CN112029015A - 一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，包括如下步骤：S1称取80～120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％～20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；S2将粗品肝素钠溶加入浓度为2％的NaCl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，再加入碱性蛋白酶，于35～50℃下保温酶解3～6h，得到酶解液；S3将步骤S2所得酶解液经离心分离，得上清液和沉淀物，弃去不溶杂质。本发明使用超滤法也使得生产出的低分子量肝素中的残留蛋白质等大分子物质一同被截留掉，提高了低分子量肝素的安全性，能够低分子量肝素钠蛋白含量低、纯度高，而且收率高。

Description

一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺。
背景技术
肝素自上世纪80年代以来一直是预防和治疗血栓类药物的首选药物。低分子肝素是由普通肝素通过特异性的化学切割和纯化分离制成，由于其疗效确切，副作用小而且可预测等优点，逐步取代了传统肝素的市场地位。
现有的纯化方法主要分为以下几种：(1)将依诺肝素钠用活性炭脱色，经大孔树脂过滤，滤液冻干得到纯化依诺肝素钠，该方法脱色效果较好，但缺点是会有大量的产品吸附在活性炭和树脂中，收率仅能达到60％左右；(2)将依诺肝素钠用氢氧化钠调pH，用双氧水脱色，经氯化钠和乙醇洗涤后冻干，得到纯化依诺肝素钠，该方法需要用到氧化性极强的双氧水，在除去色素的同时容易导致其他副产物的产生，并且对环境污染较大，很难达到环评要求；(3)将依诺肝素钠依次通过疏水层析柱和阴离子交换树脂，经纳滤脱盐后，沉淀、干燥获得纯化的依诺肝素钠，该方法需过多次层析柱，产品损耗很大；(4)将依诺肝素钠依次通过过滤、微滤和超滤装置，冻干后得到纯化依诺肝素钠，该方法产品损失较小，但这种分级超滤的操作压力较大，不适宜在工业上应用；(5)将依诺肝素钠用氯化钠溶液和甲醇反复处理，最终获得澄清度达标的依诺肝素钠，该方法操作简便，容易在工业上实现，但其纯化效果较差，而且每次反复处理的次数难以准确确定，不利于生产标准的建立。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺。
本发明提出的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，包括如下步骤：
S1称取80～120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％～20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
S2将粗品肝素钠溶加入浓度为2％的NaCl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，再加入碱性蛋白酶，于35～50℃下保温酶解3～6h，得到酶解液；
S3将步骤S2所得酶解液经离心分离，得上清液和沉淀物，弃去不溶杂质；
S4将乙醇或甲醇加入到步骤S2中获得的上清液中，搅拌并静置后得到沉淀物；
S5将沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
S6将沉淀物用纯化水溶解成10wt～15wt％的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得肝素钠成品。
优选的，所述步骤S4调整温度至0～4℃，放置5～12h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于4～8倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积0.5％～1.2％的过氧化氢氧化8～12h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置6～15h，得到沉淀物。
优选的，所述步骤S3离心分离的转速为1000～3000r/min，离心时间为10min～60min。
优选的，所述步骤S4乙醇或甲醇与上清液的体积比为1-5:1，搅拌时间为1～3h，静置时间为3-10h。
优选的，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5％～1％。
优选的，所述步骤S5还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的pH到6.2～7.0，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀3～12小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
优选的，所述步骤S1的粗品肝素钠制备方法为：
S1原料处理：将猪肠用清水仔细清洗去除内外污物后，绞碎成肉糜状；
S2超声波酶解提取，在得到的肉糜状猪肠中加入4～6倍的水和20％～25％的NaOH，加入0.5％～1.5％的蛋白酶，在超声波振荡器中保温搅拌15～20min，过滤，得到酶解液，然后离子交换吸附，得到树脂；
S3肝素洗脱：将树脂过滤得洗脱液；
S4乙醇沉淀：将洗脱液过滤得沉淀物，干燥沉淀物即得粗品肝素钠。
本发明中，所述一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，使用超滤法也使得生产出的低分子量肝素中的残留蛋白质等大分子物质一同被截留掉，提高了低分子量肝素的安全性，能够低分子量肝素钠蛋白含量低、纯度高，而且收率高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，包括如下步骤：
S1称取80～120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％～20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
S2将粗品肝素钠溶加入浓度为2％的NaCl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，再加入碱性蛋白酶，于35～50℃下保温酶解3～6h，得到酶解液；
S3将步骤S2所得酶解液经离心分离，得上清液和沉淀物，弃去不溶杂质；
S4将乙醇或甲醇加入到步骤S2中获得的上清液中，搅拌并静置后得到沉淀物；
S5将沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
S6将沉淀物用纯化水溶解成10wt～15wt％的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得肝素钠成品。
本发明中，所述步骤S4调整温度至0～4℃，放置5～12h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于4～8倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积0.5％～1.2％的过氧化氢氧化8～12h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置6～15h，得到沉淀物。
本发明中，所述步骤S3离心分离的转速为1000～3000r/min，离心时间为10min～60min。
本发明中，所述步骤S4乙醇或甲醇与上清液的体积比为1-5:1，搅拌时间为1～3h，静置时间为3-10h。
本发明中，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5％～1％。
本发明中，所述步骤S5还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的pH到6.2～7.0，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀3～12小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
本发明中，所述步骤S1的粗品肝素钠制备方法为：
S1原料处理：将猪肠用清水仔细清洗去除内外污物后，绞碎成肉糜状；
S2超声波酶解提取，在得到的肉糜状猪肠中加入4～6倍的水和20％～25％的NaOH，加入0.5％～1.5％的蛋白酶，在超声波振荡器中保温搅拌15～20min，过滤，得到酶解液，然后离子交换吸附，得到树脂；
S3肝素洗脱：将树脂过滤得洗脱液；
S4乙醇沉淀：将洗脱液过滤得沉淀物，干燥沉淀物即得粗品肝素钠。
本发明：原料处理：将猪肠用清水仔细清洗去除内外污物后，绞碎成肉糜状；超声波酶解提取，在得到的肉糜状猪肠中加入4～6倍的水和20％～25％的NaOH，加入0.5％～1.5％的蛋白酶，在超声波振荡器中保温搅拌15～20min，过滤，得到酶解液，然后离子交换吸附，得到树脂；肝素洗脱：将树脂过滤得洗脱液；乙醇沉淀：将洗脱液过滤得沉淀物，干燥沉淀物即得粗品肝素钠，称取80～120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％～20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；将粗品肝素钠溶加入浓度为2％的NaCl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，再加入碱性蛋白酶，于35～50℃下保温酶解3～6h，得到酶解液；将上述所得酶解液经离心分离，得上清液和沉淀物，弃去不溶杂质；将乙醇或甲醇加入到步骤S2中获得的上清液中，搅拌并静置后得到沉淀物；将沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；将沉淀物用纯化水溶解成10wt～15wt％的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得肝素钠成品。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1称取80～120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％～20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
S2将粗品肝素钠溶加入浓度为2％的NaCl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，再加入碱性蛋白酶，于35～50℃下保温酶解3～6h，得到酶解液；
S3将步骤S2所得酶解液经离心分离，得上清液和沉淀物，弃去不溶杂质；
S4将乙醇或甲醇加入到步骤S2中获得的上清液中，搅拌并静置后得到沉淀物；
S5将沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
S6将沉淀物用纯化水溶解成10wt～15wt％的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得肝素钠成品。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，所述步骤S4调整温度至0～4℃，放置5～12h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于4～8倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积0.5％～1.2％的过氧化氢氧化8～12h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置6～15h，得到沉淀物。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，所述步骤S3离心分离的转速为1000～3000r/min，离心时间为10min～60min。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，所述步骤S4乙醇或甲醇与上清液的体积比为1-5:1，搅拌时间为1～3h，静置时间为3-10h。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5％～1％。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，所述步骤S5还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的pH到6.2～7.0，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀3～12小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺，其特征在于，所述步骤S1的粗品肝素钠制备方法为：
S1原料处理：将猪肠用清水仔细清洗去除内外污物后，绞碎成肉糜状；
S2超声波酶解提取，在得到的肉糜状猪肠中加入4～6倍的水和20％～25％的NaOH，加入0.5％～1.5％的蛋白酶，在超声波振荡器中保温搅拌15～20min，过滤，得到酶解液，然后离子交换吸附，得到树脂；
S3肝素洗脱：将树脂过滤得洗脱液；
S4乙醇沉淀：将洗脱液过滤得沉淀物，干燥沉淀物即得粗品肝素钠。
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