CN115948263A - 一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用 - Google Patents
一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用，属于生物技术领域。本发明所涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200，2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(编号CCTCC M 20221772)。该酿酒酵母通过高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选获得，其在36‑40℃、200‑300g/L条件下具有良好的厌氧乙醇发酵性能。40℃发酵消耗葡萄糖高达220g/L，乙醇浓度可达90g/L，菌体浓度较传统酵母菌株提高27‑72％，发酵过程乙醇生产强度可达2.3‑3.4g/L/h，糖醇转化率维持0.41‑0.42g/g。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用。
背景技术
化石燃料的使用导致全球CO2含量升高，温室效应加剧，自1813年至2019年，大气中CO2含量由220增至411mg/L，而利用可再生生物质能有助于减缓CO2排放，其中，乙醇由于具有较高的辛烷值、良好的抗爆性和低污染性，被认为是理想的可再生替代能源之一。生物乙醇根据其原料来源的不同可分为第一代淀粉基燃料乙醇和第二代纤维素燃料乙醇。与汽油相比，玉米乙醇可减少39％-52％的温室气体排放，而纤维素乙醇可减少86％的温室气体排放。事实上，世界各国积极采取新的能源举措并出台相关政策，在减少化石燃料使用的同时，加大扶持以生物燃料乙醇为代表的生物质能源产业，全球燃料乙醇需求与产量激增，2019年高达8800万吨，比2000年提升了731％。
事实上，酿酒酵母可通过无氧发酵合成乙醇，细胞摄取葡萄糖后，通过糖酵解途径将葡萄糖转变为丙酮酸，进一步催化转化为产物乙醇。然而，纤维素乙醇生物炼制过程中，所需的高温环境会抑制酿酒酵母的生长并阻碍细胞活力，导致细胞中的生物大分子大量聚集及变性，同时破坏细胞膜的完整性，增加膜通透性，影响质膜的流动性，最终导致细胞死亡。与此同时，为实现高浓度乙醇发酵，葡萄糖浓度一般选择200-300g/L甚至更高水平，然而高浓度发酵糖往往引发高渗透压环境，促使酿酒酵母细胞膜渗透压感受器激活高渗甘油途径，对酿酒酵母细胞造成强胁迫作用，导致酿酒酵母细胞增殖和活力降低，抑制菌体浓度及碳源利用，进而影响乙醇产量、糖醇转化率及生产强度。因而，如何提高酿酒酵母高温高糖高渗耐性，对于高浓度乙醇发酵应用尤为重要。
近年来，针对酿酒酵母高糖高温条件下乙醇发酵，已报道了一些研究进展。宋丹(耐高温酿酒酵母S-13连续发酵生产燃料乙醇的研究[D].华中农业大学,2011.)以实验室筛选出来的耐高温酿酒酵母S-13作为发酵菌株，在37℃，以4％接种量在含有180g/L葡萄糖的培养基中发酵48h，乙醇产量为86.4g/L。张继林(原生质体融合技术选育高产乙醇酵母[D].北京化工大学,2009.)将市售安琪酵母与实验室酵母进行原生质体融合，获得了一株融合酵母，于37℃，利用含有300g/L葡萄糖的发酵培养基中进行乙醇发酵，乙醇产量最高可达137.5g/L。张金伟等(耐高温工业酿酒酵母的筛选和发酵性能研究[J].酿酒科技,2021(06):23-28.)以环境筛选的一株酿酒酵母为出发菌株，对其Rad52基因进行敲除，并对其进行适应性进化选育，获得了一株酿酒酵母S.C.D12，该菌株于37℃利用350g/L液化醪进行乙醇发酵，乙醇终浓度可达100g/L。
发明内容
为有效解决高浓度乙醇发酵过程中高温、高糖、高渗环境对酿酒酵母细胞的强胁迫抑制，导致厌氧乙醇发酵性能不稳定、不理想的问题，本发明提供了一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用。本发明提供的酵母在36-40℃、200-300g/L葡萄糖高温高糖高渗条件下，菌体生长、碳源利用、乙醇合成性能以及糖醇转化率及乙醇生产强度等生产指标得到显著提升。
本发明一方面提供了一株高温高糖高渗耐受酵母，是由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SG(菌种保藏编号：CCTCC M 20221770)经高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选获得，于2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200，保藏编号为：CCTCC M 20221772。
进一步地，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200能够在36-40℃、200-300g/L高温高糖高渗条件下具有良好的厌氧乙醇发酵性能。40℃发酵消耗葡萄糖高达220g/L，乙醇浓度可达90g/L，菌体浓度较传统酵母菌株EB、4126、6525提高27-72％，发酵过程乙醇生产强度可达2.3-3.4g/L/h，糖醇转化率维持0.41-0.42g/g。
本发明第二方面提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200选育方法，包括高温高糖高渗环境驯化选育与高通量筛选方法。
进一步地，高温高糖高渗环境驯化选育方法包括以下步骤：
(1)将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG稀释涂布于YPD固体培养基上，在36℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母SG单菌落；
(2)将上述步骤(1)中的酿酒酵母SG单菌落，转接至YPD液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母SG活化菌液；
(3)将上述步骤(2)中的酿酒酵母SG活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于36℃，150rpm连续转接、培养20个周期，每个周期维持24h，获得酿酒酵母菌液；
(4)将上述步骤(3)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有YPD固体培养基上，在38℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
(5)将上述步骤(4)中的酿酒酵母单菌落，转接至含有YPD液体培养基中，于38℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母活化菌液；
(6)将上述步骤(5)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于38℃，150rpm连续转接、培养30个周期，每个周期维持36h；
(7)将上述步骤(6)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于YPD固体培养基上，在40℃条件下培养24-36h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
(8)将上述步骤(7)中的酿酒酵母单菌落，转接至YPD液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；
(9)将上述步骤(8)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至含有300g/L葡萄糖的发酵培养基中，于40℃，150rpm连续转接、培养40个周期，每个周期维持48h，获得酿酒酵母菌液；
(10)将上述步骤(9)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于YPD固体培养基上，在42℃条件下培养36-48h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
(11)将上述步骤(10)中的酿酒酵母单菌落，转接至YPD液体培养基中，于42℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；
(12)将上述步骤(11)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于42℃，150rpm连续转接、培养20个周期，每个周期维持48h，获得酿酒酵母菌液；
(13)将上述步骤(12)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于YPD固体培养基上，在44℃条件下培养48-60h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落，即为高温高糖高渗耐受酿酒酵母；
(14)将上述步骤(13)中获得的的酿酒酵母单菌落，分别转接至YPD液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，再与40％甘油溶液混合，各冻存于-80℃环境，即高温高糖高渗驯化选育获得的酿酒酵母菌液。
更进一步地，高通量筛选方法包括以下步骤：
(1)将上述高温高糖高渗驯化选育获得的酿酒酵母菌液，按1％接种量分别转接至YPD液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养12-24h后，再按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于40℃、150rpm发酵培养24-36h，获得发酵菌液；
(2)将上述步骤(1)中的发酵菌液进行梯度稀释(10-5，10-6,10-7)，用移液器吸取100μL稀释液，均匀涂布于固体发酵培养基上，培养至48-72h形成单菌落；
(3)使用一次性96孔板，单孔加入200μL发酵培养基；
(4)挑取上述步骤(2)中的全部单菌落，分别转接至到上述步骤(3)中的96孔板中进行发酵培养，使用高通量Q-mix***，测量初始OD600，在40℃静置培养24h后再次测量OD600，初筛获得培养24hOD600与初始OD600差值＞3.5的酿酒酵母菌株；
(5)将上述步骤(4)中初筛的酿酒酵母菌株，经过活化后，再按10％接种量转接至装有200μL发酵培养基的96孔板孔洞中，于40℃静置培养至发酵终点即无气泡产生且菌体沉降至孔板底部，复筛获得发酵完全后残糖含量最低、乙醇浓度最高的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200。
上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200高浓度乙醇发酵应用中，所用的发酵条件为200-300g/L葡萄糖厌氧发酵。
本发明第三方面提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200高浓度乙醇发酵应用方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，30-40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
(2)在无菌条件下，将上述步骤(1)中单菌落接种到YPD液体培养基中，30-40℃，150-200rpm振荡培养12-48h，制备活化菌液，用于厌氧乙醇发酵培养；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中活化菌液按5％-10％接种量接入液体合成培养基或毒性水解液培养基中，30-40℃，150-200rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养24-72h。
进一步地，所用的发酵培养基营养成分包含葡萄糖200-300g/L，酵母提取物12-36g/L，蛋白胨6-18g/L，硫酸铵1.5-4.5g/L，磷酸二氢钾1.5-4.5g/L，尿素0.5-2.5g/L，谷氨酸钠0.5-1.5g/L，七水合硫酸镁0.5-1.0g/L，一水合硫酸锰0.001-0.01g/L，七水合硫酸锌0.05-0.5g/L，五水合硫酸铜0.001-0.01g/L，氯化钙0.01-0.1g/L，六水合氯化铁0.01-0.1g/L，碘化钾0.001-0.01g/L，肌醇0.05-0.15g/L，维生素B5 0.05-0.15g/L，生物素0.1-0.5g/L，烟酸0.01-0.1g/L，对氨基苯甲酸0.01-0.1g/L，HCl-硫胺素0.01-0.05g/L，HCl-吡哆醛0.01-0.1g/L，其余为水，自然pH。
本发明的有益效果：本发明所提供的一株高温高糖高渗耐受酵母及其选育方法，是基于前期在厌氧、高温、抑制物胁迫环境中分离获得的(Saccharomyces cerevisiae)SG(菌种保藏编号：CCTCC M 20221770)，通过高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选方法，获得的一株具有显著胁迫抗逆及高浓度乙醇发酵特性的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200。本发明所提供的酿酒酵母SG200在36-40℃、200-300g/L条件下的高浓度乙醇发酵应用，40℃发酵消耗葡萄糖高达220g/L，乙醇浓度可达90g/L，菌体浓度较传统酵母菌株提高27-72％，发酵过程乙醇生产强度可达2.3-3.4g/L/h，糖醇转化率维持0.41-0.42g/g。综上所述，本发明丰富了乙醇生产优良菌种资源与种类，有效解决了高浓度乙醇发酵过程中由于高温、高糖、高渗环境对酿酒酵母细胞的强胁迫抑制，导致的厌氧乙醇发酵性能不稳定、不理想的问题，显著提升了厌氧乙醇发酵糖醇转化率及乙醇生产强度等生产指标。
附图说明
图1是40℃培养条件下酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG菌落形态及数量示意图；
图2是40℃培养条件下酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200菌落形态及数量示意图；
图3(a)～图3(c)是36℃条件下酿酒酵母EB、4126、6525、SG200利用200g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较示意图；
图4(a)～图4(c)是40℃条件下酿酒酵母EB、4126、6525、SG200利用200g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较示意图；
图5(a)～图5(c)是40℃条件下酿酒酵母EB、4126、6525、SG200利用300g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应该理解为对本发明的限制。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG的分离
本发明首先采集乙醇发酵厂储罐底泥样本，对采集样品进行梯度稀释涂布并分离获得单菌落，具体分离筛选操作步骤为：
a.采集乙醇发酵厂储罐底泥样本，采样环境为厌氧、36-45℃、富含多种抑制物，采样量为1mL或1g，加至含有99mL无菌水的三角摇瓶中，于30-45℃，150-200rpm条件下振荡培养60-120min。
b.用移液器进行梯度稀释(10-2、10-3、10-4)，取100μL稀释液涂布于YPD固体培养基上，每个稀释浓度涂布10个培养皿，5个一组置于30-45℃培养箱中厌氧培养24-72h，观察菌落形成情况，挑取不同单菌落进行稀释划线分离培养，再转接至YPD培养基上划线纯化与保藏。
上述所用YPD固体培养基组成为(g/L)：蛋白胨20、酵母提取物10、葡萄糖20、琼脂15。其余为水补足至1000mL，自然pH，121℃高压湿热灭菌15min。
其中，在按不同稀释浓度所涂布的全部培养皿上，30-45℃培养箱中厌氧培养24-72h，分别纯化保藏不同培养条件下最快生长出来的若干单菌落。
实施例2：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG的鉴定
菌株形态特征如下：在培养温度30-45℃条件下，在YPD固体培养基上培养24-72h后，形成的单菌落为圆形、乳白色、表面平滑且有光泽、且菌落边缘整齐。根据《真菌鉴定手册》判断单菌落菌株具有典型真菌属形态特征。
提取上述分离并纯化得到的菌株基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行18s rDNA测序分析(测序结果详见序列表SEQ ID NO.1)，通过NCBI数据库中BLAST同源比对，选取同源性较高的酿酒酵母及其序列，用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，同时结合菌落形态特征，初步鉴定分离纯化菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，已于2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG，以下叙述简称酿酒酵母SG或Sc SG，保藏编号为CCTCC M20221770，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
如图1所示，40℃培养条件下酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG菌落形态及数量。
SEQ ID NO.1：
CCATACTCCCCCCAGACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGTGGGTCATTAAAAAAACACCACCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCATCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACGTCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCAAACGGCCTATTCTATTATTCCATGCTAATATATTCGAGCAATACGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCAAAGTAAAAGTCCTGGTTCGCCAAGAGCCACAAGGACTCAAGGTTAGCCAGAAGGAAAGGCCCCGTTGGAAATCCAGTACACGAAAAAATCGGACCGGCCAACAGGGCCCAAAGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGGTAAGGTATTTACATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGAATGGGCCCTGTATCGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGAATTAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTTATTCCCCGTTACCCGTTTAAACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCAGCACAAGGCCATGCGATTCGAAAAGTTATTATGAATCATCAAAGAGTCCGAAGACATTGATTTTTTATCTAATAAATACATCTCTTCCAAAGGGTCGAGATTTTAAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGTTATACCATGTAGTAAAGGGAACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTAAAAATTGCTTATACTTAGAACATGCATGGCTTAATCTTTGTAGACA
实施例3：酿酒酵母SG的高温高糖高渗环境驯化
a.将实施例2中获得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG稀释涂布于YPD固体培养基上，在36℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母SG单菌落；
b.将上述步骤a中的酿酒酵母SG单菌落，转接至含有100g/L葡萄糖的YPD液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母SG活化菌液；
c.将上述步骤b中的酿酒酵母SG活化菌液，按5-10％接种量转接至含有100g/L葡萄糖的发酵培养基中，于36℃，150rpm连续转接、培养20个周期，每个周期维持24h；
d.将上述步骤c中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有100g/L葡萄糖的YPD固体培养基上，在38℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
e.将上述步骤d中的酿酒酵母单菌落，转接至含有200g/L葡萄糖的YPD液体培养基中，于38℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母活化菌液；
f.将上述步骤e中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至含有200g/L葡萄糖的发酵培养基中，于38℃，150rpm连续转接、培养30个周期，每个周期维持36h；
g.将上述步骤f中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有200g/L葡萄糖的YPD固体培养基上，在40℃条件下培养24-36h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
h.将上述步骤g中的酿酒酵母单菌落，转接至含有300g/L葡萄糖的YPD液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；
i.将上述步骤h中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至含有300g/L葡萄糖的发酵培养基中，于40℃，150rpm连续转接、培养40个周期，每个周期维持48h；
j.将上述步骤i中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有300g/L葡萄糖的YPD固体培养基上，在42℃条件下培养36-48h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
k.将上述步骤j中的酿酒酵母单菌落，转接至含有300g/L葡萄糖的YPD液体培养基中，于42℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；
l.将上述步骤k中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至含有300g/L葡萄糖的发酵培养基中，于42℃，150rpm连续转接、培养20个周期，每个周期维持48h；
m.将上述步骤l中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有300g/L葡萄糖的YPD固体培养基上，在44℃条件下培养48-60h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落，即为高温高糖高渗耐受酿酒酵母；
n.将上述步骤m中获得的单菌落，分别转接至含有100g/L葡萄糖的YPD液体培养基中，
于36℃、150rpm活化培养12-24h，再与40％甘油溶液混合，各冻存于-80℃环境。
上述所用固体或YPD液体培养基、发酵培养基组分主要包含葡萄糖100g/L或200g/L或300g/L，酵母提取物12g/L或20g/L或36g/L，蛋白胨6g/L或12g/L或18g/L，硫酸铵1.5g/L或3g/L或4.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L或3g/L或4.5g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
实施例4：高通量筛选获得酿酒酵母SG200
a.将上述实施例3中高温高糖高渗驯化选育获得的酿酒酵母菌液，按1％接种量分别转接至含有100g/L葡萄糖的YPD液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养12-24h后，再按5-10％接种量转接至含有200g/L葡萄糖的发酵培养基中，于40℃、150rpm发酵培养24-36h；
b.将上述步骤a中的发酵菌液进行梯度稀释(10-5，10-6,10-7)，用移液器吸取100μL稀释液，均匀涂布于含有300g/L葡萄糖的固体发酵培养基上，培养至48-72h形成单菌落；
c.使用一次性96孔板，单孔加入200μL含有300g/L葡萄糖的发酵培养基；
d.挑取上述步骤b中的全部单菌落，分别转接至到上述步骤c中的96孔板中进行发酵培养，使用高通量Q-mix***，测量初始OD600，在40℃静置培养24h后再次测量OD600，初筛获得培养24hOD600与初始OD600差值＞3.5的酿酒酵母菌株；
e.将上述步骤d中初筛的酿酒酵母菌株，经过活化后，再按10％接种量转接至装有200μL发酵培养基(含300g/L葡萄糖)的96孔板孔洞中，于40℃静置培养至发酵终点即无气泡产生且菌体沉降至孔板底部，复筛获得发酵完全后残糖含量最低、乙醇浓度最高的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200，并于2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(编号CCTCC M 20221772)。
如图2所示，40℃培养条件下酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200菌落形态及数量。
上述所用固体或YPD液体培养基、发酵培养基组分主要包含葡萄糖100g/L或200g/L或300g/L，酵母提取物12g/L或20g/L或36g/L，蛋白胨6g/L或12g/L或18g/L，硫酸铵1.5g/L或3g/L或4.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L或3g/L或4.5g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
实施例5：36℃条件下酿酒酵母利用200g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较
1.酿酒酵母SG200乙醇发酵
利用实施例4中获得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200(以下叙述简称酿酒酵母SG200或Sc SG200)作为实验组菌株，在36℃条件下依次进行平板培养、活化培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下，将酿酒酵母SG200保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，36℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
b.在无菌条件下，将上述步骤a中酿酒酵母SG200单菌落接种到YPD液体培养基中，36℃，150rpm振荡培养12-24h，制备活化菌液，用于发酵培养；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中酿酒酵母SG200活化菌液按10％接种量接入液体合成培养基中，36℃，150rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养48h。
上述所用发酵培养基组分主要包含葡萄糖200g/L，酵母提取物20g/L，蛋白胨12g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾3g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
2.酿酒酵母EB、4126、6525乙醇发酵(对照例)
利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EB、4126、6525(以下叙述简称酿酒酵母EB、4126、6525或Sc EB、Sc 4126、Sc 6525)为对照组菌株，均保藏于实验室，在36℃条件下，分别依次进行平板培养、活化培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下，分别将酿酒酵母EB、4126、6525保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，36℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
b.在无菌条件下，分别将上述步骤a中酿酒酵母EB、4126、6525单菌落接种到YPD液体培养基中，36℃，150rpm振荡培养12-24h，制备活化菌液，用于发酵培养；
c.在无菌条件下，分别将上述步骤b中酿酒酵母EB、4126、6525活化菌液按10％接种量接入液体合成培养基中，36℃，150rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养48h。
上述所用发酵培养基组分主要包含葡萄糖200g/L，酵母提取物20g/L，蛋白胨12g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾3g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
如图3(a)～图3(c)所示，36℃条件下酿酒酵母EB、4126、6525、SG200利用200g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较。结果表明，酿酒酵母SG200快速消耗葡萄糖，菌体浓度OD600最大值为7.2，较酿酒酵母EB、4126、6525分别提高了10.8％、28.6％、35.8％。酿酒酵母SG200发酵24h即合成了88g/L乙醇，乙醇生产强度为3.67g/L/h，而酿酒酵母EB、4126、6525同一时间乙醇生产强度分别为3.35、3.25、3.20g/L/h；酿酒酵母SG200厌氧发酵乙醇浓度可达89g/L，糖醇转化率为0.45g/g，而酿酒酵母EB、4126、6525分别为0.41、0.40、0.41g/g。可见，本发明经高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选获得的酿酒酵母SG200，在40℃、200g/L葡萄糖厌氧发酵条件下，具有良好的高浓度乙醇发酵性能。
实施例6：40℃条件下酿酒酵母利用200g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较
1.酿酒酵母SG200乙醇发酵
利用实施例4中获得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200(以下叙述简称酿酒酵母SG200或Sc SG200)作为实验组菌株，在40℃条件下依次进行平板培养、活化培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下，将酿酒酵母SG200保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
b.在无菌条件下，将上述步骤a中酿酒酵母SG200单菌落接种到YPD液体培养基中，40℃，150rpm振荡培养24-36h，制备活化菌液，用于发酵培养；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中酿酒酵母SG200活化菌液按10％接种量接入液体合成培养基中，40℃，150rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养48h。
上述所用发酵培养基组分主要包含葡萄糖200g/L，酵母提取物20g/L，蛋白胨12g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾3g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
2.酿酒酵母EB、4126、6525乙醇发酵(对照例)
利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EB、4126、6525(以下叙述简称酿酒酵母EB、4126、6525或Sc EB、Sc 4126、Sc 6525)为对照组菌株，均保藏于实验室，在40℃条件下，分别依次进行平板培养、活化培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下，分别将酿酒酵母EB、4126、6525保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
b.在无菌条件下，分别将上述步骤a中酿酒酵母EB、4126、6525单菌落接种到YPD液体培养基中，40℃，150rpm振荡培养24-36h，制备活化菌液，用于发酵培养；
c.在无菌条件下，分别将上述步骤b中酿酒酵母EB、4126、6525活化菌液按10％接种量接入液体合成培养基中，40℃，150rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养48h。
上述所用发酵培养基组分主要包含葡萄糖200g/L，酵母提取物20g/L，蛋白胨12g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾3g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
如图4(a)～图4(c)所示，40℃条件下酿酒酵母EB、4126、6525、SG200利用200g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较。结果表明，酿酒酵母SG200仍在24h内耗尽200g/L葡萄糖，菌体浓度OD600最大值为4.6，较酿酒酵母EB、4126、6525分别提高了27.8％、64.3％、70.4％，且酿酒酵母EB发酵48h耗尽200g/L葡萄糖，而酿酒酵母4126、6525各仅消耗了165g/L葡萄糖。酿酒酵母SG200发酵24h即合成了81.4g/L乙醇，乙醇生产强度为3.39g/L/h，而酿酒酵母EB、4126、6525同一时间乙醇生产强度分别降至2.50、2.70、2.77g/L/h；酿酒酵母SG200厌氧发酵乙醇浓度可达84.5g/L，糖醇转化率为0.42g/g，而酿酒酵母EB、4126、6525均为0.40g/g。可见，本发明经高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选获得的酿酒酵母SG200，在40℃、200g/L葡萄糖厌氧发酵条件下，仍具有良好的高浓度乙醇发酵性能。实施例7：40℃条件下酿酒酵母利用300g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较
1.酿酒酵母SG200乙醇发酵
利用实施例4中获得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200(以下叙述简称酿酒酵母SG200或Sc SG200)作为实验组菌株，在40℃条件下依次进行平板培养、活化培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下，将酿酒酵母SG200保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
b.在无菌条件下，将上述步骤a中酿酒酵母SG200单菌落接种到YPD液体培养基中，40℃，150rpm振荡培养24-36h，制备活化菌液，用于发酵培养；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中酿酒酵母SG200活化菌液按10％接种量接入液体合成培养基中，40℃，150rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养60h。
上述所用发酵培养基组分主要包含葡萄糖300g/L，酵母提取物36g/L，蛋白胨18g/L，硫酸铵4.5g/L，磷酸二氢钾4.5g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
2.酿酒酵母EB、4126、6525乙醇发酵(对照例)
利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EB、4126、6525(以下叙述简称酿酒酵母EB、4126、6525或Sc EB、Sc 4126、Sc 6525)为对照组菌株，均保藏于实验室，在40℃条件下，分别依次进行平板培养、活化培养与发酵培养实验，具体操作步骤如下：
a.无菌条件下，分别将酿酒酵母EB、4126、6525保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
b.在无菌条件下，分别将上述步骤a中酿酒酵母EB、4126、6525单菌落接种到YPD液体培养基中，40℃，150rpm振荡培养24-36h，制备活化菌液，用于发酵培养；
c.在无菌条件下，分别将上述步骤b中酿酒酵母EB、4126、6525活化菌液按10％接种量接入液体合成培养基中，40℃，150rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养60h。
上述所用发酵培养基组分主要包含葡萄糖300g/L，酵母提取物36g/L，蛋白胨18g/L，硫酸铵4.5g/L，磷酸二氢钾4.5g/L，尿素1g/L，谷氨酸钠1g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，一水合硫酸锰0.005g/L，七水合硫酸锌0.4g/L，五水合硫酸铜0.003g/L，氯化钙0.02g/L，六水合氯化铁0.02g/L，碘化钾0.001g/L，肌醇0.09g/L，维生素B5 0.07g/L，生物素0.3g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，HCl-硫胺素0.02g/L，HCl-吡哆醛0.04g/L，其余为水，自然pH。
如图5(a)～图5(c)所示，40℃条件下酿酒酵母EB、4126、6525、SG200利用300g/L葡萄糖的厌氧乙醇发酵比较。结果表明，酿酒酵母SG200发酵全程可消耗220g/L葡萄糖，菌体浓度OD600最大值为3.6，较酿酒酵母EB、4126、6525分别提高了71.4％、50.0％、56.5％，且酿酒酵母EB、4126、6525发酵全程仅能消耗140-160g/L葡萄糖，表明40℃、300g/L葡萄糖引发的高温高糖高渗胁迫对酿酒酵母EB、4126、6525抑制作用显著。酿酒酵母SG200发酵24h即合成了55.8g/L乙醇，乙醇生产强度为2.33g/L/h，而酿酒酵母EB、4126、6525同一时间乙醇生产强度分别进一步降至0.75、1.67、1.30g/L/h；酿酒酵母SG200厌氧发酵乙醇浓度可达90g/L，糖醇转化率为0.41g/g，而酿酒酵母EB、4126、6525糖醇转化率分别为0.38、0.38、0.40g/g。可见，本发明经高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选获得的酿酒酵母SG200，在40℃、300g/L葡萄糖厌氧发酵条件下，仍具有良好的高浓度乙醇发酵性能。
Claims (8)
1.一株高温高糖高渗耐受酵母，于2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200，保藏编号为：CCTCC M 20221772。
2.权利要求1所述的高温高糖高渗耐受酵母的选育方法，其特征在于，是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG，菌种保藏编号：CCTCC M 20221770，经高温高糖高渗环境驯化选育及高通量筛选。
3.根据权利要求2所述的高温高糖高渗耐受酵母的选育方法，其特征在于，高温高糖高渗环境驯化选育包括以下步骤：
(1)将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG稀释涂布于YPD固体培养基上，在36℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母SG单菌落；
(2)将步骤(1)中的酿酒酵母SG单菌落，转接至YPD液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母SG活化菌液；
(3)将步骤(2)中的酿酒酵母SG活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于36℃，150rpm连续转接、培养20个周期，每个周期维持24h，获得酿酒酵母菌液；
(4)将步骤(3)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有YPD固体培养基上，在38℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
(5)将步骤(4)中的酿酒酵母单菌落，转接至含有YPD液体培养基中，于38℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母活化菌液；
(6)将步骤(5)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于38℃，150rpm连续转接、培养30个周期，每个周期维持36h；
(7)将步骤(6)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于YPD固体培养基上，在40℃条件下培养24-36h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
(8)将上述步骤(7)中的酿酒酵母单菌落，转接至YPD液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；
(9)将步骤(8)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于40℃，150rpm连续转接、培养40个周期，每个周期维持48h，获得酿酒酵母菌液；
(10)将步骤(9)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于YPD固体培养基上，在42℃条件下培养36-48h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；
(11)将步骤(10)中的酿酒酵母单菌落，转接至YPD液体培养基中，于42℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；
(12)将步骤(11)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于42℃，150rpm连续转接、培养20个周期，每个周期维持48h，获得酿酒酵母菌液；
(13)将步骤(12)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于YPD固体培养基上，在44℃条件下培养48-60h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落，即为高温高糖高渗耐受酿酒酵母；
(14)将步骤(13)中获得的的酿酒酵母单菌落，分别转接至YPD液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，再与40％甘油溶液混合，各冻存于-80℃环境，即高温高糖高渗驯化选育获得的酿酒酵母菌液。
4.根据权利要求3所述的高温高糖高渗耐受酵母的选育方法，其特征在于，高通量筛选包括以下步骤：
(15)将步骤(14)中获得的高温高糖高渗驯化选育获得的酿酒酵母菌液，按1％接种量分别转接至YPD液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养12-24h后，再按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于40℃、150rpm发酵培养24-36h，获得发酵菌液；
(16)将步骤(15)中的发酵菌液进行梯度稀释，稀释梯度分别为10-5、10-6和10-7，用移液器吸取100μL稀释液，均匀涂布于固体发酵培养基上，培养至48-72h形成单菌落；
(17)使用一次性96孔板，单孔加入200μL发酵培养基；
(18)挑取步骤(16)中的全部单菌落，分别转接至到上述步骤(17)中的96孔板中进行发酵培养，使用高通量Q-mix***，测量初始OD600，在40℃静置培养24h后再次测量OD600，初筛获得培养24hOD600与初始OD600差值＞3.5的酿酒酵母菌株；
(19)将步骤(18)中初筛的酿酒酵母菌株，经过活化后，再按10％接种量转接至装有200μL发酵培养基的96孔板孔洞中，于40℃静置培养至发酵终点即无气泡产生且菌体沉降至孔板底部，复筛获得发酵完全后残糖含量最低、乙醇浓度最高的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200。
5.根据权利要求3或4所述的高温高糖高渗耐受酵母的选育方法，其特征在于，所述的发酵培养基营养成分包含葡萄糖200-300g/L，酵母提取物12-36g/L，蛋白胨6-18g/L，硫酸铵1.5-4.5g/L，磷酸二氢钾1.5-4.5g/L，尿素0.5-2.5g/L，谷氨酸钠0.5-1.5g/L，七水合硫酸镁0.5-1.0g/L，一水合硫酸锰0.001-0.01g/L，七水合硫酸锌0.05-0.5g/L，五水合硫酸铜0.001-0.01g/L，氯化钙0.01-0.1g/L，六水合氯化铁0.01-0.1g/L，碘化钾0.001-0.01g/L，肌醇0.05-0.15g/L，维生素B5 0.05-0.15g/L，生物素0.1-0.5g/L，烟酸0.01-0.1g/L，对氨基苯甲酸0.01-0.1g/L，HCl-硫胺素0.01-0.05g/L，HCl-吡哆醛0.01-0.1g/L，其余为水，自然pH。
6.权利要求1所述的高温高糖高渗耐受酵母应用于高浓度乙醇发酵。
7.根据权利要求6所述的高温高糖高渗耐受酵母在高浓度乙醇发酵应用，其特征在于，所述的发酵条件为200-300g/L葡萄糖厌氧发酵。
8.根据权利要求6或7所述的高温高糖高渗耐受酵母在高浓度乙醇发酵应用，其特征在于，
包括以下步骤：
(1)无菌条件下，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SG200保藏液稀释涂布于YPD固体培养基，30-40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；
(2)在无菌条件下，将步骤(1)中单菌落接种到YPD液体培养基中，30-40℃，150-200rpm振荡培养12-48h，制备活化菌液，用于厌氧乙醇发酵培养；
(3)在无菌条件下，将步骤(2)中活化菌液按5％-10％接种量接入液体合成培养基或毒性水解液培养基中，30-40℃，150-200rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养24-72h。
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