CN111019014A

CN111019014A - 一种那曲肝素钙的制备工艺

Info

Publication number: CN111019014A
Application number: CN201911158487.5A
Authority: CN
Inventors: 张立冬; 周裕林; 刘志; 孙迎基
Original assignee: Suzhou Erye Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Suzhou Erye Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-04-17

Abstract

本发明公开了一种那曲肝素钙的制备工艺，以精品肝素为起始原料，经过氧化、脱钠、降解、还原、紫外照射和钙置换等工序制备精品那曲肝素钙。通过优化参数，减少钙置换次数，有效控制分子量。提升技术含量、减少物料损失、提高产品收率、降低生产成本等优点。

Description

一种那曲肝素钙的制备工艺

技术领域

本发明涉及以精品肝素钠为原料，经氧化、降解、还原、紫外照射和钙置换等工序制备精品那曲肝素钙。

背景技术

肝素是糖胺聚糖的一种，是由两种糖醛酸和一种葡萄糖胺以及它们的衍生物组成的线性含有硫酸基的天然酸性粘多糖,主要存在于猪小肠粘膜和肝、肺脏等组织细胞中。肝素不仅能抗凝血、抗血栓，还能调节人体内的其他功能，如降血脂、抗炎、抗过敏、降血压和抗癌等。肝素具有延长血凝时间的作用，与其分子具有由六糖或者八糖重复单位组成的线形链状结构，在动物体内与蛋白质结合成复合体形式存在，故不显抗凝血作用。

肝素分子存在生物利用度较低，原因在于：经皮下注射后，许多肝素分子与细胞外基质结合而被灭活，余下的肝素分子进入血液；肝素入血后与多种血浆蛋白、内皮细胞和吞噬细胞上受体结合而被灭活。同时，在临床用药中存在一定的局限性和危险性，很大程度上限制了肝素的使用。

低分子肝素(LWMH)是一类以未分级肝素为起始原料经分级或降解而得到的具有较低分子量的低聚糖混合物中分子量较小的片段。其缩短活化凝血活酶时间(APTT)、生物利用率更高、血浆半衰期长、出血倾向小和口服易吸收等特点，LWMH产品正在逐步取代普通肝素。肝素钙在血液循环中缓慢扩散，不会减少局部细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，因此皮下注射时局部血肿现象减少和疼痛状况明显改善等优点，故目前肝素类产品更倾向于制成钙盐型。

在低分子肝素钙的制备过程中，一般工艺采用加入氯化钙经过长时间的搅拌来转钙，并且需要经过2次以上的转钙过程，且转钙过程操作繁琐，用时较长，容易导致转钙不完全。而且经常需要通过分级醇沉、超滤膜分离、分子筛和凝胶吸附分离的方法来控制小分子肝素钙的分子量，这些方法因为技术落后、产品损失量大、收率低、代价昂贵等缺点，限制其在工业化大生产及提高产能上的应用。

发明内容

本发明提供一种那曲肝素钙制备工艺，控制分子量的平均分布，并能提高产品收率，操作简便、能较大程度提高生产效率。

为实现本发明目的,本发明按照下述步骤进行：

1氧化

将精品肝素钠溶于适量体积的纯化水中，配制成8～10％水溶液，用20％NaOH调节溶液pH值为10～10.5；常温条件，用1～3％过氧化氢氧化氧化8～10h，分三次加入；氧化结束后，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；在37℃下，向滤液中缓慢加0.8～1倍体积的乙醇，搅拌30min，后静置4～8h；沉淀结束后，弃去上清液，将底部不溶性油状物用3～5％盐水配制成10％的溶液，调溶液pH＝6.5～7，使用0.22μm的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入0.8～1倍体积的乙醇，搅拌30min，后静置4～8h，弃去上清液，不溶物直接用于下一步的脱钠。

2脱钠、降解及还原

将步骤1所得沉淀物溶于适量体积的纯化水中，配制成8～10％水溶液，加入强酸型阳离子交换树脂，调节肝素钠水溶液的pH＝2.5～3，然后过滤，向滤液中加入质量百分浓度为5-10％的亚硝酸钠溶液，然后在室温下搅拌1～2h，用淀粉碘化钾试纸检测至无色；降解反应完成后，饱和氢氧化钙调节溶液值为7～8.5，搅拌20～30min，终止降解反应；分批加入浓度为5-10％硼氢化钠水溶液，搅拌反应10～15h后，用4mo1/L 的盐酸调节pH値为3.5～4.0，继续搅拌反应25～30min；在还原液中加入1～2倍体积的乙醇进行沉淀4～8h，收集沉淀物。

3紫外照射、钙置换及冻干

将步骤2所得沉淀物配制成5～8％水溶液，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；用254nm紫外灯照射1～3h，以消除残留在溶液中的亚硝基化合物和亚硝酸盐；紫外照射完成后，加入1～2倍体积的乙醇进行沉淀4～8h，收集沉淀物；沉淀结束后，弃去上清液，将底部不溶性油状物用3～5％氯化钙溶液配制成5～10％溶液，使用0.22μ m的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入1～2倍体积的乙醇，搅拌 30min，后静置4～8h；沉淀结束后，加入1倍物料的乙醇进行脱水，于 -45℃冻干。

本发明的优点：

(1)本发明，开始经双氧水氧化后，使得非硫酸化糖醛酸C2和C3 之间发生断裂，使得肝素钠的硫酸化程度提高，制得的肝素钠的分子量为4500～4600(2000～8000的部分为82％左右)，分子量分布较均匀。

(2)本发明用阳离子树脂进行脱钠，再经钙转换，转钙过程操作简单，用时较短，转钙完全，原料来源丰富，成本较其它方法低，产品质量稳定可控。

(3)本发明以亚硝酸降解法制备那曲肝素钙，该方法得到的那曲肝素钙收率高，达80％。

具体实施方式

实施例1

1氧化

称取精品肝素钠100g溶于1.25L纯化水中，配制成8％水溶液，用20％NaOH调节溶液pH值为10～10.5；常温条件，分三次加入100mL 的1％过氧化氢氧化氧化8h，1.5h加完；氧化结束后，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；在37℃下，向滤液中缓慢加1L的乙醇，搅拌30min，后静置4h；沉淀结束后，弃去上清液，向不溶性油状物加入2L的3％盐水，用4mol/L HCl调溶液pH＝6.5～7，使用0.22μ m的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入1.8L的乙醇，搅拌30min，后静置4h，弃去上清液，不溶物直接用于下一步的脱钠。

2脱钠、降解及还原

将步骤1所得沉淀物溶于1.25L纯化水，配制成8％水溶液，加入强酸型阳离子交换树脂，调节肝素钠水溶液的pH＝2.5，然后过滤，强酸性树脂用盐酸洗脱、浸泡，向滤液中缓慢加入10g质量百分浓度为5％亚硝酸钠溶液，然后在室温下搅拌1～2h，用淀粉碘化钾试纸检测至无色；降解反应完成后，饱和氢氧化钙调节溶液值为7～8.5，搅拌20～30min，终止降解反应；分批加入10g质量分数5％硼氢化钠水溶液(现配现用)，搅拌反应10～15h后，用4mo1/L的盐酸调节pH＝3.5～4.0，继续搅拌反应25～30min；在还原液中加入1.3L乙醇进行沉淀4h，收集沉淀物。

3紫外照射、钙置换及冻干

将步骤2所得沉淀物加2L纯化水配制成5％溶液，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；用254nm紫外灯照射1h，以消除残留在溶液中的亚硝基化合物和亚硝酸盐；紫外照射完成后，加入2L 乙醇进行沉淀4h，弃上层清液，收集沉淀物；将底部不溶性油状物用2L 质量分数为3％氯化钙溶液配制成5％溶液，使用0.22μm的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入2L乙醇，搅拌30min，后静置4h；沉淀结束后，加入100mL乙醇进行脱水，于-45℃冻干。

实施例2

1氧化

称取精品肝素钠100g溶于1.1L纯化水中，配制成9％水溶液，用20％NaOH调节溶液pH值为10～10.5；常温条件，分三次加入150mL 的1％过氧化氢氧化氧化9h，1.5h加完；氧化结束后，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；在37℃下，向滤液中缓慢加0.9L 的95％乙醇，搅拌30min，后静置6h；沉淀结束后，弃去上清液，向不溶性油状物加入1.25L的3％盐水，用4mol/L HCl调溶液pH＝6.5～ 7，使用0.22μm的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入1.35L的乙醇，搅拌30min，后静置6h，弃去上清液，不溶物直接用于下一步的脱钠。

2脱钠、降解及还原

将步骤1所得沉淀物溶于1.11L纯化水，配制成9％水溶液，加入强酸型阳离子交换树脂，调节肝素钠水溶液的pH＝2.8，然后过滤，强酸性树脂用盐酸洗脱、浸泡，向滤液中缓慢加入20g质量百分浓度为5％亚硝酸钠溶液，然后在室温下搅拌1～2h，用淀粉碘化钾试纸检测至无色；降解反应完成后，饱和氢氧化钙调节溶液值为7～8.5，搅拌20～30min，终止降解反应；分批加入20g质量分数5％硼氢化钠水溶液(现配现用)，搅拌反应10～15h后，用4mo1/L的盐酸调节pH＝3.5～4.0，继续搅拌反应25～30min；在还原液中加入1.65L乙醇进行沉淀6h，收集沉淀物。

3紫外照射、钙置换及冻干

将步骤2所得沉淀物加1.43L纯化水配制成7％溶液，用0.45μm 的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；用254nm紫外灯照射1.5h，以消除残留在溶液中的亚硝基化合物和亚硝酸盐；紫外照射完成后，加入2.15 L 95％乙醇进行沉淀6h，弃上层清液，收集沉淀物；将底部不溶性油状物用1.43L质量分数为3％氯化钙溶液配制成7％溶液，使用0.22μm 的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入2L乙醇，搅拌30min，后静置6h；沉淀结束后，加入100mL乙醇进行脱水，于-45℃冻干。

实施例3

1氧化

称取精品肝素钠100g溶于1L纯化水中，配制成10％水溶液，用 20％NaOH调节溶液pH值为10～10.5；常温条件，分三次加入200mL的 1％过氧化氢氧化氧化10h，1.5h加完；氧化结束后，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；在37℃下，向滤液中缓慢加1L的乙醇，搅拌30min，后静置8h；沉淀结束后，弃去上清液，向不溶性油状物加入1L的3％盐水，用4mol/L HCl调溶液pH＝6.5～7，使用0.22μ m的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入1L的乙醇，搅拌30min，后静置8h，弃去上清液，不溶物直接用于下一步的脱钠。

2脱钠、降解及还原

将步骤1所得沉淀物溶于1L纯化水，配制成10％水溶液，加入强酸型阳离子交换树脂，调节肝素钠水溶液的pH＝3.0，然后过滤，强酸性树脂用盐酸洗脱、浸泡，向滤液中缓慢加入40g质量百分浓度为5％亚硝酸钠溶液，然后在室温下搅拌1～2h，用淀粉碘化钾试纸检测至无色；降解反应完成后，饱和氢氧化钙调节溶液值为7～8.5，搅拌20～30min，终止降解反应；分批加入40g质量分数5％硼氢化钠水溶液(现配现用)，搅拌反应10～15h后，用4mo1/L的盐酸调节pH＝3.5～4.0，继续搅拌反应25～30min；在还原液中加入2L乙醇进行沉淀8h，收集沉淀物。

3紫外照射、钙置换及冻干

将步骤2所得沉淀物加1.25L纯化水配制成8％溶液，用0.45μ m滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；用254nm紫外灯照射2h，以消除残留在溶液中的亚硝基化合物和亚硝酸盐；紫外照射完成后，加入2.5 L乙醇进行沉淀8h，弃上层清液，收集沉淀物；将底部不溶性油状物用1.25L质量分数为3％氯化钙溶液配制成8％溶液，使用0.22μm 的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入2.5L乙醇，搅拌30min，后静置8h；沉淀结束后，加入100mL乙醇进行脱水，于-45℃冻干。

常规实验(与实施案例对比)

本实验与实施例1、2和3进行对比，同样称取100g精品肝素钠，经降解、还原、紫外照射、钙置换、氧化和两次钙置换和烘干等操作规程，制得那曲肝素钙，与本实施例不同之处在于：没有进行脱钠工序，并将双氧水氧化脱色工序放在转钙后面。经检验，重均分子量为4320(EP 标准为3600-5000)，其中分子量在2000～8000的部分为67.5％(EP标准2000～8000为75.0％～95％)，与标准不符。

Claims

1.本发明涉及以精品肝素钠为原料，经氧化、降解、还原、紫外照射和钙置换等工序制备精品那曲肝素钙，能较好控制分子量的平均分布，并能提高产品收率，操作简便、能较大程度提高生产效率。

2.本发明按照以下工艺制备那曲肝素钙：

a氧化：将精品肝素钠溶于适量体积的纯化水中，配制成8～10％水溶液，用20％NaOH调节溶液pH值为10～10.5；常温条件，用1～3％过氧化氢氧化氧化8～10h，分三次加入；氧化结束后，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；在37℃下，向滤液中缓慢加0.8～1倍体积的乙醇，搅拌30min，后静置4～8h；沉淀结束后，弃去上清液，将底部不溶性油状物用3～5％盐水配制成10％的溶液，调溶液pH＝6.5～7，使用0.22μm的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入0.8～1倍体积的乙醇，搅拌30min，后静置4～8h，弃去上清液，不溶物直接用于下一步的脱钠。

b脱钠、降解及还原：将步骤1所得沉淀物溶于适量体积的纯化水中，配制成8～10％水溶液，加入强酸型阳离子交换树脂，调节肝素钠水溶液的pH＝2.5～3，然后过滤，向滤液中加入质量百分浓度为5-10％的亚硝酸钠溶液，然后在室温下搅拌1～2h，用淀粉碘化钾试纸检测至无色；降解反应完成后，饱和氢氧化钙调节溶液值为7～8.5，搅拌20～30min，终止降解反应；分批加入浓度为5-10％硼氢化钠水溶液，搅拌反应10～15h后，用4mo1/L的盐酸调节pH値为3.5～4.0，继续搅拌反应25～30min；在还原液中加入1～2倍体积的乙醇进行沉淀4～8h，收集沉淀物。

c紫外照射、钙置换及冻干：将步骤2所得沉淀物配制成5～8％水溶液，用0.45μm的滤膜过滤，滤膜用少量纯化水洗涤；用254nm紫外灯照射1～3h，以消除残留在溶液中的亚硝基化合物和亚硝酸盐；紫外照射完成后，加入1～2倍体积的乙醇进行沉淀4～8h，收集沉淀物；沉淀结束后，弃去上清液，将底部不溶性油状物用3～5％氯化钙溶液配制成5～10％溶液，使用0.22μm的滤膜过滤，在37℃下，向滤液中缓慢加入1～2倍体积的乙醇，搅拌30min，后静置4～8h；

沉淀结束后，加入1倍物料的乙醇进行脱水，于-45℃冻干。