CN110951717B

CN110951717B - 一种l-***糖异构酶异构体及其应用

Info

Publication number: CN110951717B
Application number: CN201911384932.XA
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 贾东旭; 孙晨奕; 郑裕国; 金利群; 彭晨; 陈德水; 廖承军; 程新平; 李勉; 毛宝兴
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2039-12-28
Also published as: CN110951717A; WO2021128432A1

Abstract

本发明涉及一种L‑***糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化D‑半乳糖异构化制备D‑塔格糖中的应用。所述L‑***糖差向异构酶突变体，由所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第304位、(2)第75位、(3)第274位、(4)第167位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的L‑***糖差向异构酶及其突变体，该突变体具有高最适反应温度75℃，其酶活与原始酶相比提高280％。使用本突变体生产D‑tagatose，产物得率最高可达73.3％。将重组酶进行固定化并连续催化30批次，转化率均大于73％。该突变体的转化水平展示了优良的工业应用前景。

Description

一种L-***糖异构酶异构体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种L-***糖异构酶异构体突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

(二)背景技术

D-塔格糖(D-tagatose)是自然界中发现的稀有己酮糖，是D-半乳糖的异构体。它最早被发现存在于一种热带长青植物的树胶中，后来在酸奶、奶酪中也有发现。D-tagatose具有甜度高、热量低、吸收率低、有效降低血糖及抗龋齿、改善肠道菌群等性质与功效。美国食品及药物管理局已通过对D-tagatose的安全认证，准许其用于食品领域。D-tagatose的生产方法主要有化学法和生物法。化学法存在成本较高、酸碱用量高、污染严重、产物成分复杂、分离纯化难等问题。相比之下，生物法制备D-tagatose更具有优势，近年来逐渐成为研究热点。

生物法制备D-tagatose的工艺是以D-半乳糖为原料，利用L-***糖异构酶(L-arabinose isomerase，简称LAI)进行催化反应，一步法生成D-tagatose。其中，原料D-半乳糖廉价易得、整体反应过程温和易控、反应过程符合环保要求，是一种替代化学法的最优制糖方法。研究报道指出，高温和弱酸性的反应条件更有利于D-tagatose的生物转化。当前，生物法催化D-半乳糖制备D-tagatose时底物浓度偏低，均处于100g/L以下，不利于应用到工业化生产中。除此之外，可开发的酶源较少，该弊端制约着D-tagatose的生产水平。

生物信息学以核酸、蛋白质等生物大分子数据库为主要对象，辅助计算机对生物信息进行比较分析，从中获取基因编码、蛋白质结构功能及其相互关系等理性信息。在此背景下，利用生物信息学和基因工程等现代生物技术手段，筛选改造获得新型耐高温耐酸的LAI酶制剂，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种耐高温耐酸的L-***糖异构酶异构体突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-***糖差向异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.3所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第304位、(2)第75位、(3)第274位、(4)第167位。

优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO.3所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第304位甘氨酸G突变为组氨酸H、异亮氨酸I、酪氨酸Y或色氨酸W，(2)第75位甘氨酸G突变为赖氨酸K、蛋氨酸M、苯丙氨酸F或脯氨酸P，(3)第274位丙氨酸G突变为丝氨酸S、苏氨酸T、酪氨酸Y、缬氨酸V或半胱氨酸C，(4)167位丙氨酸A突变为天冬酰胺N、天冬氨酸D或精氨酸R。

进一步，所述耐高温TIM barrel蛋白酶突变体由序列如SEQ ID NO.3所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第304位甘氨酸G突变为酪氨酸Y、(2)第75位甘氨酸G突变为苯丙氨酸F、(3)第274位丙氨酸G突半胱氨酸变C、(4)167位丙氨酸A突变为精氨酸R。

更为优选的，所述L-***糖差向异构酶突变体序列如SEQ ID NO.7所示(其编码基因如SEQ ID NO.8所示)。

本发明还涉及所述L-***糖差向异构酶突变体在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

具体的，所述应用为：以含L-***糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液或菌体细胞经固定化获得的固定化酶制剂作为催化剂，以D-半乳糖为底物，在Mn²⁺和/或Co²⁺存在下，在6.0～7.0的KH₂PO₄-NaOH缓冲液中，65～80℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-塔格糖。

所述固定化酶制剂制备方法如下：称取菌体细胞，用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH6.5)悬浮，加入Celite 545，适当搅拌。加入聚乙烯亚胺水溶液在25℃、100r/min条件下絮凝，再加入三羟甲基磷(THP)水溶液，在25℃、100r/min条件下交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，获得酶的固定化颗粒。

优选的，所述L-***糖差向异构酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的L-***糖差向异构酶及其突变体，该突变体具有较高最适反应温度75℃，其酶活与原始酶相比提高280％。使用本突变体生产D-tagatose，产物得率最高可达73.3％。将重组酶进行固定化并连续催化30批次，转化率均大于73％。本发明解决了现有酶催化制备D-tagatose效率低下的难题，获得的优于文献报道的连续转化效果对提升D-tagatose工业化水平具有重要意义。

(四)附图说明

图1为重组酶的最适温度示意图；

图2为金属离子对重组酶活力的影响示意图；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型LAI的筛选与活力测定

1、酶的来源与重组菌的构建

从NCBI数据库中获得新型LAI，分别来源于Novibacillus thermophilus(GenBank编号WP_077718551.1)、Lactobacillus oris(GenBank编号WP_003716014.1)、Pseudothermotoga thermarum(GenBank编号WP_013932424.1)，并命名为NtLAI、LoLAI和PtLAI。根据氨基酸序列，依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.5所示。在核酸序列末端加入6×His-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/NtLAI、pET28b/LoLAI和pET28b/PtLAI。

2、重组菌的转化与诱导表达

将获得的重组表达质粒pET28b/NtLAI、pET28b/LoLAI和pET28b/PtLAI转化至Escherichia coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度为100μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含LAI基因的基因工程菌。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加15g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度100μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度0.5mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、重组菌的酶活测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎。取1g制备的湿菌体，用50mL 50mMKH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 6.5)悬浮，在39W条件下超声破碎15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液。

酶活反应体系：50g/L的D-半乳糖、1mM MnCl₂、50μL上述上清液(酶液)，再加入适量50mM KH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 6.5)至总体积1mL。反应条件：于40℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应，稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过膜；采用HPLC检测D-tagatose浓度。分析柱为Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm，9μm，伯乐生命医学产品有限公司)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters 717进样器。

酶活定义：40℃和pH 6.5下，每分钟将D-半乳糖异构化生成1μmolD-tagatose所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

表1：重组酶的酶活测定

实施例2：LoLAI单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据LoLAI亲本序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/LoLAI为模板，对第304位引入单突变，引物为：

正向引物304G：

ATGGCTATGGCTTCNNNGCAGAAGGTGACTTCAAAA(下划线为突变碱基)

反向引物304G：

TTTTGAAGTCACCTTCTGCNNNGAAGCCATAGCCAT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物304G 2μL(5pmol/μL，下同)，反向引物304G 2μL(5pmol/μL，下同)，模板DNA 1μL(20ng/μL，下同)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，64℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

2、突变体转化表达

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

3、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：5g/L的D-半乳糖、1mM MnCl₂，再加入50mM KH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 6.5)至总反应体系1L，备用。

在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.5mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液。取100μL上述反应混合液加入含有菌体的96孔板中，振荡器振荡混匀后在40℃、600r/min反应10min，冰浴10min停止反应。取2μL反应液以半胱氨酸-咔唑显色法筛选突变体，反应体系包括2μL反应液、5μL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐、150μL的70％(w/w)浓硫酸、5μL的0.12％(w/v)咔唑乙醇，60℃下保温10min后观察颜色变化。以重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI的反应深的突变株进行酶活精准测定。

4、阳性转化子酶活的精准测定

操作同实施例1的“重组菌的酶活测定”。

该实施例的结果为：对665株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表2。经分析确定，其余661株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第304位甘氨酸(G)突变为H、I、Y和W外的其他氨基酸。

表2：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的LoLAI-G304Y突变体记为LoLAI-1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-1。

实施例3：LoLAI双位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体LoLAI-1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/LoLAI-1为模板，对第75位引入单突变，引物为：

正向引物75G：CGACAAAGTTGCANNNGTGATGACCT(下划线为突变碱基)

反向引物75G：AGGTCATCACNNNTGCAACTTTGTCG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物75G 2μL，反向引物75G 2μL，模板DNA1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，60.5℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，阳性克隆进行酶活精准测定(操作同实施例1的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对399株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表3。经分析确定，其余395株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第75位甘氨酸(G)突变为K、M、F和P外的其他氨基酸。

表3：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的LoLAI-G304Y-G75F突变体记为LoLAI-2，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/LoLAI-2。

实施例4：LoLAI三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体LoLAI-2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/LoLAI-2为模板，对第274位引入单突变，引物为：

正向引物274G：GGTTATGATNNNTTCACCACCAACTTCCAGG(下划线为突变碱基)

反向引物274G：CCTGGAAGTTGGTGGTGAANNNATCATAACC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物274G 2μL，反向引物274G 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，59.5℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对735株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表4。经分析确定，其余730株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第274位丙氨酸(G)突变为S、T、Y、V和C外的其他氨基酸。

表4：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的LoLAI-G304Y-G75F-G274C突变体记为LoLAI-3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-3。

实施例5：LoLAI四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体LoLAI-3序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/LoLAI-3为模板，对第167位引入单突变，引物为：

正向引物167A：GGCAGAAAGTGNNNATTGCATACGATATGAGC(下划线为突变碱基)

反向引物167A：GCTCATATCGTATGCAATNNNCACTTTCTGCC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物167A 2μL，反向引物167A 2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，59℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，进行酶活精准测定(操作同实施例1的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对444株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余441株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第167位丙氨酸(A)突变为N、D和R外的其他氨基酸。

表5：四位点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的LoLAI-G304Y-G75F-G274C-A167R突变体记为LoLAI-4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-4。

实施例6：重组大肠杆菌发酵产酶与纯化

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-4接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.5mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，收集上清液。

使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

实施例7：纯化LoLAI及其突变体的最适反应温度

将实施例6中的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系为：50g/L的D-半乳糖、1mM MnCl₂、50μL上述实施例获得的纯酶液，再加入50mM KH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 6.5)至总体系1mL。分别于不同转化温度：60、65、70、75、80、85、90℃测定重组LAI的活力(操作方法同实施例1的“重组菌的酶活测定”)。由图1中可知，LoLAI-4的最适反应温度为75℃，比原始酶LoLAI提高10℃。

实施例8：金属离子对LAI最优突变体酶活的影响

将实施例6中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响。1mL反应体系包括：50mM KH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 6.5)、50g/L D-半乳糖、50μL纯酶液和1mM不同金属离子(阴离子为Cl^-)。其中，金属离子的选择如下：(1)选用单金属离子：Mn²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Cu² ⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、和Ca²⁺。于40℃测定LAI的活力。(2)设置组合金属离子，分别为1mM Mn²⁺和0.5mM Co²⁺、1mM Mn²⁺和0.5mM Zn²⁺、1mM Mn²⁺和0.5mM Mg²⁺进行酶活测定。以不加金属离子作为对照。由图2可知，Mn²⁺对LAI的酶活有极大的促进作用，并且比组合金属的效果更为明显。

实施例9：原始酶与突变酶突变重组菌全细胞制备D-tagatose

按实施例6的发酵方法，大规模发酵获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-2、E.coliBL21(DE3)/pET28b/LoLAI-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-4。分别以上述湿菌体作为生物催化剂，以D-半乳糖为底物，生物转化制备D-tagatose。催化体系包括：不同浓度的D-半乳糖、1mM MnCl₂、15g/L湿菌体，再加入适量50mM KH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 6.5)至总体系100mL。反应体系于65℃、150r/min条件下反应8h。每隔1h取样、离心，用0.22μm膜过滤后进行HPLC检测D-tagatose浓度。由表6可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-4的产物得率最终达到73.3％，高于原始酶E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI和其他突变酶的得率。

表6：各重组菌得率的比较

实施例10：E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-4的固定化与连续转化

制备30％(v/v)THP水溶液：取31.8g的四羟甲基硫酸磷溶于80mL去离子水，3.4g的氢氧化钾溶于10mL去离子水，室温25℃、100r/min条件下将两者缓慢混合，制得30％(v/v)THP水溶液，现用现配，四羟甲基硫酸磷和氢氧化钾按摩尔比1:0.995。

称取5g重组E.coli BL21(DE3)/pET28b/LoLAI-4细胞，分别用50mL的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)悬浮，加入0.3g Celite 545，适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液在25℃、100r/min条件下絮凝，再加入0.25mL体积浓度30％THP水溶液，在25℃、100r/min条件下交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，获得LoLAI-5突变体的固定化颗粒。

以上述固定化颗粒为生物催化剂，以D-半乳糖为底物，生物转化制备D-tagatose。100mL催化体系包括：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)、500g/L D-半乳糖、1mM MnCl₂、6g/L固定化颗粒。反应于65℃、200r/min、异构化2h。反应液于4℃离心，少量上清液经0.22μm膜过滤后用HPLC检测D-tagatose浓度；收集固定化颗粒，经缓冲液洗涤进行下一批转化。实验结果表明，连续催化30批次，产物得率均大于73％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种L-***糖异构酶异构体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> PRT

<213> Novibacillus thermophilus

<400> 1

Met Ile Ala Leu Lys Pro Tyr Glu Phe Trp Phe Val Thr Gly Ser Gln

1 5 10 15

His Leu Tyr Gly Glu Glu Thr Leu Gln Glu Val Glu Ala His Ala Arg

20 25 30

Gln Val Ile Asp Gly Leu Asn Ala Asp Ser Ser Ile Pro Phe Pro Ile

35 40 45

Ala Phe Lys Pro Val Leu Thr Glu Pro Asp Ala Ile Leu Arg Leu Cys

50 55 60

Leu Asp Ala Asn Arg Asp Glu Lys Cys Ala Gly Ile Val Thr Trp Met

65 70 75 80

His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Ala Gly Leu Ser Ala Leu

85 90 95

Gln Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Phe Asn Arg Asp Ile Pro

100 105 110

Trp Ser Ser Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His

115 120 125

Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Phe Ile Gly Ser Arg Met Asn Val Arg Arg

130 135 140

Lys Val Val Val Gly His Trp Lys Ser Lys Ala Val Arg Glu Arg Ile

145 150 155 160

Gly Gly Trp Met Arg Val Ala Val Ala Tyr Val Glu Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Lys Val Ala Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Val Thr Glu

180 185 190

Gly Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Gln Phe Gly Trp Ser Ile Asn Gly

195 200 205

Tyr Gly Val Gly Asp Leu Val Gln Arg Ile Asn Asp Ile Gln Glu Ala

210 215 220

Glu Val Asn Ala Leu Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Gln Tyr Asp Ile Ala

225 230 235 240

Pro Glu Gly Leu Lys Glu Gly Ala Val Arg Asp Ser Val Arg Glu Gln

245 250 255

Ala Arg Ile Glu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Gln Glu Gly Gly Phe

260 265 270

Thr Ala Phe Thr Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Gly Met Lys Gln Leu

275 280 285

Pro Gly Leu Ala Val Gln Arg Leu Met Ala Glu Gly Tyr Gly Phe Gly

290 295 300

Gly Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ala Ala Leu Val Arg Met Met Lys Ile

305 310 315 320

Leu Ala Asp Asn Glu Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His

325 330 335

Phe Glu Pro Asp Asn Glu Leu Val Leu Gly Ser His Met Leu Glu Val

340 345 350

Cys Pro Thr Val Ala Ala Thr Lys Pro Arg Val Glu Val His Pro Leu

355 360 365

Ser Ile Gly Gly Lys Glu Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Lys

370 375 380

Ser Gly Ala Ala Leu Asn Ala Ser Leu Val Asp Met Gly Asn Arg Phe

385 390 395 400

Arg Leu Leu Val Asn Glu Val Asp Ala Val Gln Pro Glu Cys Ala Met

405 410 415

Pro Lys Leu Pro Val Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Ala Pro Ser Leu

420 425 430

Ser Glu Ala Ala Glu Cys Trp Ile Val Ala Gly Gly Ala His His Thr

435 440 445

Cys Phe Ser Tyr Arg Val Thr Thr Glu Gln Leu Ile Asp Trp Ala Asp

450 455 460

Met Ala Gly Ile Glu Cys Val Val Ile Asp Lys Asp Thr Arg Arg His

465 470 475 480

Ala Phe Arg Asn Glu Leu Lys Trp Asn Glu Val Val Tyr Gly His His

485 490 495

His His His His

500

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> Novibacillus thermophilus

<400> 2

atgatcgcac tgaaaccgta tgagttctgg ttcgttaccg gcagccagca tctgtatggc 60

gaagaaacct tacaggaagt ggaagcacat gcacgccagg tgattgatgg cctgaatgcc 120

gatagcagta ttccgttccc gattgcattc aaaccggtgc tgaccgaacc ggatgcaatt 180

ctgcgcctgt gcctggatgc aaatcgtgat gaaaaatgcg ccggcattgt tacctggatg 240

cataccttca gtccggcaaa aatgtggatt gcaggcctga gcgcactgca gaaaccgctg 300

ctgcatctgc atacccagtt caatcgtgat attccgtgga gtagtattga tatggacttc 360

atgaatctga atcagagtgc acatggtgat cgtgaatatg gcttcattgg cagtcgtatg 420

aatgtgcgcc gcaaagttgt tgttggtcat tggaaaagca aagcagttcg cgaacgcatt 480

ggcggctgga tgcgcgtggc agtggcatac gttgaaggca aacagctgaa agtggcacgc 540

ttcggtgata atatgcgcga agtggcagtg accgaaggtg ataaagttga agcccagatt 600

cagttcggtt ggagcattaa tggttatggc gttggcgatc tggttcagcg tattaatgat 660

attcaggaag ccgaagtgaa tgcactgctg gatgaatatg ccgaacagta tgatattgca 720

ccggaaggtc tgaaagaagg tgcagttcgt gatagcgtgc gtgaacaggc ccgtattgaa 780

ctgggtctga aagccttcct gcaggaaggt ggcttcaccg cattcaccac caccttcgaa 840

gatctgcatg gcatgaaaca gctgccgggc ctggccgtgc agcgtcttat ggcagaaggc 900

tatggcttcg gcggcgaagg tgattggaaa accgccgccc tggttcgtat gatgaaaatt 960

ctggccgata atgaaggtac cagcttcatg gaagattata cctatcactt cgaaccggat 1020

aatgaactgg ttctgggtag ccacatgctg gaagtgtgtc cgaccgtggc cgccaccaaa 1080

ccgcgtgtgg aagtgcatcc gctgagcatt ggcggtaaag aagatccggc ccgtctggtg 1140

ttcgatggta aaagcggcgc cgcactgaat gccagcctgg ttgatatggg caatcgcttc 1200

cgtctgctgg tgaatgaagt tgatgccgtt cagccggaat gcgccatgcc gaaactgccg 1260

gtggcacgcg tgctgtggaa accggcaccg agcctgagtg aagccgccga atgttggatt 1320

gttgccggtg gcgcccatca tacctgcttc agctatcgcg ttaccaccga acagctgatt 1380

gattgggcag atatggccgg tattgaatgc gtggttattg ataaagatac ccgtcgccat 1440

gcattccgta atgaactgaa atggaatgaa gttgtgtatg gtcatcatca tcatcaccat 1500

<210> 3

<211> 480

<212> PRT

<213> Lactobacillus oris

<400> 3

Met Leu Lys Thr Pro Asp Tyr Glu Phe Trp Phe Ala Val Gly Ser Gln

1 5 10 15

Pro Leu Tyr Gly Pro Glu Ala Leu Glu Gln Val Glu Lys Asp Gly Arg

20 25 30

Lys Leu Val Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gly Lys Leu Pro Tyr Lys Val

35 40 45

Val Phe Lys Leu Val Ala Thr Thr Ala Asp Ser Ile Thr Lys Phe Met

50 55 60

Lys Asp Ala Asn Tyr Asn Asp Lys Val Ala Gly Val Met Thr Trp Met

65 70 75 80

His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Asn Trp Ile Arg Gly Thr Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Lys Pro Leu Leu His Leu Ala Thr Gln Met Leu Asp His Ile Pro

100 105 110

Phe Asp Thr Ile Asp Phe Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His

115 120 125

Gly Asp Arg Glu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ala Arg Leu Gly Val Pro Glu

130 135 140

Lys Ile Val Tyr Gly Trp Trp Asn Asp Pro Glu Val Gln Glu Glu Ile

145 150 155 160

Ala Asp Trp Gln Lys Val Ala Ile Ala Tyr Asp Met Ser Phe Lys Ile

165 170 175

Lys Ile Ala Arg Phe Gly Asp Thr Met Arg Asp Val Ala Val Thr Glu

180 185 190

Gly Asp Lys Val Ala Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Thr Val Asp Tyr

195 200 205

Trp Pro Val Ala Glu Leu Val Ala Ala Val Asn Ala Val Ser Glu Ala

210 215 220

Glu Ile Asp Glu Gln Tyr Lys Arg Leu Glu Glu Asn Tyr Asp Met Val

225 230 235 240

Glu Gly Asp Asn Asp His Asp Lys Tyr Val His Ser Val Arg Tyr Gln

245 250 255

Leu Arg Glu Tyr Leu Gly Ile Lys His Phe Leu Asp Glu Lys Gly Tyr

260 265 270

Asp Ala Phe Thr Thr Asn Phe Gln Asp Leu Glu Gly Leu Glu Gln Leu

275 280 285

Pro Gly Leu Ala Val Gln Leu Leu Met Ile Asp Gly Tyr Gly Phe Gly

290 295 300

Ala Glu Gly Asp Phe Lys Ser Ala Gly Leu Ser Arg Leu Leu Lys Ile

305 310 315 320

Ala Ala Glu Asn Lys Glu Thr Ala Phe Met Glu Asp Tyr Thr Leu Asp

325 330 335

Leu Arg Ser Gly His Gln Ala Ile Met Gly Ser His Met Leu Glu Val

340 345 350

Asp Pro Thr Leu Ala Ser Asp Lys Pro Arg Val Glu Val His Pro Leu

355 360 365

Asp Ile Gly Asp Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Thr Gly Ser

370 375 380

Glu Gly Glu Gly Ile Asp Val Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Asp Gly Tyr

385 390 395 400

Lys Phe Ile Ala Tyr Asp Val Asp Cys Ala Lys Pro Glu Lys Glu Met

405 410 415

Pro Asn Leu Pro Val Ala Lys Gln Met Trp Thr Pro Lys Cys Gly Leu

420 425 430

Lys Lys Gly Ala Thr Ala Trp Met His Asn Gly Gly Gly His His Thr

435 440 445

Val Leu Ser Met Asn Leu Ser Met Asp Gln Met Ala Thr Leu Ala Asn

450 455 460

Leu Phe Gly Ile Glu Leu Ile Asp Ile Lys His His His His His His

465 470 475 480

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> Lactobacillus oris

<400> 4

atgctgaaaa cacctgatta tgagttctgg ttcgccgttg gtagccagcc gctgtatggt 60

ccggaagcac tggaacaggt ggaaaaagat ggccgcaaac tggtggatgg cctgaatgca 120

agcggcaaac tgccgtataa agttgtgttc aaactggttg ccaccaccgc cgatagcatt 180

accaaattca tgaaagatgc aaattacaac gacaaagttg caggcgtgat gacctggatg 240

cataccttca gtccggccaa aaattggatt cgtggcaccc agctgctgca gaaaccgctg 300

ctgcatctgg caacccagat gctggatcat attccgttcg ataccattga cttcgattat 360

atgaatctga atcagagcgc acatggtgat cgcgaatatg attatattaa tgcacgcctg 420

ggcgttccgg aaaaaattgt gtatggttgg tggaatgatc cggaagttca ggaagaaatt 480

gcagattggc agaaagtggc aattgcatac gatatgagct tcaaaattaa gattgcccgc 540

ttcggcgata ccatgcgtga tgttgcagtg accgaaggcg ataaagtggc cgcacagatt 600

aaactgggtt ggaccgttga ttattggccg gtggccgaac tggtggcagc cgtgaatgca 660

gttagcgaag ccgaaattga tgaacagtat aaacgtctgg aagaaaatta tgatatggtt 720

gaaggcgata atgatcatga taaatatgtt catagcgtgc gctatcagct gcgcgaatat 780

ctgggtatta aacacttcct ggatgaaaaa ggttatgatg cattcaccac caacttccag 840

gatctggaag gtctggaaca gctgccgggc ctggccgtgc agctgttaat gattgatggc 900

tatggcttcg gcgcagaagg tgacttcaaa agcgcaggcc tgagccgtct gctgaaaatt 960

gcagccgaaa ataaagaaac cgcattcatg gaagattata ccctggatct gcgcagcggt 1020

catcaggcaa ttatgggtag tcacatgctg gaagttgatc cgaccctggc aagcgataaa 1080

ccgcgtgttg aagttcatcc gctggatatt ggtgataaag cagatccggc ccgtctggtg 1140

ttcaccggca gcgaaggtga aggcattgat gttaccctga gctacttcga tgatggttat 1200

aaattcattg cctatgatgt tgattgcgcc aaaccggaaa aagaaatgcc gaatctgccg 1260

gttgccaaac agatgtggac cccgaaatgc ggtctgaaaa aaggtgcaac cgcctggatg 1320

cataatggcg gcggccatca taccgtgctg agtatgaatc tgagtatgga tcagatggcc 1380

accctggcca atctgttcgg cattgaactg attgatatta aacatcatca ccatcatcac 1440

<210> 5

<211> 500

<212> PRT

<213> Pseudothermotoga thermarum

<400> 5

Met Ile Asp Leu Lys Lys Tyr Glu Phe Trp Leu Leu Val Gly Ser Gln

1 5 10 15

His Leu Tyr Gly Ser Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Arg

20 25 30

Lys Ile Val Glu Glu Leu Ser Lys Asp Leu Pro Ser Pro Leu Leu Phe

35 40 45

Lys Gly Val Leu Thr Thr Pro Glu Glu Ile Leu Arg Thr Phe Glu Gln

50 55 60

Ala Asn Ala Gln Thr Asn Cys Ala Gly Val Ile Thr Trp Met His Thr

65 70 75 80

Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Lys Gly Leu Leu Ala Asn Lys Lys

85 90 95

Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Phe Asn Arg Glu Ile Pro Trp Asp

100 105 110

Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His Gly Asp

115 120 125

Arg Glu His Gly Tyr Ile His Ala Arg Leu Arg Leu Pro Arg Lys Val

130 135 140

Val Val Gly His Trp Gln Asp Ser Glu Val Lys Arg Glu Ile Ser Lys

145 150 155 160

Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Ala Asp Gly Arg Ser Gly Gln Ile

165 170 175

Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu Ala Asp

180 185 190

Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Ile Gly Trp Ser Ile Asn Thr Trp Gly

195 200 205

Val Gly Glu Leu Ala Glu Arg Val Lys Ser Val Ser Glu Asn Leu Val

210 215 220

Glu Asp Leu Ile Lys His Tyr Ala Glu Lys Tyr Val Leu Pro Ser Gly

225 230 235 240

Glu Tyr Glu Leu Lys Ala Ile Lys Glu Gln Ala Arg Ile Glu Ile Ala

245 250 255

Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr Thr Thr

260 265 270

Phe Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala Val Gln

275 280 285

Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp Trp Lys

290 295 300

Val Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Lys Val Met Gly Val Gly Leu Lys

305 310 315 320

Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Leu Pro Glu Gly

325 330 335

Asn Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Ile Cys Pro Ser Ile

340 345 350

Ala Lys Glu Lys Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile Gly Gly

355 360 365

Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Glu Ala Gln Val Gly Glu Ala

370 375 380

Leu Asn Ala Ser Ile Val Asp Leu Gly Asn Arg Phe Arg Leu Val Val

385 390 395 400

Asn Lys Val Ile Ser Val Pro Leu Val Lys Pro Met Pro Lys Leu Pro

405 410 415

Val Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Leu Pro Asn Phe Lys Ala Ala Ala

420 425 430

Thr Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ser His His Thr Ala Phe Ser Thr

435 440 445

Ala Val Asp Pro Ser Tyr Leu Ile Asp Trp Ala Glu Met Leu Asp Ile

450 455 460

Glu Cys Val Val Ile Asp Glu Lys Leu Asp Leu Glu Arg Phe Lys Ala

465 470 475 480

Glu Leu Arg Ala Asn Glu Val Tyr Trp Gly Phe Phe Lys Lys His His

485 490 495

His His His His

500

<210> 6

<211> 1500

<212> DNA

<213> Pseudothermotoga thermarum

<400> 6

atgatcgatc tgaaaaagta cgagttctgg ctgctggttg gcagtcagca tctgtatggt 60

agcgaaacct taaaaaaagt tgaacagcag gcccgcaaaa ttgttgaaga actgagcaaa 120

gatctgccga gcccgctgct gttcaaaggt gttctgacca ccccggaaga aattctgcgt 180

accttcgaac aggccaatgc ccagaccaat tgcgcaggcg ttattacctg gatgcatacc 240

ttcagcccga gtaaaatgtg gattaaaggc ctgctggcca ataaaaaacc gctgctgcat 300

ctgcataccc agttcaatcg tgaaattccg tgggatacca ttgatatgga ttatatgaat 360

ctgaaccaga gtgcccacgg tgatcgcgaa catggttata ttcatgcccg tctgcgtctg 420

ccgcgtaaag tggtggtggg ccattggcag gatagtgaag tgaaacgcga aattagtaaa 480

tggatgcgcg tggcatgtgc cattgcagat ggccgtagtg gccagattgt gcgcttcggt 540

gataatatgc gtgaagttgc aagtaccgaa gcagataaag tggaagccca gattaaaatt 600

ggttggagta ttaatacctg gggtgttggc gaactggcag aacgcgtgaa aagtgtgagt 660

gaaaatctgg tggaagatct gattaaacat tatgccgaaa aatacgttct gccgagtggt 720

gaatatgaac tgaaagccat taaagaacag gcacgcattg aaattgcact gcgcgagttc 780

ctgaaagaaa aaaatgccat tgcattcacc accaccttcg aagatctgca tgatctgccg 840

cagctgccgg gcctggccgt tcaacgtctg atggaagaag gttatggctt cggtgccgaa 900

ggtgattgga aagtggcagg cctggtgcgc gcactgaaag ttatgggcgt tggcctgaaa 960

ggcggcacca gcttcatgga agattatacc tatcatctgc cggaaggtaa tgaactggtg 1020

ctgggtgcac acatgctgga aatctgtccg agcattgcaa aagaaaaacc gcgtattgaa 1080

gttcatccgc tgagtattgg tggtaaagca gatccggccc gcctggtgtt cgaagcacag 1140

gtgggtgaag ccctgaatgc cagtattgtt gatctgggca atcgcttccg tctggtggtg 1200

aataaagtga ttagcgttcc gctggttaaa ccgatgccga aactgccggt tgcacgcgtt 1260

ctgtggaaac cgctgccgaa cttcaaagcc gccgccaccg catggattct ggccggtggt 1320

agtcatcata ccgcattcag taccgccgtt gatccgagtt atctgattga ttgggccgaa 1380

atgctggata ttgaatgcgt tgtgattgat gaaaaactgg atctggaacg cttcaaagcc 1440

gaactgcgtg caaatgaagt gtattggggc ttcttcaaaa aacatcatca tcatcaccat 1500

<210> 7

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

Met Leu Lys Thr Pro Asp Tyr Glu Phe Trp Phe Ala Val Gly Ser Gln

1 5 10 15

Pro Leu Tyr Gly Pro Glu Ala Leu Glu Gln Val Glu Lys Asp Gly Arg

20 25 30

Lys Leu Val Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gly Lys Leu Pro Tyr Lys Val

35 40 45

Val Phe Lys Leu Val Ala Thr Thr Ala Asp Ser Ile Thr Lys Phe Met

50 55 60

Lys Asp Ala Asn Tyr Asn Asp Lys Val Ala Phe Val Met Thr Trp Met

65 70 75 80

His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Asn Trp Ile Arg Gly Thr Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Lys Pro Leu Leu His Leu Ala Thr Gln Met Leu Asp His Ile Pro

100 105 110

Phe Asp Thr Ile Asp Phe Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His

115 120 125

Gly Asp Arg Glu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ala Arg Leu Gly Val Pro Glu

130 135 140

Lys Ile Val Tyr Gly Trp Trp Asn Asp Pro Glu Val Gln Glu Glu Ile

145 150 155 160

Ala Asp Trp Gln Lys Val Asn Ile Ala Tyr Asp Met Ser Phe Lys Ile

165 170 175

Lys Ile Ala Arg Phe Gly Asp Thr Met Arg Asp Val Ala Val Thr Glu

180 185 190

Gly Asp Lys Val Ala Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Thr Val Asp Tyr

195 200 205

Trp Pro Val Ala Glu Leu Val Ala Ala Val Asn Ala Val Ser Glu Ala

210 215 220

Glu Ile Asp Glu Gln Tyr Lys Arg Leu Glu Glu Asn Tyr Asp Met Val

225 230 235 240

Glu Gly Asp Asn Asp His Asp Lys Tyr Val His Ser Val Arg Tyr Gln

245 250 255

Leu Arg Glu Tyr Leu Gly Ile Lys His Phe Leu Asp Glu Lys Gly Tyr

260 265 270

Asp Cys Phe Thr Thr Asn Phe Gln Asp Leu Glu Gly Leu Glu Gln Leu

275 280 285

Pro Gly Leu Ala Val Gln Leu Leu Met Ile Asp Gly Tyr Gly Phe Tyr

290 295 300

Ala Glu Gly Asp Phe Lys Ser Ala Gly Leu Ser Arg Leu Leu Lys Ile

305 310 315 320

Ala Ala Glu Asn Lys Glu Thr Ala Phe Met Glu Asp Tyr Thr Leu Asp

325 330 335

Leu Arg Ser Gly His Gln Ala Ile Met Gly Ser His Met Leu Glu Val

340 345 350

Asp Pro Thr Leu Ala Ser Asp Lys Pro Arg Val Glu Val His Pro Leu

355 360 365

Asp Ile Gly Asp Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Thr Gly Ser

370 375 380

Glu Gly Glu Gly Ile Asp Val Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Asp Gly Tyr

385 390 395 400

Lys Phe Ile Ala Tyr Asp Val Asp Cys Ala Lys Pro Glu Lys Glu Met

405 410 415

Pro Asn Leu Pro Val Ala Lys Gln Met Trp Thr Pro Lys Cys Gly Leu

420 425 430

Lys Lys Gly Ala Thr Ala Trp Met His Asn Gly Gly Gly His His Thr

435 440 445

Val Leu Ser Met Asn Leu Ser Met Asp Gln Met Ala Thr Leu Ala Asn

450 455 460

Leu Phe Gly Ile Glu Leu Ile Asp Ile Lys His His His His His His

465 470 475 480

<210> 8

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

atgctgaaaa cacctgatta tgagttctgg ttcgccgttg gtagccagcc gctgtatggt 60

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accaaattca tgaaagatgc aaattacaac gacaaagttg catttgtgat gacctggatg 240

cataccttca gtccggccaa aaattggatt cgtggcaccc agctgctgca gaaaccgctg 300

ctgcatctgg caacccagat gctggatcat attccgttcg ataccattga cttcgattat 360

atgaatctga atcagagcgc acatggtgat cgcgaatatg attatattaa tgcacgcctg 420

ggcgttccgg aaaaaattgt gtatggttgg tggaatgatc cggaagttca ggaagaaatt 480

gcagattggc agaaagtgaa tattgcatac gatatgagct tcaaaattaa gattgcccgc 540

ttcggcgata ccatgcgtga tgttgcagtg accgaaggcg ataaagtggc cgcacagatt 600

aaactgggtt ggaccgttga ttattggccg gtggccgaac tggtggcagc cgtgaatgca 660

gttagcgaag ccgaaattga tgaacagtat aaacgtctgg aagaaaatta tgatatggtt 720

gaaggcgata atgatcatga taaatatgtt catagcgtgc gctatcagct gcgcgaatat 780

ctgggtatta aacacttcct ggatgaaaaa ggttatgatt gtttcaccac caacttccag 840

gatctggaag gtctggaaca gctgccgggc ctggccgtgc agctgttaat gattgatggc 900

tatggcttct atgcagaagg tgacttcaaa agcgcaggcc tgagccgtct gctgaaaatt 960

gcagccgaaa ataaagaaac cgcattcatg gaagattata ccctggatct gcgcagcggt 1020

catcaggcaa ttatgggtag tcacatgctg gaagttgatc cgaccctggc aagcgataaa 1080

ccgcgtgttg aagttcatcc gctggatatt ggtgataaag cagatccggc ccgtctggtg 1140

ttcaccggca gcgaaggtga aggcattgat gttaccctga gctacttcga tgatggttat 1200

aaattcattg cctatgatgt tgattgcgcc aaaccggaaa aagaaatgcc gaatctgccg 1260

gttgccaaac agatgtggac cccgaaatgc ggtctgaaaa aaggtgcaac cgcctggatg 1320

cataatggcg gcggccatca taccgtgctg agtatgaatc tgagtatgga tcagatggcc 1380

accctggcca atctgttcgg cattgaactg attgatatta aacatcatca ccatcatcac 1440

Claims

1.一种L-***糖差向异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.3所示氨基酸经定点突变而来，所述突变为下列之一：（1）第304位甘氨酸G突变为酪氨酸Y；（2）第304位甘氨酸G突变为酪氨酸Y，且第75位甘氨酸G突变为苯丙氨酸F；（3）第304位甘氨酸G突变为酪氨酸Y，且第75位甘氨酸G突变为苯丙氨酸F，且第274位丙氨酸A突变为半胱氨酸C；（4）第304位甘氨酸G突变为酪氨酸Y，且第75位甘氨酸G突变为苯丙氨酸F，且第274位丙氨酸A突变为半胱氨酸C，且第167位丙氨酸A突变为精氨酸R。

2.权利要求1所述L-***糖差向异构酶突变体在催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以含L-***糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液或菌体细胞经固定化获得的固定化酶制剂作为催化剂，以D-半乳糖为底物，在Mn²⁺和/或Co²⁺存在下，在6.0~7.0 的KH₂PO₄-NaOH缓冲液中，65~80℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-塔格糖。