌株。
14.一种用于产生权利要求7至13任一项的转化的微生物的方法，其包括引入由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:13中描述的序列组成的与一个或多个调节信号功能性连接的核酸或核酸构建体。
15.权利要求7至13任一项的转化微生物用于产生类胡萝卜素的用途。
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