CN110934290A - 奇异果酵素及其用于增加抗醣化以及提升肠胃道免疫功能的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于植物提取物，尤其是关于奇异果酵素及其用于增加抗醣化以及提升肠胃道免疫功能的用途。本发明提供一种奇异果发酵物及其用于增加抗氧化活性、增加抗糖化活性、增加蛋白质分解酶活性、改善肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性的组合物的用途，能有效使肠胃道的正常机能上升，以维持肠胃道免疫功能的正常运行，亦可有助于推迟慢性疾病与老化的进展，以及增加肠胃道消化的功能，并达到健胃整肠、维持肠道正常机能的功效。其中该奇异果发酵物，是将白奇异果水萃取物以酵母菌、乳酸杆菌及醋酸杆菌进行三段式发酵所制得。
Description
技术领域
本发明是关于植物提取物，尤其是关于奇异果酵素及其用于增加抗醣化以及提升肠胃道免疫功能的用途。
背景技术
人体肠胃道的主要功能为分解食物及吸收营养成分，然而现代人生活压力大又因饮食习惯改变，导致许多人为功能性消化不良所苦，所谓功能性消化不良是指有上腹痛、上腹闷胀、食欲不振、恶心、呕吐感等，上腹部不适的症状，然而经检查后并未有器质性病变(如消化性溃疡、胃癌等)，且症状会持续或反复发作，目前仍然不具有效应用于治疗功能性消化不良的药物或方法，只能建议患者改善饮食习惯(例如避免暴饮暴食及少吃难消化的食物等)，以及维持适当运动与保持正常作息来改善。
另外，肠胃道也是人体重要的免疫器官，是抵抗病原体进入身体中的重要屏蔽，因此肠胃道的健康与一个体的健康与否具有密不可分的关系，而肠胃道的健康不仅是由肠胃道内的菌丛生态所影响，胃肠道细胞本身的抗氧化力也是一关键因素。研究显示当肠胃道中环境压力因子(例如病原体等)过量时会引起氧化应激反应(Oxidative stress)，并会造成肠胃道的完整性受到破坏、产生发炎、甚至菌丛改变等。而抗氧化力佳的肠胃道细胞彼此间的连结较紧密(Tight junction)，在第一线即可减少病源及毒素在肠细胞间移动，强壮的细胞也较不受发炎反应影响；因此，一旦肠胃道细胞的抗氧化力变差，免疫力会随的下降，肠道的消化和代谢功能也会受影响，严重甚至引发慢性发炎反应或改变肠道菌相，并导致许多其他的疾病。故，提升肠胃道的抗氧化力，也是维持肠胃道健康及保持其正常机能的关键要点。
糖化终产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是一群高度氧化的化合物，因此被认为是一种糖毒素(Glycotoxin)，研究显示糖化终产物会与细胞表面的接受器结合，而改变其结构与功能，并促使细胞的氧化压力与发炎反应增加，更与糖尿病、动脉硬化及肾脏慢性疾病等的形成关系密不可分。而除了人体正常代谢过程中会产生糖化终产物外，许多加工食品中也会含有糖化终产物，研究也已指出避免从食物摄取糖化终产物，能有助于推迟慢性疾病与老化的进展。
综上所述，因应现代人因生活及饮食***提高且对于保健概念提高，研发一种能有效改善肠胃道消化不良症状、增加抗氧化活性、增加抗糖化活性的有效成分组成的医药组合物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种奇异果发酵物，其是奇异果水萃取物经由酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、及醋酸杆菌(Acetobacter aceti)依序进行发酵而获得。
本发明的又一目的在提供一种如上所述的奇异果发酵物用于制备改善肠胃道不适症状的组合物的用途。
本发明的又一目的在提供一种如上所述的奇异果发酵物用于制备提升抗氧化与抗糖化活性的组合物的用途。
本发明的又一目的在提供一种如上所述的奇异果发酵物用于制备增加蛋白质分解酶活性、改善肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性的医药组合物的用途。
本发明的另一目的在提供一种奇异果发酵物的制造方法，包含：将一奇异果水萃取物经由如上项所述的酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌依序进行发酵而获得。
在本发明的一实施例中，其中该酵母菌是BCRC20271的菌株；该乳酸杆菌是寄存编号DSM 33108的菌株；该醋酸杆菌是BCRC11688的菌株。且该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)；该乳酸杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)、及该醋酸杆菌的添加量为3-10％(v/v)。其中该酵母菌阶段、该乳酸杆菌阶段与该醋酸杆菌阶段的培养时间比为1-2.5：1-3：3-10。
在本发明的又一实施例中，其中该改善肠胃道不适症状是提升蛋白质分解酶活性。
在本发明的另一实施例中，其中该提升抗氧化活性是增加超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性及/或增加总多酚含量。
同时，本发明用于制备增加抗氧化活性、增加抗糖化活性、增加蛋白质分解酶活性、改善肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性的医药组合物，亦可包含一有效量的奇异果发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是以粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状存在。
本发明的奇异果发酵物能有效的用于制备增加抗氧化活性、增加抗糖化活性、增加蛋白质分解酶活性、改善肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性的医药组合物，并能有效使肠胃道机能上升，以维持肠胃道免疫功能的正常运行，亦可有助于推迟慢性疾病与老化的进展，以及增加肠胃道消化的功能，并达到健胃整肠、维持肠道正常机能的功效。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是为本发明实施例的奇异果发酵物提升SOD蛋白质活性的柱形图；
图2是为本发明实施例的奇异果发酵物提升总多酚含量的柱形图；
图3是为本发明实施例的奇异果发酵物提升抗糖化活性的柱形图；
图4是为本发明实施例的奇异果发酵物提升蛋白质分解酶活性的照片；
图5是为本发明实施例的奇异果发酵物于改善人体的整体肠胃道不适症状的柱形图；***p<0.001；
图6是为本发明实施例的奇异果发酵物于改善人体的尼平不良指数的柱形图；***p<0.001。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
实施例1本发明的奇异果发酵物的制备方法
奇异果(Actinidia chinensis Planch.)为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)植物，中华猕猴桃、猕猴桃，阳桃，羊桃，藤梨或绳梨，原产于中国，生长于海拔400-2,000公尺的山区，茎呈伸长状，具有多数分枝，叶呈圆形或广椭圆形，花为单生或数枚丛生，初开时为白色，后则转变为淡黄色，果实为浆果，呈长圆形、椭圆形或圆形，具密生褐色毛茸，种子细小呈黑褐色。目前已知奇异果的茎具有清热、利尿、活血、消肿，抗癌等功效。
在本发明一实施例中，将奇异果彻底清洗，取洗净后的奇异果以1:5-15的固液比例与水混合，在50-100℃下萃取0.5-2.5小时，以获得奇异果水萃取物，该奇异果水萃取物冷却至室温供后续三段式发酵使用，首先殖入0.01-0.5％的酵母菌(Saccharomycescerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，台湾，编号为BCRC20271)于该奇异果水萃取物内进行发酵1-2.5天后，接着直接加入0.01-0.25％乳酸杆菌(Lactobacillus plantarumTCI028，寄存于生DSMZ-德国微生物保藏中心，编号为DSM 33108)发酵1-3天，再加入3-10％醋酸杆菌(Acetobacter aceti，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC11688)发酵3-10天；此三种菌的发酵依序为：酵母菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌，且无法前后对调，最后在不移除此三种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-10°、pH2-4、酒精<3％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液。接着，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400目网筛过滤，再添加1-3％柠檬酸及40-70％异麦芽寡糖调整规格后灭菌，即得到本发明的奇异果发酵物，其中藉由微生物发酵制成，使奇异果的效性物质大量释出。
实施例2本发明的奇异果发酵物的超氧化物歧化酶(SOD)活性提升
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应，并使其转化为氧气和过氧化氢的酵素，其广泛存在于各种动物、植物、及微生物中，是生物体内一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。本实施例中为了比较本发明的奇异果发酵物所含有的SOD活性是否较未发酵前高，以抑制邻苯三酚(Pyrogallol)自氧化反应的效率进行SOD活性的定量。首先，配置用于测定的A溶液与B溶液，其中A溶液为将1.2114g的三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)和37.2mg的乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)溶于62.4mL 0.1mole/L的盐酸溶液中，并待溶解后以纯水定量至100mL，B溶液则为将56.7mg的邻苯三酚(Pyrogallol)溶于少量10mmole/L的盐酸溶液中，并待溶解后以纯水定量至100mL。接着，取2.35mL的A溶液于离心管中，各加入1.8mL的纯水及各取0.2mL的本发明奇异果发酵物(实验组)及奇异果水萃取物(对照组)，各管震荡混合均匀后，加入0.15mL的B溶液，快速地轻轻摇晃均匀后倒入比色管中，再分别测定325nm波长下的起始时间及1分钟后的吸光值，并以加入0.2.mL纯水的组别为空白测定组，再以下列公式计算SOD的活性。
△A325：邻苯三酚自氧化速度
△A’325：样品抑制邻苯三酚自氧化速度
V：样品的体积
D：样品的稀释倍数
本发明的奇异果发酵物中SOD活性上升的结果如图1所示。奇异果经本发明的三段式发酵作用后，其中SOD活性为单纯的奇异果水萃取物的3.6倍之高，此结果显示本发明的奇异果发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升其中的SOD活性，该特定发酵步骤能提升奇异果的抗氧化能力，并可用于制备提高肠胃道的抗氧化能力的组合物，使肠胃道机能上升，并维持肠胃道免疫功能的正常运行。
实施例3本发明的奇异果发酵物的总多酚含量提升
多酚为一种抗氧化剂，先前研究指出多酚可以抑制神经退化性疾病及部分心血管疾病的发生。本实施例是为了比较本发明的奇异果发酵物中总多酚含量是否较奇异果奇异果水萃取物高，使用Folin-Ciocalteu比色法测定其中总多酚含量，该测定法是利用试剂中的钨钼酸定量总多酚含量，其自身被还原(由Mo6+变为Mo5+)后会生成蓝色化合物，而该蓝色化合物的深浅与总多酚含量呈正相关。首先，分别将本发明的奇异果发酵物(实验组)及奇异果水萃取物(对照组)以水稀释后取100mL到离心管中，接着加入500μL的Folin-Ciocalteu酚试剂混合并静置3分钟后，加入400μL的7.5％碳酸钠混匀静置30分钟后，取200μL反应溶液96孔板中，并测量750nm的吸亮度。其中以没食子酸(Gallic acid)作为标准品以制作标准曲线，将10g的没食子酸溶于水中，并配置标准0、20、40、60、80、及100μL/mL的没食子酸，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至10mL离心管中，并加入500μL的Folin-Ciocalteu酚试剂混合静置3分钟后，加入400μL的7.5％碳酸钠混匀静置30分钟后，取200μL反应溶液96孔板中，并测量750nm的吸亮度，以获得标准曲线，再经由标准曲线换算本发明的奇异果发酵物及奇异果水萃取物中总多酚含量。
本发明的奇异果发酵物中总多酚含量上升的结果如图2所示。奇异果经本发明的三段式发酵作用后，其中总多酚含量为单纯的奇异果水萃取物的5.8倍之高，此结果显示本发明的奇异果发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升其中的总多酚含量，该特定发酵步骤能提升奇异果的抗氧化能力，而可用于制备提高肠胃道的抗氧化能力的组合物，使肠胃道机能上升，并维持肠胃道免疫功能的正常运行。
实施例4本发明的奇异果发酵物的抗糖化活性(AGEs)提升
本实施例是为了比较本发明的奇异果发酵物中抗糖化活性是否较奇异果水萃取物高，以抑制D-果糖(D-fructose)使牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)产生糖化的效率，进行糖化活性的定量。首先，分别取0.25mL稀释为20％(v/v)的奇异果水萃取物(对照组)或本发明奇异果发酵物(实验组)，并加入0.25mL的含有0.06％的NaN3的60mg/mLBSA溶液(以200mM的磷酸钠缓冲液配置，pH7.4)中，并与1.5M的D-果糖(以200mM的磷酸钠缓冲液配置，pH7.4)溶液均匀混合，再取0.1mL的混合溶液于激发光360nm、放射光460nm下测定荧光值，以此为反应前的零点，并取0.45mL的混合溶液于50℃下培养24小时后，取出0.1mL测定荧光值，以此为反应的终点。并以等量的3mM的氨基胍(Aminoguanidine,AG)(以200mM的磷酸钠缓冲液配置)回溶溶剂至相等体积以作为正对照组，其中已知Aminoguanidine(AG)具有抑制糖化作用的功效。最后，以下列公式计算清除糖化终产物(AGEs)能力的效率，以代表其抗糖化作用的活性。
本发明的奇异果发酵物中抗糖化活性上升的结果如图3所示。奇异果经本发明的三段式发酵作用后，其清除糖化终产物的能力为单纯的奇异果水萃取物的1.4倍之高，此结果显示本发明的奇异果发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升其清除糖化终产物的能力，该特定发酵步骤能提升奇异果的抗糖化活性，而有助于推迟慢性疾病与老化的进展。
实施例5本发明的奇异果发酵物的蛋白质分解酶活性提升
本实施例是为了比较本发明的奇异果发酵物中蛋白质分解酶活性是否较奇异果水萃取物高，以脱脂牛奶培养基(Skim Milk Agar，购自HIMEDIA，印度)进行蛋白质分解酶的活性定量。此种培养基可用来测试待测物是否具有分解蛋白质的能力，若能分解蛋白质则会在待测物周围产生一透明圈。首先，配制Skim Milk Agar溶液(购买的培养基粉末中含有2.8％的脱脂奶粉、0.5％的酪蛋白酶水解物、0.25％酵母提取物、0.1％葡萄糖、及1.5％洋菜胶，以上皆为w/v)并于高温高压灭菌后降温至40-50℃，再倒于培养皿中制作成平板，接着分别将奇异果水萃取物及本发明的奇异果发酵物进行10倍稀释后，取相同浓度的两样品稀释液于不同Skim Milk Agar上，于37℃生长箱中培养24小时后，观察并记录每组样品所产生的透明圈大小。其中以水作为空白控制组。
本发明的奇异果发酵物中蛋白质分解酶活性上升的结果如图4所示。奇异果经本发明的三段式发酵作用后，其在脱脂牛奶培养基上所产生的透明圈大小为单纯的奇异果水萃取物的3.5倍之高，此结果显示本发明的奇异果发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升其中的蛋白质分解酶活性，以增加肠胃道消化的功能，避免消化不良所导致的不适症状。
实施例6本发明的奇异果发酵物改善人体肠胃道消化的功效
为证实本发明的奇异果发酵物于改善人体肠胃道消化的效果，首先募集7位具功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)的成人为受试者，于每日午餐后服用5-20mL本发明的奇异果发酵物，并分别于服用前、服用2周后、及服用8周后，进行尼平消化不良指数(Nepean Dyspepsia Index,NDI)的问卷填写(参见World J Gastroenterol.2009Jul 7；15(25):3173-7.)回馈并分析，其中尼平消化不良指数是由Talley等人所创立，该指数量表中共包含25个项目，并分为紧张及睡眠、日常生活干预、饮食、知识及自制力、及工作或学习共5个领域。该量表是测定消化***的健康相关生命质量(Health-related Quality ofLife,HRQL)的工具，其提供消化不良症状的量度标准和评估消化不良特异的HRQL。
本发明的奇异果发酵物于改善人体的整体肠胃道不适症状的结果如图5所示；于改善人体的尼平消化不良指数的结果则于图6所示。在服用本发明的奇异果发酵物4周后，可改善高达42％的整体肠胃道不适症状；而根据尼平不良指数可知，本发明的奇异果发酵物能改善高达49％的肠胃不适症状；且改善人数比率高达100％(结果未显示)，此些结果显示本发明的奇异果发酵物具有优异的改善整体肠胃道消化不良状况的功效。另外，在服用本发明的奇异果发酵物4周后，可提高肠道菌数多样性高达1.5倍，且改善人数比率高达60％(结果未显示)，已知肠道菌相多样性的提高能够降低许多疾病发生的风险，其中亦包含肠胃相关疾病。因此，由该些结果显示本发明的奇异果发酵物具有优异的改善肠胃道不适症状，以及增加肠胃道菌丛多样性的能力，能够有效地达到健胃整肠以及帮助消化的功效。
综上所述，本发明将奇异果以酵母菌、乳酸杆菌及醋酸杆菌进行三段式发酵所得的奇异果发酵物，能有效提升其中的SOD活性、提升其中的总多酚含量、提升其清除糖化终产物的能力、提升其中的蛋白质分解酶活性、改善整体肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性，且较奇异果水萃取物有更佳的效果，能更加有效的用于制备增加抗氧化活性、增加抗糖化活性、增加蛋白质分解酶活性、改善肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性的医药组合物，并能有效使肠胃道机能上升，以维持肠胃道免疫功能的正常运行，亦可有助于推迟慢性疾病与老化的进展，以及增加肠胃道消化的功能，并达到健胃整肠、维持肠道正常机能的功效。
菌种寄存相关信息：
本案涉及的乳酸杆菌，于2019年5月2日寄存于DSMZ-德国微生物保藏中心，寄存编号为DSM 33108，寄存地址为德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B。
本案涉及的酵母菌和醋酸杆菌为已有菌种，通过购买即可得到。
Claims (11)
1.一种奇异果发酵物，其是奇异果水萃取物经由酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、及醋酸杆菌(Acetobacter aceti)依序进行发酵而获得。
2.根据权利要求1所述的奇异果发酵物，其特征在于，所述酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)；所述乳酸杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)、及所述醋酸杆菌的添加量为3-10％(v/v)。
3.根据权利要求1所述的奇异果发酵物，其特征在于，所述酵母菌是BCRC20271的菌株；所述乳酸杆菌是寄存编号为DSM 33108的菌株；所述醋酸杆菌是BCRC11688的菌株。
4.一种根据权利要求1所述的奇异果发酵物用于制备改善肠胃道不适症状的组合物的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述改善肠胃道不适症状是提升蛋白质分解酶活性。
6.一种根据权利要求1所述的奇异果发酵物用于制备提升抗氧化与抗糖化活性的组合物的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述提升抗氧化活性是增加超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性及/或增加总多酚含量。
8.一种根据权利要求1所述的奇异果发酵物用于制备增加蛋白质分解酶活性、改善肠胃道消化不良状况、及增加肠胃道菌丛多样性的医药组合物的用途。
9.一种奇异果发酵物的制造方法，是包含：
将一奇异果水萃取物经由权利要求2项所述的酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌依序进行发酵而获得。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其特征在于，所述酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)；所述乳酸杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)、及所述醋酸杆菌的添加量为3-10％(v/v)。
11.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述酵母菌阶段、所述乳酸杆菌阶段与所述醋酸杆菌阶段的培养时间比为1-2.5：1-3：3-10。
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