CN103173360B - 一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌。所述内生真菌为镰孢（Fusariumsp.）木麻黄根际真菌46，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.6310。将木麻黄根际真菌46接种于木麻黄水培苗，根据叶绿素的各项指标综合评判，进一步证实其对提高木麻黄叶绿素含量具有促进作用以及实际对木麻黄的叶绿素的增效作用，寻找到提高木麻黄叶绿素含量有益的功能内生真菌可应用于生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌。
背景技术
植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌[2]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌[3-4]、具有抗病虫害的生防菌[5-8]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。在促进光合作用方面的内生菌报道极少，仅有在水稻上发现一种具有光合作用能力的内生菌，它也被证明是豆荚Aeschynomene[9]茎瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一个株系。
木麻黄科植物是兼有Frankia菌、内生菌根菌和外生菌根菌的共生营养型植物，因此，关于木麻黄真菌学方面的研究方向目前较多涉及弗兰克氏菌、丛枝状菌根(简称AM菌根)、青枯菌、青枯假单胞杆菌等，虽然木麻黄人工接种菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是仅停滞于根瘤菌根菌的研究，木麻黄内生真菌方面的研究尚未见报道[10-11]。前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从提高植株叶绿素含量的因素去寻找内生真菌，提高其科学性和可靠性[12]。证实能提高植株叶绿素的内生菌方面尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌。
本发明提供的一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌，所述功能内生真菌为镰孢（Fusarium sp.）木麻黄根际真菌46，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 6310。
该菌的分离、纯化包括：
A、材料：将采集得到不同年份的根、枝条、鳞状叶小枝分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；
B、消毒：70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法[13-15]；
C、接种部位的选择：鳞状叶小枝：分取植株的上、中、下三个部分的鳞状叶小枝，每个鳞状叶小枝又分为枝尖部、枝中部和枝基部3个处理；枝条：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；
D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。
固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Fusarium sp.功能菌株；
其在平面培养基上，菌落为黑色，整个菌落***且褶皱，外缘形状不规则；背部为黑色。分生孢子梗细长，分枝不规则，在孢子座上单生；分生孢子(梗孢子)无色；分生孢子单胞，长圆形，单个着生；参照真菌鉴定手册将其鉴定为镰孢菌属（Fusarium sp.），保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6310。
上述的一种能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×106cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基,其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
上述的一种能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地浇根。
上述的一种能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌应用菌液的应用方法，是用9.0×105cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株木麻黄的根际。
上述的一种能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液5.0×105cfu/ml在水培苗栽植前将苗蘸根10min。
本发明涉及的菌株是从木麻黄植株中分离纯化得到的，目标菌株为镰孢（Fusarium sp.）木麻黄根际真菌46，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 6310。
将木麻黄根际真菌46接种于木麻黄水培苗，根据叶绿素的各项指标综合评判，进一步证实其对提高木麻黄叶绿素含量具有促进作用以及实际对木麻黄的叶绿素的增效作用，寻找到提高木麻黄叶绿素含量有益的功能内生真菌可应用于生产。
菌株46处理下，苗木叶绿素相对含量(SPAD值)为对照的1.31倍。表明其对于提高植株的叶绿素含量具有极显著效果。
具体实施方式
1、根际土壤浇施应用
试验材料为惠安一号水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建农林大学森林生态研究所田间试验地。
水培苗根系长齐后，将其移入黄心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分装于约500个直径22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等质量的3.36KG混合土壤，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入10~15滴甲醛(***)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。经过一个月的恢复性生长，在木麻黄根际施入菌株浓度为9.0×105cfu/ml的菌液100ml，重复3次，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。
2、水培繁殖中的应用（水培接菌）
取配制好的内生真菌应用菌液，制成5.0×105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根10min，可提高植苗成活率10%以上。对照为空白处理。
菌液的制备：将木麻黄根际真菌46（菌株46）接入液体培养基，培养基为改良马丁培养基，每L含蛋白胨 5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.5g，其它为无菌水，pH值6.4±0.2。经过24h的培养，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0×106cfu/ml至9.0×106cfu/ml备用。接种后30天后进行叶绿素指标的测定,检测方法和结果如下：
2.1菌株浇施后木麻叶绿素指标分析
应用便携式叶绿素含量测定仪(SPAD-502,Minolta, Tokyo,Japan)，测定叶中部的SPAD计数值代表叶绿素的相对含量。每个处理测定10株，每株选取整个植株中间部位，同一朝向(东南方向)的枝条，采取5根枝条并排压平的方式测量取平均值[16]。所有数据处理以及图表制作均采用Excel和SPSS软件处理。
3测定结果：方差分析及多重比较
叶绿素相对含量的方差分析表明，S(水培浸泡)接菌方式下，菌株46处理与对照处理之间的苗木叶绿素相对含量存在显著差异。与对照CK木麻黄苗木相比，菌株46号处理苗木的叶绿素相对含量有显著提高，增加了31.34%。
表 1 水培接菌方式菌株处理下叶绿素相对含量的多重比较分析
*在表中的同一列数值中，有不同小写字母者表示差异显著(P＜0.05)；不同大写字母者表示差异极显著(P＜0.01)。下同。
本发明发现一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌，将该株木麻黄内生真菌菌株采用蘸根或菌液浇施的方法接种于木麻黄幼苗。通过接种后植株的叶绿素含量测定，得出菌株的提高叶绿素含量能力较大程度高于对照，表明其对于提高植株的叶绿素含量具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能提高木麻黄叶绿素含量。
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Claims (2)
1.一株能提高木麻黄叶绿素含量的内生真菌，其特征在于：所述内生真菌为镰孢（Fusarium sp.）木麻黄根际真菌46，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 6310。
2.一种如权利要求1所述的内生真菌的应用菌液，其特征在于：所述应用菌液的制备方法，是将所述的镰孢（Fusarium sp.）木麻黄根际真菌46接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0×106-9.0×106cfu/ml，备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
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| 黄丹虹 等.麻黄内生真菌的分离及其生物活性初步研究.《厦门大学学报（自然科学版）》.2008,第47卷(第2期), * |
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