CN114651983B

CN114651983B - 一种源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌、方法及应用

Info

Publication number: CN114651983B
Application number: CN202210180130.2A
Authority: CN
Inventors: 罗学刚; 杨小涵; 秦济昆; 操俊; 李月婵; 张同存
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114651983A

Abstract

本发明公开了一种源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌，所述菌株的名称为：GH1‑1，分类名称为：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏编号为：CGMCCNO.24236，保藏日期：2022年1月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明从中国传统虾酱中筛选出了一株凝结芽孢杆菌，此菌株具有较强的抗逆性及肠道存活能力，生长性能良好。同时又能够通过调节微生物群组成、宿主免疫和代谢，对肠道疾病具有治疗作用。

Description

一种源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌、方法及应用

技术领域

本发明属于微生物、发酵饮料技术领域，尤其是一种源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌、方法及应用。

背景技术

高尿酸血症是一种由嘌呤代谢紊乱引起的代谢异常综合征。在正常情况下，它可以通过尿液排出。一旦人体摄入更多含有嘌呤的物质或出现肾功能不全，血清中的尿酸水平可能会发生一定程度的变化，呈上升趋势。近年来，随着经济的快速发展和生活方式的改变，我国高尿酸血症的发病率显著增加，并且呈年轻化趋势。高尿酸血症不仅是痛风的关键危险因素，而且与肾脏疾病、高血压、糖尿病和心血管疾病密切相关。因此，高尿酸血症已成为一个日益严重的公共卫生问题。有效降低尿酸水平是降低痛风风险和预防并发症发生的关键。大多数患者需要长期甚至终生的降尿酸药物治疗。然而，长期使用降尿酸药物成本高昂，并有一定的副作用。因此，积极寻找安全、廉价、有效的药用和食用产品具有重要的临床和公共卫生意义。

益生菌食品是一种有利于人体健康的功能性食品，具有改善肠道微生态平衡、调节营养代谢、增强免疫效力等功效，具有巨大的商业利益和不断增长的市场份额。众多研究已显示，益生菌具有潜在的调节嘌呤及尿酸代谢作用。不过，益生菌的作用具有菌株差异性，从我国传统食物中筛选适于中国人群的具有自主知识产权的优良益生菌菌株，具有重要的学术意义与经济、社会价值。

蛋白质是人体组成的基本物质，约占人体总重量的18％。饮用蛋白质饮料是补充蛋白质的一种健康、便捷的方法。蛋白质饮料主要分为植物蛋白质饮料和动物蛋白质饮料两大类。相比植物蛋白质，动物蛋白质的氨基酸(特别是必需氨基酸)组成完整性更高、构成比例与人体情况更为接近、更加容易被人体吸收，同时动物蛋白质原料也往往富含更多的维生素B12、DHA、矿物质等人体重要的营养素，而凝集素、皂苷、植酸等抗营养素则比植物蛋白质原料少。因此，随着人们对健康的关注度提高，动物蛋白质饮料的需求与发展空间越来越大。然而，由于动物蛋白质饮料生产成本相对较高等原因，目前，市场上的蛋白质饮料依然以核桃仁、杏仁、花生等植物蛋白质类居多，动物蛋白质饮料基本上局限于乳类产品，亟待开发更多新型产品。

虾酱作为一些传统发酵食品，是我国沿海地区以及东亚、东南亚地区常用的调味料之一，但是在其他地域至今难以推广，应用人群比较受限，而且富含高盐，在健康方面并不理想。研究已经发现：在传统虾酱生产工艺中，虾酱中的主要菌群包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、片球菌属、酵母菌属等，虾酱制备过程中很少进行灭菌处理，因此，往往这些天然的共生微生得以存活。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌、方法及应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌，所述菌株的名称为：GH1-1，分类名称为：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏编号为：CGMCC NO.24236，保藏日期：2022年1月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，所述菌株具有较强的嘌呤代谢和黄嘌呤氧化酶XOD抑制能力。

进一步地，所述菌株具有较强的抗氧化能力。

进一步地，所述菌株来源于山东滨州地区传统虾酱中。

利用如上所述的凝结芽孢杆菌发酵获得的虾肉蛋白发酵饮料。

进一步地，所述饮料消除了虾肉嘌呤高，口感差的弊端，且具有强抗氧化活性；或者，所述饮料具有黄嘌呤氧化酶XOD抑制能力。

如上所述的虾肉蛋白发酵饮料的发酵方法，步骤如下：

⑴原料的加工：将新鲜的虾清洗干净后去壳，于65～75℃水浸泡30min，之后烘干过夜，粉碎，然后过100目筛，保存待用；

⑵脱脂：将步骤⑴获得的原料与无水乙醇混合，无水乙醇过量添加，在50～60℃下静置1h，并每隔20min搅拌一次，重复脱脂两次，烘干，去除无水乙醇；

⑶酶解：用木瓜蛋白酶进行酶解，然后煮沸灭酶，6000r/min离心10min去酶，取上清液；

⑷活性炭处理：向⑶中的酶解液添加活性炭脱苦脱涩脱臭，8000r/min离心10min，取上清液，再次8000r/min离心10min，取上清液；

⑸灭菌：将步骤⑷中的酶解液放置于62～65℃的水浴中，巴氏灭菌30min后冷却；

⑹复配：将步骤⑸中的酶解液中加入巴氏灭菌的新鲜纯柠檬汁进行复配；

⑺发酵：向步骤⑹中的复配液接入凝结芽孢杆菌GH1-1的菌种液进行发酵；

⑻调配：向步骤⑺中的发酵液中加入矫味剂进行调配即得虾肉蛋白发酵饮料。

进一步地，所述步骤⑵中原料与无水乙醇的混合质量比为1:6；

所述步骤⑶中的酶解条件为使用木瓜蛋白酶，在pH＝7.2、60℃下，按底物浓度为4％、酶用量为6000U/g，反应6～8h；

所述步骤⑷中活性炭添加量为15g/L，处理条件为50～60℃下处理30～40min；

所述步骤⑹中酶解液与新鲜纯柠檬汁的复配体积比为3:7；

所述步骤⑺中发酵条件为：以3％的接菌量，在37℃下摇床发酵12h；所述步骤⑺中菌种液的OD₆₀₀＝1-2；

所述步骤⑻中使用的矫味剂为甜菊糖苷，其添加终浓度为1g/L。

如上所述的凝结芽孢杆菌在动物蛋白发酵饮料中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明从中国传统虾酱中筛选出了一株凝结芽孢杆菌，此菌株具有较强的抗逆性及肠道存活能力，生长性能良好。同时又能够通过调节微生物群组成、宿主免疫和代谢，对肠道疾病具有治疗作用。

2、本发明研究的菌株GH1-1具有较强的抗氧化、嘌呤代谢及抑制黄嘌呤氧化酶的能力。

3、本发明的虾肉蛋白发酵饮料进行了较为***的优化，制备了一款蛋白质等营养成分丰富且更符合大众口味的虾蛋白饮料。

4、本发明饮料为动物蛋白发酵饮料，与植物蛋白发酵饮料相比，动物蛋白质的氨基酸(特别是必需氨基酸)组成完整性更高、构成比例与人体情况更为接近、更加容易被人体吸收。本发明饮料质量稳定、营养丰富、口感风味俱佳。

5、通过抗氧化实验发现，本发明饮料具有很高的DPPH清除率且发酵后的DPPH清除率显著提高，说明在发酵的过程中产生了更多的抗氧化物质。所以此活菌型饮料可作为一款抗氧化的新型功能性饮料使用。

通过黄嘌呤氧化酶(XOD)活性抑制实验发现，本发明饮料具有较高的XOD抑制能力且发酵后有明显提高。

本发明饮料中蛋白质含量丰富，且具有很强的DPPH清除率以及对黄嘌呤氧化酶(XOD)的抑制率，提示其具有较好的抗氧化作用。本研究为虾肉深加工开发提供了一种新的选择。

6、本发明发酵菌株是从山东滨州地区传统虾酱中分离纯化的芽孢杆菌，经镜检及16SrDNA序列分析，鉴定该菌株是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)GH1-1。本发明以传统虾酱为原料，从中筛选出能够较好地代谢虾肉的益生菌，然后通过***性的优化与分析，对适于现代化工艺生产的益生菌虾肉蛋白发酵饮料进行了研发探索。

7、本发明对传统虾酱中的益生菌进行分离，筛选出优势菌株用来发酵虾肉蛋白。然后对发酵条件进行条件优化，发明出质量稳定、营养丰富、口感风味俱佳的虾肉蛋白发酵饮料。

附图说明

图1为本发明中GH1-1的镜检结果图；

图2为本发明中GH1-1的进化树图；

图3为本发明中GH1-1的生长曲线图；

图4为本发明中GH1-1嘌呤代谢能力检测图；其中，a为标准品液相图，两个峰从左到右分别为次黄嘌呤和鸟嘌呤，总峰面积为2342221；b为GH1-1代谢后液相图，两个峰分别为黄嘌呤和次黄嘌呤，总峰面积为310238；

图5为本发明中饮料DPPH清除率测定结果图；

图6为本发明中饮料XOD抑制能力测定结果图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

较优地，所述菌株具有较强的嘌呤代谢和黄嘌呤氧化酶XOD抑制能力。

较优地，所述菌株具有较强的抗氧化能力。

较优地，所述菌株来源于山东滨州地区传统虾酱中。

较优地，所述饮料消除了虾肉嘌呤高，口感差的弊端，且具有强抗氧化活性；或者，所述饮料具有黄嘌呤氧化酶XOD抑制能力。

如上所述的虾肉蛋白发酵饮料的发酵方法，步骤如下：

较优地，所述步骤⑵中原料与无水乙醇的混合质量比为1:6；

所述步骤⑹中酶解液与新鲜纯柠檬汁的复配体积比为3:7；

如上所述的凝结芽孢杆菌在动物蛋白发酵饮料中的应用。

具体地，相关的制备及检测如下：

一种虾酱中益生菌筛选，及采用该菌种发酵虾肉蛋白饮料，可以按照如下制作步骤进行：

⑴在实验室条件下对中国传统虾酱中的菌株进行初步的分离、筛选、鉴定，并于MRS肉汤培养基中培养；

⑵通过溶钙圈，镜检等筛选出产酸能力强的杆菌，之后通过16S rDNA序列分析确定其为凝结芽孢杆菌；

⑶通过对嘌呤代谢能力的测定，确定该菌株嘌呤代谢能力强，可减少虾肉蛋白饮料对高尿酸血症患者的不适，同时可用作降尿酸相关产品开发；

⑷原料的加工：将新鲜的虾清洗干净后去壳，于65℃水浸泡30min，之后烘干过夜，粉碎，然后过100目筛，保存待用；

⑸脱脂：将原料与无水乙醇按1：6混合，在50℃下静置1h，并每隔20min搅拌一次，重复脱脂两次；

⑹酶解：用木瓜蛋白酶在pH＝7.2、60℃下，按底物浓度为4％、酶用量为6000U/g，反应6h进行酶解，然后煮沸灭酶，离心，取上清液；

⑺活性炭处理：向⑹中的酶解液添加活性炭15g/L，55℃下处理30min脱苦脱涩脱臭，离心，取上清液；

⑻灭菌：将⑺中的酶解液放置于65℃的水浴中，巴士灭菌30min后冷却；

⑼复配：将⑻中的酶解液中加入与巴氏灭菌的新鲜柠檬汁按3：7进行复配；

⑽发酵：向⑼中的复配液以3％的接菌量，在37℃下摇床发酵12h；

⑾调配：向⑽中的发酵液中加入1g/L的甜菊糖苷作为矫味剂进行调配即得虾肉蛋白发酵饮料。

⑿蛋白质含量的测定：利用伯乐蛋白定量试剂盒检测蛋白含量：避光条件下精密吸取4μL试剂以及200μL样品于孔板中，避光反应15min，利用酶标仪测定其OD₅₉₅值，与标准曲线进行对比。

⒀DPPH清除率的测定：分别取1mL蒸馏水、DPPH、样品于5mL离心管中，摇匀，避光静置30min，然后在517nm处测量其吸光值，按公式计算其清除率并与维生素C标准曲线对照。

⒁XOD抑制能力的测定：利用黄嘌呤氧化酶(XOD)测定试剂盒中的五个试剂分别加入蒸馏水、发酵前以及发酵后的样品于水浴37℃反应20min，测定其的OD₅₃₀，由于XOD活性与OD₅₃₀数值成正比，因此以OD₅₃₀数值代表其酶活，计算抑制率。

实施例1

样品来源：山东省滨州经济开发区某虾酱专卖店。

无菌条件下分别取1g发酵3、5、8、12个月的虾酱于1mL无菌水当中混匀，梯度稀释后分别取各梯度下的样品100μL均匀涂布至添加碳酸钙的MRS固体培养基平板上，37℃厌氧培养48h。依次挑选出现溶钙圈的白色圆形菌落于MRS固体平板上进行划线纯化，37℃厌氧箱中培养48h。取菌液与60％甘油按3:1的体积比混合均匀后储存于-80℃备用。

MRS固体培养基的配方及条件为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、吐温-80 1mL、柠檬酸二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、碳酸钙20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，pH6.5～6.7，115℃，灭菌15min。

实施例2

菌株形态学鉴定：

采用革兰氏染色法检测菌株的形态特征。结果如图1所示，本发明所筛选的菌株属于革兰氏阳性菌，形态为杆状，镜检可见芽孢。

实施例3

菌株的分子生物学鉴定：

通过PCR提取菌株16S rDNA并进行测序，拼接后得到DNA序列，用NCBI带的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分别搜索Genbank数据库中与序列同源性较高的基因序列，并使用MEGA-7软件的邻近法(Neighbor Joining)进行建树，将建好的树以Newick的格式保存。然后使用iTOL(https://itol.embl.de/)对基因序列进化树进行美化。结果显示其16S rDNA与凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans strain wy01相似度高达97.71％。如图2所示的进化树上显示，该菌株与另外五株菌凝结芽孢杆菌一起构成处于家族Ⅰ，再结合菌株的形态学特征和生理生化特征，将该菌株鉴定为凝结芽孢杆菌，并命名为Bacillus coagulans GH1-1，将其于中国普通微生物菌种保藏管理中心加以保藏，保藏编号为CGMCC24236。

实施例4

工艺参数的优化：

将活化培养后的菌悬液接种于蛋白液中，以发酵时间、接种量、甜菊糖苷添加量为影响因素，感官评价为指标，进行单因素实验。

发酵时间的确定：控制接种量为3％、甜菊糖苷添加量为1.25g/L，对复配饮料分别发酵8、10、12、14、16h，以感官评价为指标确定发酵时间。

接种量的确定：控制发酵时间为12h、甜菊糖苷添加量为1.25g/L，分别按接种量1％、2％、3％、4％、5％，对复配饮料进行发酵，以感官评价为指标确定接种量。

甜菊糖苷添加量的确定：控制接种量3％、发酵时间为12h，分别添加0.75、1、1.25、1.5、1.75g/L甜菊糖苷，对复配饮料进行发酵，以感官评价为指标确定甜菊糖苷添加量。

在单因素实验的基础上，以发酵时间、接种量、甜菊糖苷添加量为影响因素，取得分最高的两个水平，设计L₄(2³)正交试验，以感官评价为指标，优化出最佳的工艺参数。

由固定的10人对综合样品的组织状态、气味、口感等指标作出评分，去掉最低分和最高分后的平均值为该产品的最终得分。评分标准见表1。

表1感官评分标准表

结果显示当发酵时间为12h、接种量为3％、甜菊糖苷添加量为1g/L时口感最佳。

实施例5

生长曲线及菌株嘌呤代谢能力的检测：

为更好地确定合适的发酵时间，取40μL活化菌株于MRS液体培养基中，37℃培养24h，每隔2h以未接菌的培养基为对照，测取OD₆₀₀值，以绘制生长曲线。如图3所示，菌株于0～4h处于潜伏期，4h～16h处于对数生长期，16h时到达稳定期，最大OD₆₀₀在1.8左右。由于对数生长中后期的菌株具有生长速度快，各个体间均匀一致等优点，用做发酵的种子繁殖后代时可接近同步生长，使发酵代谢正常，周期缩短，因此种子培养时间为12h。

虾肉因嘌呤含量较高，在饮料等食品开发中，存在一定的促进高尿酸血症及痛风的潜在担忧。筛选一株能够代谢嘌呤的益生菌不仅能够消除饮料高嘌呤的风险，还能在肠道中发挥益生作用。由于该菌株分离自虾酱，具有较强的虾肉原料发酵及代谢转化能力，因此我们对其嘌呤代谢能力也进行了分析：分别将鸟嘌呤和次黄嘌呤的标准品以及经所筛选菌株代谢后的样品使用LC-LFD检测其代谢鸟嘌呤与此黄嘌呤的能力。结果如图4所示，对比图4(a)、(b)分析发现，B.coagulans GH1-1可很好地代谢鸟嘌呤和次黄嘌呤，并转化为黄嘌呤和次黄嘌呤且嘌呤总量减少了86.75％。因此，用该菌株发酵饮料可有效减少虾蛋白中存在嘌呤的可能，且该菌株进入肠道后，可能具有代谢肠道中嘌呤的潜力。

实施例6

一种虾肉蛋白发酵饮料的制备方法，包括如下方法：

⑴原料的加工：将新鲜的虾清洗干净后去壳，于65℃水浸泡30min，之后烘干过夜，粉碎，然后过100目筛，保存待用；

⑵脱脂：将原料与无水乙醇按质量比1:6混合，在50℃下静置1h，并每隔20min搅拌一次，重复脱脂两次，烘干，去除无水乙醇；

⑶酶解：用木瓜蛋白酶在pH＝7.2、60℃下，按底物浓度为4％、酶用量为6000U/g，反应6h进行酶解，然后煮沸灭酶，离心，取上清液；

⑷活性炭处理：向⑶中的酶解液添加活性炭15g/L，55℃下处理30min脱苦脱涩脱臭，8000r/min离心10min，取上清液，再次8000r/min离心10min，取上清液；

⑸灭菌：将⑷中的酶解液放置于65℃的水浴中，巴士灭菌30min后冷却；

⑹复配：将⑸中的酶解液中加入与巴氏灭菌的新鲜柠檬汁按3：7的体积比进行复配；

⑺发酵：向⑹中的复配液以3％的接菌量接入凝结芽孢杆菌GH1-1的菌种液，菌种液的OD₆₀₀＝1.5，在37℃下摇床发酵12h；

⑻调配：向⑺中的发酵液中加入1g/L的甜菊糖苷作为矫味剂进行调配即得虾肉蛋白发酵饮料。

本实施例制得的虾肉蛋白发酵饮料均匀性好，有柠檬特征香气。且本实施例制得的虾肉蛋白发酵饮料酸甜可口，风味怡人。

实施例7

虾肉蛋白发酵饮料蛋白质含量：

利用伯乐蛋白定量试剂盒检测蛋白含量：避光条件下精密吸取4μL试剂以及200μL样品于孔板中，避光反应15min，利用酶标仪测定其OD₅₉₅值，与标准曲线进行对比。经测定饮料中蛋白质的含量为2.44g/100mL，而目前市场除牛奶外的常见蛋白饮料蛋白质含量一般在0.5g/100mL左右。

实施例8

虾肉蛋白发酵饮料DPPH清除能力：

分别取1mL蒸馏水、DPPH、样品于5mL离心管中，摇匀，避光静置30min，然后在517nm处测量其吸光值，按公式(1)计算其清除率并与维生素C标准曲线对照：

DPPH清除率＝[1-(A_X-A_X0)/A₀]×100％ (1)

其中，A_X：1.0mL样品+1.0ml DPPH+1.0mL蒸馏水

A₀：1.0mL DPPH+2.0mL蒸馏水

A_X0：3.0mL无水乙醇。

结果如图5所示，未发酵的饮料DPPH清除率为66.61％，与维生素C标准曲线对比后，结果显示相当于859.13μmol/L的维生素C；发酵后的饮料DPPH清除率为80.03％，与维生素C标准曲线对比后，结果显示相当于914.47μmol/L的维生素C，可以看出发酵后，饮料的抗氧化能力可提高22.14％。与目前市场含柠檬饮料50％左右的DPPH清除率相比，该饮料提高了60％左右。

实施例9

虾肉蛋白发酵饮料XOD抑制能力：

利用黄嘌呤氧化酶(XOD)测定试剂盒中的五个试剂分别加入蒸馏水、发酵前以及发酵后的样品于水浴37℃反应20min，测定其的OD₅₃₀，由于XOD活性与OD₅₃₀数值成正比，因此以OD₅₃₀数值代表其酶活，计算抑制率。

结果如图6所示，经计算，未发酵的饮料可抑制53.11％的XOD活性，发酵后可达66.67％，抑制XOD活性的能力提高25.53％，此时样品的溶度为1.3％。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一种源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株的名称为：GH1-1，分类名称为：凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），保藏编号为：CGMCCNO.24236，保藏日期：2022年1月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株具有较强的嘌呤代谢和黄嘌呤氧化酶XOD抑制能力。

3.根据权利要求1所述的源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株具有较强的抗氧化能力。

4.根据权利要求1至3任一项所述的源于虾酱的具有降尿酸及抗氧化能力的凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株来源于山东滨州地区传统虾酱中。

5.利用如权利要求1至4任一项所述的凝结芽孢杆菌发酵获得的虾肉蛋白发酵饮料。

6.如权利要求5所述的虾肉蛋白发酵饮料的发酵方法，其特征在于：步骤如下：

⑴原料的加工：将虾清洗干净后去壳，于65~75℃水浸泡30 min，之后烘干过夜，粉碎，然后过100目筛，保存待用；

⑵脱脂：将步骤⑴获得的原料与无水乙醇混合，无水乙醇过量添加，在50~60℃下静置1h，并每隔20 min搅拌一次，重复脱脂两次，烘干，去除无水乙醇；

⑶酶解：用木瓜蛋白酶进行酶解，然后煮沸灭酶，6000 r/min离心10 min去酶，取上清液；

⑷活性炭处理：向⑶中的酶解液添加活性炭脱苦脱涩脱臭，8000 r/min离心10 min，取上清液，再次8000 r/min离心10 min，取上清液；

⑸灭菌：将步骤⑷中的酶解液放置于62~65℃的水浴中，巴氏灭菌30 min后冷却；

⑹复配：将步骤⑸中的酶解液中加入巴氏灭菌的纯柠檬汁进行复配；

7.根据权利要求6所述的虾肉蛋白发酵饮料的发酵方法，其特征在于：所述步骤⑵中原料与无水乙醇的混合质量比为1:6；

所述步骤⑶中的酶解条件为使用木瓜蛋白酶，在pH=7.2、60℃下，按底物浓度为4%、酶用量为6000 U/g，反应6~8 h；

所述步骤⑷中活性炭添加量为15 g/L，处理条件为50~60℃下处理30~40 min；

所述步骤⑹中酶解液与纯柠檬汁的复配体积比为3:7；

所述步骤⑺中发酵条件为：以3%的接菌量，在37℃下摇床发酵12 h；所述步骤⑺中菌种液的OD₆₀₀=1-2；

所述步骤⑻中使用的矫味剂为甜菊糖苷，其添加终浓度为1 g/L。

8.如权利要求1至4任一项所述的凝结芽孢杆菌在动物蛋白发酵饮料中的应用。