CN109632784A - 一种定量检测抗坏血酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测抗坏血酸的方法,所述方法利用二氧化锰纳米片与抗坏血酸发生氧化还原反应,引起二氧化锰纳米片溶液颜色的变化,再联合紫外分光光度计实现抗坏血酸的定量检测。所述方法简便高效、灵敏度高、成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和化学分析技术领域,具体涉及一种定量检测抗坏血酸的方法。
背景技术
抗坏血酸(Ascorbic acid)又称维生素C,是一种常见的水溶性维生素和抗氧化剂。抗坏血酸是脑***中最重要的神经化学物质之一,在人体氧化还原代谢反应中起调节作用,对人类的生命过程发挥着极其重要的作用。如果缺乏抗坏血酸将会导致免疫力降低、坏血病、精神疾病、***症和癌症等疾病。由于人体不能自身合成抗坏血酸,必须从食物中获取,因此对抗坏血酸的精确检测对于疾病的预防与诊断具有重要的意义。到目前为止,人们可以通过氧化剂法、分光光度法、色谱法、化学发光法和电极催化氧化法等分析方法实现对抗坏血酸的检测。然而,这些方法检测限较高,往往需要昂贵的仪器或较繁琐的实验过程,同时对检测人员要求较高。
氧化剂法是指利用抗坏血酸的还原性,加入氧化剂,发生氧化还原反应,通过检测氧化剂的反应量,计算抗坏血酸的含量或浓度。氧化剂法也可以联合分光光度法、色谱法和化学发光法使用。不同价态的金属化合物是良好的氧化剂。氧化剂法原理简单,操作简便,样品的测试成本较低。例如,专利CN201810411180.0提供了一种快速检测抗坏血酸的新方法,该方法将二氧化锰纳米材料、邻苯二胺和抗坏血酸同时混合,通过检测两个荧光强度的变化实现对抗坏血酸浓度的检测。专利CN201710139059.2公开了一种显色剂及其制备方法和应用,该显色剂由羟基氧化钴纳米片混悬液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液混合制得,其中羟基氧化钴纳米片与所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔比为2:1,显色剂与抗坏血酸混合,反应体系由蓝色变为无色。
二氧化锰纳米材料是一种常用的氧化剂,它发生氧化还原反应时伴有颜色变化,肉眼可直接辨认,常用于定性检测抗坏血酸。而且二氧化锰纳米材料具有高表面积、水溶性、低毒性和良好的生物相容性,能够用于生化检测领域。常用的二氧化锰纳米材料的制备方法为:将KMnO4加入MES缓冲液中,用蒸馏水溶解后,将混合物超声处理,然后离心分离得二氧化锰纳米材料。这种方法操作复杂,高锰酸钾在实验时危险性较高。
总之,目前用于抗坏血酸检测分析的方法存在一些缺点,需要进一步开发更加简便高效、灵敏度高、成本低廉的抗坏血酸检测的新方法。本发明建立了一种基于二氧化锰纳米片的对抗坏血酸的简单、快速且低成本的检测方法。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种定量检测抗坏血酸的方法,所述方法首先使用安全高效的方法制备了二氧化锰纳米片,然后将二氧化锰纳米片作为氧化剂,与抗坏血酸发生氧化还原反应,随着抗坏血酸的不断加入,使二氧化锰纳米片的Mn4+被还原为Mn2+,并引起溶液颜色的变化。
具体的,本发明提供了一种定量检测抗坏血酸的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)配置二氧化锰胶体悬浮液,并测定紫外吸光度,所述悬浮液为二氧化锰纳米片分散在水中形成的二氧化锰胶体悬浮液;
(b)将不同浓度的抗坏血酸标准溶液分别与所述二氧化锰胶体悬浮液混合;
(c)测定步骤(b)中不同混合液的紫外可见吸收光谱和吸光度,并绘制标准曲线;
(d)将待测抗坏血酸溶液与所述二氧化锰胶体悬浮液混合;
(e)测定步骤(d)中混合液的紫外可见吸收光谱和吸光度;
(f)根据步骤(e)中的吸光度和步骤(c)得到的标准曲线,计算待测抗坏血酸溶液的浓度和/或含量。
所述步骤(a)、(c)和(e)中,所述紫外可见光测定的波长为370nm。
所述二氧化锰纳米片定量检测抗坏血酸的方法的检测限为98nmol/L。
所述步骤(a)中,所述二氧化锰胶体悬浮液的制备方法为本发明提供的二氧化锰纳米片的制备方法。
优选的,所述二氧化锰胶体悬浮液的浓度为50-120μmol/L,更优选的,所述二氧化锰胶体悬浮液的浓度为80-100μmol/L。在本发明的一个具体实施方式中,所述二氧化锰胶体悬浮液的浓度为98.2μmol/L。
所述步骤(b)中,所述抗坏血酸标准溶液的浓度范围为0.01-100μmol/L,优选的,所述抗坏血酸标准溶液的浓度范围为0.1-60μmol/L。
优选的,所述抗坏血酸标准溶液使用分析纯级别以上的抗坏血酸纯品进行配置,尽量减少杂质。
所述混合过程的pH值为5.1-7.0;所述混合过程的温度为10℃-55℃,所述温度范围较宽;所述混合过程的时间不少于30分钟。在本发明的一个具体实施方式中,所述混合过程的温度为室温,所述混合过程的时间为30分钟。
优选的,所述混合过程在涡旋震荡的条件下进行。
所述步骤(c)中,所述标准曲线的横坐标为抗坏血酸标准溶液的浓度,纵坐标为(A0-A)/A0值,对所述标准曲线进行线性拟合,所述A为抗坏血酸存在时二氧化锰胶体悬浮液的紫外吸光度,A0为抗坏血酸不存在时二氧化锰胶体悬浮液的紫外吸光度,得到y=f(x)的表达式,其中,y表示标准曲线的纵坐标,x表示标准曲线的横坐标。
优选的,所述标准曲线为线形的;优选的,通过拍照记录所述不同混合液的颜色。
所述步骤(d)中,所述待测抗坏血酸溶液与二氧化锰胶体悬浮液的混合条件与所述步骤(b)的混合条件相同;所述二氧化锰胶体悬浮液的浓度与步骤(a)中的二氧化锰胶体悬浮液的浓度相同。
所述步骤(f)中,将步骤(e)测得的吸光度代入步骤(c)的线性拟合方程,计算待测溶液的抗坏血酸含量。
在本发明的一个具体实施方式中,将步骤(e)测得的吸光度作为y值代入步骤(c)得到的y=f(x)方程式中,通过数学运算求得x值,所述x值为待测溶液的抗坏血酸浓度,进而可以计算得出待测溶液的抗坏血酸含量。
所述待测抗坏血酸溶液中含有的杂质对所述二氧化锰纳米片定量检测抗坏血酸的方法的影响可以忽略,所述杂质选自NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、葡萄糖、蔗糖、乳糖、BSA、ATP、氨基酸和Cys中的一种或两种以上的组合。
所述二氧化锰胶体悬浮液的制备方法包括以下步骤:
(1)配置碱溶液;
(2)配置氧化溶液;
(3)配置原料溶液;
(4)氧化反应;
(5)超声分散。
所述步骤(1)中,所述碱溶液为氢氧化四乙基胺溶液,所述氢氧化四乙基胺溶液的浓度为0.6mol/L。
所述步骤(2)中,所述氧化溶液为过氧化氢溶液,所述过氧化氢溶液的质量分数为3%。
所述步骤(3)中,所述原料溶液为氯化锰水溶液,所述氯化锰水溶液的浓度为0.3mol/L。
所述步骤(1)-(3)中,使用的溶剂水均为蒸馏水。
所述步骤(4)中,所述氧化反应为将所述的碱溶液和氧化溶液在短时间内快速加入到所述原料溶液中,所述时间为10-20秒,优选的,所述时间为15秒。
所述氧化反应中,原料溶液由无色溶液变为深褐色溶液,所述深褐色溶液在室温下搅拌至少12小时,然后将深褐色溶液进行离心(转速8000,20分钟),再用蒸馏水和甲醇洗涤,去除杂质,得到二氧化锰纳米片。
所述步骤(5)中,所述二氧化锰纳米片加入蒸馏水中,再进行超声处理,所述超声处理时间至少4小时,使二氧化锰纳米片分散剥离至水溶液中,得到均匀的二氧化锰纳米片水溶液,即二氧化锰胶体悬浮液。
所述二氧化锰纳米片的制备方法通过Lambert-Beer定律,计算获得的二氧化锰纳米片水溶液的浓度。
所述二氧化锰纳米片在X射线衍射图谱(XRD)中具有位于5.9°,21.6°,36.2°和65.4°的2θ衍射峰。
所述二氧化锰纳米片的红外光谱(FT-IR)中,500cm-1附近的宽吸收峰对应于[MnO6]八面体中Mn-O键的伸缩振动,3400cm-1与1630cm-1两处较强的峰来源于二氧化锰纳米片层与层之间的水分子,948cm-1、1488cm-1和2800-3100cm-1的吸收带对应于二氧化锰纳米片中的TMA阳离子。
所述二氧化锰胶体悬浮液在紫外-可见光谱表征中,在~370nm处具有较宽的吸收峰。
所述二氧化锰胶体悬浮液表现出较强的丁达尔光散射现象。
附图说明
图1(A)是本发明制备的二氧化锰胶体悬浮液的紫外-可见吸收光谱,其中,内部插图显示了氯化锰溶液和二氧化锰胶体悬浮液的数码照片图像。
图1(B)是本发明制备的二氧化锰胶体悬浮液的丁达尔效应照片。
图1(C)是本发明制备的二氧化锰纳米片XRD表征图谱。
图1(D)是本发明制备的二氧化锰纳米片红外表征图谱。
图2是本发明制备的二氧化锰胶体悬浮液与不同浓度的抗坏血酸溶液混合后的紫外-可见吸收光谱和相应的数码照片,其中,A表示抗坏血酸溶液浓度为0μmol/L,照片A颜色为深棕色,B表示抗坏血酸溶液浓度为20μmol/L,照片B颜色为浅棕色,C表示抗坏血酸溶液浓度为60μmol/L,照片C颜色为无色。
图3(A)是本发明的一种定量检测抗坏血酸的方法中检测所需的时间优化实验图,其中,二氧化锰胶体悬浮液浓度为102μmol/L,抗坏血酸溶液浓度为10μmol/L。
图3(B)是本发明的一种定量检测抗坏血酸的方法中检测所需的pH值优化实验图,图中的误差条是实验重复三次的标准差。
图3(C)是本发明的一种定量检测抗坏血酸的方法中检测所需的温度优化实验图,其中,A0为二氧化锰胶体悬浮液(浓度为98μmol/L)的吸光度,A为二氧化锰胶体悬浮液与浓度为10μmol/L的抗坏血酸溶液混合后的吸光度,图中的误差条是实验重复三次的标准差。
图4(A)是本发明的一种定量检测抗坏血酸的方法的步骤(d)测定的不同浓度的抗坏血酸标准溶液与二氧化锰胶体悬浮液混合后的紫外-可见吸收光谱,其中,曲线按照从上至下的顺序分别为抗坏血酸标准溶液浓度0、0.2、0.6、2、6、10、20、40、60μmol/L。
图4(B)是图4(A)不同混合液的照片,其中,从左到右为抗坏血酸标准溶液的浓度(0、0.2、0.6、2、6、10、20、40、60μmol/L)增加的照片,照片从左至右混合液颜色由深棕色逐渐变浅至无色。
图4(C)是图4(A)的标准曲线及其线性拟合,其中,线形拟合方程为y=0.00354+0.02599x,R2=0.9998,A0表示无抗坏血酸时二氧化锰胶体悬浮液的吸光度,A表示不同抗坏血酸浓度下二氧化锰胶体悬浮液在~370nm处的吸光度,图中的误差条是实验重复三次的标准差。
图5(A)是二氧化锰胶体悬浮液(98μmol/L)对不同的金属离子和生物分子吸光度响应的选择性比较图,其中,MgCl2,CaCl2,Cys和抗坏血酸为10μmol/L,BSA为0.2%,其他干扰物的浓度均为100μmol/L,图中的误差条是实验重复三次的标准差。
图5(B)是在抗坏血酸溶液中加入其他潜在干扰物时,二氧化锰胶体悬浮液(98μmol/L)的吸光度响应的抗干扰性能研究图,其中,MgCl2,CaCl2,Cys和抗坏血酸为10μmol/L,BSA为0.2%,其他干扰物的浓度均为100μmol/L,图中的误差条是实验重复三次的标准差。
图6是本发明的检测抗坏血酸的原理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1实验部分
1.1试剂
抗坏血酸、氢氧化四乙基铵、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnCl2·4H2O(99.99%)和H2O2(30%)购买自阿拉丁(上海)试剂公司;L-谷氨酸(Glu)、L-精氨酸(Arg)、L-组氨酸(His)、L-赖氨酸(Lys)、L-苏氨酸(Thr)、三磷酸腺苷(ATP)、葡萄糖、蔗糖、乳糖、牛血清白蛋白(BSA)购买自Sigma-Aldrich试剂公司。以上试剂购买后未经纯化直接使用。所有的水溶液均使用电阻率≥18.2M的超纯水配制。
1.2二氧化锰纳米片的制备方法
将20mL含有0.6mol/L的氢氧化四乙基铵和3%H2O2的水溶液在15秒内快速加入到0.3mol/L的MnCl2水溶液中,生成的深褐色溶液在室温下搅拌过夜,再经离心(8000rpm,20分钟)分离得到粗产物,然后进一步用水和甲醇洗去残留的杂质。为获得均匀的二氧化锰纳米片的水溶液,需要将制备得到的MnO2通过超声至少4小时,使MnO2分散剥离至水溶液中,最后通过Lambert-Beer定律计算获得的二氧化锰胶体悬浮液的浓度(MnO2纳米片在~370nm处的摩尔吸光系数为9.6×103M-1·cm-1)。
1.3基于二氧化锰纳米片的抗坏血酸定量检测的可行性研究
将1.8mL二氧化锰胶体悬浮液(98.2μmol/L)与0.2mL浓度分别为20μmol/L和60μmol/L的抗坏血酸水溶液混合,将其用涡旋振荡仪混合均匀后室温下放置30分钟,然后测定混合液的紫外可见吸收光谱,同时使用数码照相机对溶液外观进行拍照。
1.4优化检测条件
1.4.1检测时间
将1.8mL二氧化锰胶体悬浮液(102μmol/L)与0.2mL浓度为10μmol/L的抗坏血酸水溶液相混合,将其用涡旋振荡仪混合均匀,然后测定不同检测时间的混合液的紫外吸光度。
1.4.2检测pH值
将2mL二氧化锰胶体悬浮液(85μmol/L)调节pH至1.5-7.0,室温下放置30分钟,然后测定不同检测pH值以及超纯水中各自在370nm的吸光度。
1.4.3检测温度
将1.8mL二氧化锰胶体悬浮液(98μmol/L)与0.2mL浓度为10μmol/L的抗坏血酸水溶液相混合,将其用涡旋振荡仪混合均匀后室温下放置30分钟,然后测定不同检测温度的混合液的紫外吸光度。
1.5绘制标准曲线
将1.8mL二氧化锰胶体悬浮液(98.2μmol/L)与0.2mL浓度分别为0、0.2、0.6、2、6、10、20、40、60μmol/L的抗坏血酸标准溶液混合,将其用涡旋振荡仪混合均匀后室温下放置30分钟,然后分别测定不同混合液的紫外可见吸收光谱,同时使用数码照相机对溶液外观进行拍照。
1.6检测的选择性研究
通过下面的实验过程实现本发明检测体系的选择性研究:将分别含有以下干扰物质的200μL水溶液【NaCl(1mmol/L),KCl(1mmol/L),MgCl2(0.1mmol/L),CaCl2(0.1mmol/L),葡萄糖(1mmol/L),蔗糖(1mmol/L),乳糖(1mmol/L),BSA(0.225%),ATP(1mmol/L),或氨基酸(Glu,Arg,His,Lys,Thr)(1mmol/L),Cys(0.1mmol/L)】与1.8mL二氧化锰胶体悬浮液(98.2μmol/L)混合30分钟后,测定不同混合液的紫外吸光度。
1.7实际样品的检测
进一步将本发明的二氧化锰胶体悬浮液应用于维生素C片和各种商品化果汁中的抗坏血酸含量的测定。维生素C片购买自当地药店,每片标记抗坏血酸含量约100mg。取五粒维生素C药片研磨成粉末后溶解于超纯水中;商品化的果汁经2000rpm离心10分钟后,将上清液用超纯水稀释适当倍数。按照本发明提供的二氧化锰纳米片定量检测抗坏血酸的方法进行检测。
2结果与讨论
2.1 MnO2纳米片的合成与表征
MnO2纳米片通过本发明提供的二氧化锰纳米片的制备方法进行合成,并进一步利用紫外-可见光谱、红外光谱和X射线衍射等方法对制成的二氧化锰纳米片结构进行表征。当将氢氧化四乙基铵、H2O2和MnCl2三者的水溶液混合后,反应溶液立即从无色变为深褐色,表明Mn2+被氧化为Mn4+。层状的MnO2纳米片可以通过超声剥离的方法获得,如图1(A)所示,紫外-可见光谱表明制成的二氧化锰纳米片在~370nm处具有较宽的吸收峰。图1(B)所示,所制备的二氧化锰胶体悬浮液表现出较强的丁达尔光散射现象,证明通过剥离的方法能够成功制备得到了MnO2纳米级片层结构。在X射线衍射图谱(XRD)中(图1C),位于5.9°,21.6°,36.2°和65.4°的2θ衍射峰是层状MnO2的特征峰。红外光谱(FT-IR)中(图1D),500cm-1附近的宽吸收峰对应于[MnO6]八面体中Mn-O键的伸缩振动,3400cm-1与1630cm-1两处较强的峰则是来源于MnO2纳米片层与层之间的水分子,948cm-1、1488cm-1和2800-3100cm-1的吸收带对应于MnO2纳米片中的TMA阳离子。通过以上表征结果表明,本发明成功制备得到分散于水中的MnO2纳米片胶体溶液,即二氧化锰胶体悬浮液。
2.2基于二氧化锰胶体悬浮液的抗坏血酸定量检测的可行性分析
MnO2纳米片具有较强的氧化能力,能够被H2O2或谷胱甘肽等还原剂还原为Mn2+,同时,随着还原剂浓度的增加,MnO2纳米片水溶液的颜色将逐渐褪色。为了进行基于二氧化锰胶体悬浮液颜色变化在应用于抗坏血酸定量检测的可行性分析,本发明首先检测了抗坏血酸加入前后的二氧化锰胶体悬浮液颜色的变化情况,并利用数码相机和紫外可见光谱进行了表征。如图2所示,二氧化锰胶体悬浮液在~370nm处具有较强的吸收峰,并且其外观显现黄褐色;当20μmol/L抗坏血酸溶液加入相同浓度的二氧化锰胶体悬浮液后,吸光度明显降低,并且其颜色减退为浅棕色;当抗坏血酸溶液浓度增加到60μmol/L,MnO2纳米片由于被还原成Mn2+,在~370nm处的吸收峰也几乎消失,并且溶液变成无色。以上实验结果表明,基于二氧化锰胶体悬浮液颜色变化的方法,可以应用于抗坏血酸的定量检测。
2.3优化检测条件
为了获得最佳的检测性能,本发明研究了检测时间、pH值和温度对检测结果的影响。首先,根据二氧化锰胶体悬浮液在~370nm处的吸光强度,对检测时间进行了优化。如图3(A)所示,当抗坏血酸加入到检测体系中,随着检测时间的增加,吸光度的信号强度快速降低,大约在30分钟后基本达到反应平衡。因此,在后续的实验过程中,选择的检测时间为30分钟。本发明进一步研究了pH和温度对检测结果的影响,如图3(B)所示,当检测pH值在5.1-7.0之间时,检测后的吸光度基本保持一致,并且与在超纯水的反应结果也基本相近。因此,在整个实验过程中使用超纯水作为反应介质,以达到实验操作的便利性与应用的广泛性。本发明还在20℃-50℃的温度范围内进行了上述检测,实验结果表明(图3C),温度的变化对检测体系的性能影响不大。因此,为了简化实验操作,后续实验操作在室温下进行。
2.4检测抗坏血酸的标准曲线
为了绘制检测抗坏血酸的标准曲线,在优化的检测条件下,将二氧化锰胶体悬浮液在~370nm处的吸光度作为抗坏血酸浓度的定量检测指标。图4(A)显示当抗坏血酸标准溶液浓度从0μmol/L增加到60μmol/L时,二氧化锰胶体悬浮液的紫外吸收峰逐渐降低。此外,我们也用数码相机记录了不同浓度的抗坏血酸标准溶液中,二氧化锰胶体悬浮液颜色的变化。如图4(B)所示,随着抗坏血酸标准溶液浓度的增加,二氧化锰胶体悬浮液的颜色由黄棕色减退至无色。如图4(C)所示,(A0-A)/A0值与抗坏血酸标准溶液的浓度在0.1-20μmol/L范围内表现出良好的线性关系(相关系数R2=0.9998)。检测限为98nmol/L(3σ/k,σ是空白信号的标准偏差,k校准曲线的斜率)。上述结果表明,本发明提供的二氧化锰纳米片定量检测抗坏血酸的方法可以作为一种简单、高灵敏度的抗坏血酸检测方法。
2.5检测体系的选择性研究
为了研究所述方法的专属选择性,在优化的检测条件下,测试了金属离子、生物分子、碳水化合物和氨基酸等潜在干扰物质对本发明检测体系选择性的影响。如图5(A)所示,可以清楚地看到,在抗坏血酸存在时,二氧化锰胶体悬浮液的吸光度信号变化值较大;而潜在干扰物质即使在较高的浓度情况下,二氧化锰胶体悬浮液的吸光度信号的变化值都较小,因此,干扰物质对测定的紫外吸收信号的影响不大。同时,本发明对传感***的抗干扰性能也进行了评价。从图5(B)可以看出,当潜在干扰物质加入检测体系后,潜在干扰物质的存在并没有引起吸光度的明显变化,因此对抗坏血酸的检测信号仅会产生轻微的影响。上述实验结果表明,本发明提供的二氧化锰纳米片定量检测抗坏血酸的方法对抗坏血酸具有良好的选择性。
2.6应用于实际样品中抗坏血酸的含量测定
为了评价所述方法在实际样品测试中的应用,本发明采用标准添加法,分别测定了所述方法在维生素C片和各种商业果汁样品中的抗坏血酸的回收率实验。首先将维生素C片研磨成粉末后溶解在水中,将果汁样品稀释到适当的浓度,并在样品中加入一系列抗坏血酸标准溶液;然后将样品加入到二氧化锰胶体悬浮液中。紫外光谱测量结果列于表1和表2,结果显示,所述方法在样品中测定抗坏血酸的平均回收率在95-105%之间,相对标准差(RSD)小于5%。实验表明,所述方法在复杂混合物样品中工作性能良好,并能够直接用于抗坏血酸的实际样品定量检测。
表1.维生素C片中抗坏血酸的检测结果
a维生素C片,生产自华中药业(襄阳)有限公司。
表2.商业果汁中抗坏血酸的检测结果
a果粒橙,生产自可口可乐(上海)有限公司。
b混合果蔬,生产自农夫山泉(杭州)有限公司。
c水蜜桃汁,生产自娃哈哈集团(杭州)有限公司。
3.结论
本发明建立了一种简便、高效、灵敏的抗坏血酸的定量检测方法,并将其应用于实际样品的维生素C的检测中。本发明提供的基于二氧化锰胶体悬浮液颜色变化的检测体系,将在食品化学和生物医学等领域具有广泛的应用前景。
Claims (10)
1.一种定量检测抗坏血酸的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)配置二氧化锰胶体悬浮液,并测定紫外吸光度,所述悬浮液为二氧化锰纳米片分散在水中形成的二氧化锰胶体悬浮液;
(b)将不同浓度的抗坏血酸标准溶液分别与所述二氧化锰胶体悬浮液混合;
(c)测定步骤(b)中不同混合液的紫外可见吸收光谱和吸光度,并绘制标准曲线;
(d)将待测抗坏血酸溶液与所述二氧化锰胶体悬浮液混合;
(e)测定步骤(d)中混合液的紫外可见吸收光谱和吸光度;
(f)根据步骤(e)中的吸光度和步骤(c)得到的标准曲线,计算待测抗坏血酸溶液的浓度和/或含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法的抗坏血酸检测限为98nmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(a)中,所述二氧化锰胶体悬浮液的浓度为50-120μmol/L,优选的,所述二氧化锰胶体悬浮液的浓度为80-100μmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)中,所述抗坏血酸标准溶液的浓度范围为0.01-100μmol/L,优选的,所述抗坏血酸标准溶液的浓度范围为0.1-60μmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)中,所述混合过程的pH值为5.1-7.0。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)中,所述混合过程的温度为10℃-55℃;所述混合过程的时间不少于30分钟。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(c)中,所述标准曲线的横坐标为抗坏血酸标准溶液的浓度,纵坐标为(A0-A)/A0值,并对所述标准曲线进行线性拟合;所述A为抗坏血酸存在时二氧化锰胶体悬浮液的紫外吸光度,A0为抗坏血酸不存在时二氧化锰胶体悬浮液的紫外吸光度。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(f)中,将步骤(e)测得的吸光度代入步骤(c)的线性拟合方程,计算待测溶液的抗坏血酸含量。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测抗坏血酸溶液中含有的杂质对所述方法的影响可以忽略,所述杂质选自NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、葡萄糖、蔗糖、乳糖、BSA、ATP、氨基酸和Cys中的一种或两种以上的组合。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(a)、(c)和(e)中,所述紫外可见光测定的波长为370nm。
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