CN110923290A - 一种快速发现微生物发酵过程早期染菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于发现发酵液早期染菌的方法，其包括以下步骤：准备培养基接入待进行发酵的菌种开始发酵；发酵进行一段时间当发酵液达到给定OD值之前，取出发酵液样品；用血球计数板计算取出的发酵液样品的菌浓度，根据所述发酵液样品的菌浓度来确定所述发酵液样品的待浓缩倍数，所述浓缩倍数为足以将所述取样的发酵液样品的菌浓度浓缩至适合在显微镜下观察的给定的镜检菌浓度；按照确定的浓缩倍数，将发酵液样品浓缩至所述给定的镜检菌浓度；在显微镜下观察浓缩后的、给定面积的样品，确定有无杂菌的存在以及杂菌的数量；基于浓缩后、给定面积的样品中包含的杂菌的有无和数量来判定发酵液是否存在染菌现象。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵过程检测领域，具体涉及一种快速发现微生物发酵过程早期染菌的方法。
背景技术
微生物存在于自然界中的体型细小、结构简单、肉眼看不见，必须借助于特殊仪器放大后才能观察到的微小生物。微生物生长曲线包括四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。
迟缓期特点：生长速率常数为零、菌体粗大、RNA含量增加、代谢活力强、对不良环境的抵抗能力下降。
对数期特点：生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃、活细菌数和总细菌数大致接近、细胞的化学组成形态理化性质基本一致。
稳定期特点：活细菌数保持相对稳定、总细菌数达到最高水平、细胞代谢产物积累达到最高峰、是生产的收获期、芽孢杆菌开始形成芽孢。
衰亡期特点：细菌死亡速度大于新生成的速度、整个群体出现负增长、细胞开始畸形、细胞死亡出现自溶现象。
在发酵培养过程中，染菌前期(即杂菌还处于迟缓期，杂菌量小)很难通过直接镜检发现染菌，一般在对数期才能发现，这时杂菌增长速度最快，一般很难控制，对发酵生产影响很大，严重时需要倒罐，进而影响到发酵产率、提取率、得率、产品质量、三废处理等。
目前生产要做的是提高生产技术水平，强化过程管理，加强过程控制。即便如此，在现有的生产条件下要做到完全不染菌是不可能的。偶有染菌批次，如能尽早发现，及时采取措施，可将损失降到最低。
目前仍然存在检查杂菌操作繁琐、费时、昂贵的问题。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，申请人提出的技术方案是将样品浓缩后，镜检浓缩的样品，这样解决了染菌前期因为杂菌量小发现不了的问题，对微生物发酵企业具有重要的意义。具体地，本发明采用如下技术方案：
1.一种用于发现种子液或发酵液早期染菌的方法，其包括以下步骤：
提供种子液或发酵液取样样品，其中，发酵液取样样品由以下获得：准备培养基接入待进行发酵的菌种开始发酵，发酵进行一段时间当发酵液达到给定OD值之前，取出发酵液取样样品；
用血球计数板计算依上述获得的取样样品的菌浓度，根据所述取样样品的菌浓度来确定所述取样样品的待浓缩倍数，所述浓缩倍数为足以将所述取样样品浓缩至适合在显微镜下观察的给定的镜检菌浓度；
按照确定的浓缩倍数，将所述取样样品浓缩至所述给定的镜检菌浓度；
在显微镜下在给定面积内观察浓缩后样品，确定有无杂菌的存在以及杂菌的数量；
基于浓缩后样品在给定面积内所包含的杂菌的有无和数量来判定种子液或发酵液是否存在染菌现象。
2.根据项1所述的方法，其特征在于，所述给定OD值为0.8～2，优选1.0～1.8，进一步优选1.2～1.5。
3.根据项1所述的方法，其特征在于，所述镜检菌浓度的范围在1×1011(RBCs)/L至5×1011(RBCs)/L，优选1.5×1011(RBCs)/L至4.5×1011(RBCs)/L，进一步优选2×1011(RBCs)/L至4×1011(RBCs)/L。
4.根据项1所述的方法，其特征在于，所述浓缩方法为采用滤膜通过真空抽滤来浓缩。
5.根据项1所述的方法，其特征在于，在显微镜下观察浓缩后样品时，所需要观察的给定面积为至少3.39cm2。
6.根据项1至5的任一项所述的方法，其特征在于，发酵菌种为球菌、杆菌或真菌，进一步优选所述球菌为兽疫链球菌，所述杆菌选自乳酸杆菌或希式乳杆菌，所述真菌为酵母。
7.根据项6所述的方法，其特征在于，对于球菌，所述给定OD值为1.0～1.5，优选为1.3，所述镜检菌浓度为3.0×1011(RBCs)/L～4.0×1011(RBCs)/L，优选为3.5×1011(RBCs)/L。
8.根据项6所述的方法，其特征在于，对于杆菌，所述给定OD值为0.8～1.3，优选为1.2，所述镜检菌浓度为2.6×1011(RBCs)/L～3.6×1011(RBCs)/L，优选为3.1×1011(RBCs)/L。
9.根据项6所述的方法，其特征在于，对于真菌，所述给定OD值为1.2～1.8，优选为1.5，所述镜检菌浓度为2×1011(RBCs)/L～3×1011(RBCs)/L，优选为2.5×1011(RBCs)/L。
本发明取得了下述有益的技术效果：
本发明所提供的一种快速发现微生物发酵过程早期染菌的方法，该方法简便易操作，所需仪器价格低廉，为微生物发酵企业发现各级种子液及发酵液早期染菌提供了解决方法。用此方法能及时发现微生物发酵过程早期染菌现象，进而及时采取措施，降低了损失。
附图说明
图1为血球计数板的示意图。
具体实施方式
定义
对于“发酵”有广义和狭义的解释：从广义来说，发酵是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程；发酵有时也写作酦酵，其定义由使用场合的不同而不同；通常所说的发酵，多是指生物体对于有机物的某种分解过程；发酵是人类较早接触的一种生物化学反应，如今在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用；其也是生物工程的基本过程，即发酵工程；从狭义来说，酵母菌、乳酸菌等微生物的无氧呼吸被称作发酵。在本说明书的上下文中，“发酵”采用广义的解释。
在发酵过程中有不同的测定菌浓度的方法，例如使用血球计数板的直接计数法和借助于标准曲线的OD值法以及采用流式细胞仪的方法。血球计数板是一种常用的细胞计数工具，医学上常用来计数红细胞、白细胞等而得名，也常用于计算一些细菌、真菌等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。其用优质厚玻璃制成。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大方格面积为1.0mm×1.0mm＝1.0mm2；容积为1.0mm2×0.1mm＝0.1mm3。其中，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域(图1虚线小方格所在的中方格)，每个中方格用单线划分为16个小方格。四角的4个大方格是细胞计数区域，每个大方格用单线划分为16个中方格。根椐美国国家标准局(NBS)规定，大方格每边长度允许误差为±1％。计数池分为两种类型。一种是大方格内分为16个中方格，每一个中方格又分为25个小方格即16×25型(希利格式)；另一种是大方格内分为25个中方格，每个中格又分为16个小方格即25×16型(汤麦式)。但是不管计数池哪一种构造，它们都有一个共同的特点：即每个大方格都是由16×25＝25×16＝400个小方格组成。在本申请的上下文中，除非特别说明，所使用的血球计数板是指汤麦式血球计数板。参照图1进一步补充说明：图1粗线方框代表一个大方格；细线方框代表一个中方格，希利格式和汤麦式两种血球计数板中方格的面积不一样大；虚线方框代表一个小方格。
光密度(OD)是对许多溶液中的溶质进行定量的指标之一，通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值(特定波长下的光密度和溶质浓度呈线性相关)。在建立标准曲线的基础上，测量菌浓度也可以采用测量OD值的方法。使用OD值方法测量菌浓度时，经常采用600nm波长；这是由于600nm是大部分近似球形的细菌最大的吸收波长。如果是丝状真菌，其浓度是不可以用OD值表征的。酵母菌可以看成是近似的球形，所以可以采用600nm处的OD值建立标准曲线并进行菌浓度的测量。
在本说明书的上下文中，“真空抽滤”是指一般的利用抽出空气造成负压以加速滤水的方法；本发明中的“浓缩”步骤即通过真空抽滤实现。
在本说明书的上下文中，“菌”是对发酵过程所使用的微生物的泛指，包括属于原核生物的细菌、古细菌、以及属于真核生物的真菌；细菌有不同的分类方式，依形态的不同，可以分为球菌和杆菌；球菌(coccus)指的是一种呈球形或近似球形的细菌，球菌种类繁多，主要涉及革兰阳性的葡萄球菌属、链球菌属及革兰阴性的奈瑟菌属，包括单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌；杆菌一般呈正圆柱形，也有近卵圆形的，菌体大多平直，亦有稍弯曲的，菌体两端多钝圆，少数是平截状或尖突状，具体可分为单杆菌(大肠杆菌)、双杆菌(鼠疫杆菌)、链杆菌(猪痢疾杆菌)、球杆菌(多杀性巴氏杆菌)、棒状杆菌(白喉棒状杆菌)、分枝杆菌(结核分枝杆菌)、双歧杆菌(双歧乳杆菌)等；真菌是一种真核生物；最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母；现在已经发现了七万多种真菌，真菌与细菌、植物和动物最大的不同之处在于，真菌的细胞有含甲壳素(又叫几丁质、甲壳素、壳多糖)为主要成分的细胞壁(植物的细胞壁主要是由纤维素组成)；在本发明中，具体地，球菌为兽疫链球菌，杆菌选自乳酸杆菌或希式乳杆菌，真菌为酵母。
本发明在一个方面提供了一种用于发现发酵液早期染菌的方法，其包括以下步骤：准备培养基接入待进行发酵的菌种开始发酵；发酵进行一段时间当发酵液达到给定OD值之前，取出发酵液样品；用血球计数板计算取出的发酵液样品的菌浓度，根据所述发酵液样品的菌浓度来确定所述发酵液样品的待浓缩倍数，所述浓缩倍数为足以将所述取样的发酵液样品的菌浓度浓缩至适合在显微镜下观察的给定的镜检菌浓度；按照确定的浓缩倍数，将发酵液样品浓缩至所述给定的镜检菌浓度；在显微镜下观察浓缩后的、给定面积的样品，确定有无杂菌的存在以及杂菌数量；基于浓缩后给定面积的样品中包含的杂菌有无和数量来判定发酵液是否存在染菌现象。
具体地，在此所采用培养方式为批式发酵，因此，菌体的生长会经历经典的对数曲线(历经迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期)。本发明所采用的方法的目的是，争取在培养进入对数期之前及早地发现杂菌污染，以便于及时加以应对措施，因为一旦杂菌进入对数生长期，一般的抑制杂菌生长的手段将不再起作用(一般抑菌手段例如为:在保证培养菌体能存活的pH范围内调节pH，通过通气或者憋气等措施来抑制杂菌)。
具体地，在此监控菌体所处的生长阶段的手段，是测定OD值。在该OD值下进行取样，以确保取样时菌体还处于迟缓期，但是，由于此时菌浓度处于较低水平并不适合于检出杂菌，往往检测不准确(如果样品不经处理直接用取样环取样镜检，由于杂菌量不大，很难取出杂菌，往往检测不准确；而当用传统方法能发现杂菌时，杂菌的量已经较大，一般不好控制，对发酵影响很大；因此为了有效检出杂菌，本发明的方法要求达到“镜检浓度”)。
具体地，在本方法中先后进行两次镜检观测，第一次镜检是在取样之后，目的是确认当前精确的菌浓度，以便为浓缩步骤计算出浓缩倍数，第二次镜检是在浓缩之后，目的是检查有无杂菌污染。
具体地，在第一次镜检过程中，血球计数板的使用方法：
1.视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可计数为度。
2.取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3.将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上(不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高)，然后加盖盖玻片(勿产生气泡)。
4.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5.计数时计数区是由25个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格还需数中央1个中方格的菌数(即80个小格)。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌***于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。
6.对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，按公式计算出每mL(g)菌悬液所含细胞数量。
7.测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
具体地，使用血球计数板的观察结果计算实际菌浓度的方法：
菌体数(RBCs)/L＝N/5×25×10×106×200
N为：五个中方格的RBC总数
N/5为：5个中方格(粉红色区域)的平均RBC数量(然后推及至中央大方格中每一个中方格RBC的数量)
N/5×25为：中央大方格RBC总数(即：0.1mm3(ul)的RBC总数)
N/5×25×10为：1mm3(ul)RBC总数
N/5×25×10×106为：1L的RBC总数
200为：样品的稀释倍数
公式简化后：菌体数/L＝N×5×107×稀释倍数
在一个实施方式中，所述给定OD值为0.8～2，优选1.0～1.8，进一步优选1.2～1.5。经过第一次镜检观察，所述取出的发酵液样品的菌浓度需要进行浓缩以达到第二次镜检需要的“镜检菌浓度”。
在一个实施方式中，所述浓缩方法为采用滤膜通过真空抽滤来浓缩。
具体地，所述真空抽滤所采取的步骤为：将抽滤瓶装好，滤杯下放置滤膜，放好滤杯并固定好，然后连接抽滤瓶和真空泵；打开真空泵，在负压下过滤所述发酵液样品，达到所确定的浓缩倍数后停止过滤。
在一个实施方式中，在显微镜下观察浓缩后样品时，所需要观察的给定面积为至少3.39cm2。
具体地，在第二次镜检观测中，要求“至少观察给定面积”是为了尽量降低漏检的概率(尽管经过了浓缩，但是相对于培养菌，杂菌还是少数)。
在一个实施方式中，培养菌为球菌、杆菌或真菌，进一步优选所述球菌为兽疫链球菌，所述杆菌选自乳酸杆菌或希式乳杆菌，所述真菌为酵母。
在一个实施方式中，对于球菌，所述给定OD值为1.0～1.5，优选为1.3，所述镜检菌浓度为3×1011(RBCs)/L～4.0×1011(RBCs)/L，优选为3.5×1011(RBCs)/L。在一个实施方式中，对于杆菌，所述给定OD值为0.8～1.3，优选为1.2，所述镜检菌浓度为2.6×1011(RBCs)/L～3.6×1011(RBCs)/L，优选为3.1×1011(RBCs)/L。在一个实施方式中，对于真菌，所述给定OD值为1.2～1.8，优选为1.5，所述镜检菌浓度为2×1011(RBCs)/L～3×1011(RBCs)/L，优选为2.5×1011(RBCs)/L。
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例部分
一.在透明质酸(生产菌种：链球菌)发酵生产过程中所需球菌菌浓达到C((RBCs)/L)：3.0×1011～4.0×1011时，球菌生长进入对数期，从此开始球菌迅速繁殖，球菌菌浓达到3.0×1011～4.0×1011(RBCs)/L时还未发现染菌，后期再染菌的概率就非常低了。即使染菌，球菌本身对杂菌也能很好的抑制，对生产过程影响不大。
实施例1透明质酸发酵过程转种前种子液杂菌检测
(1)计算种子液菌浓
取批号为181203的种子液，用血球计数板(型号：XB.K.25、0.1mm、1/400mm2，厂家：上海市求精生化试剂仪器有限公司)按照说明计算所需检测样品的菌浓为：1.88×1010(RBCs)/L，按照上述方法重复进行两次计数结果依次：1.89×1010(RBCs)/L、1.90×1010(RBCs)/L，进一步确定样品的最低浓缩倍数为16～21倍，优选为20倍。
| 小方格位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中间 | 总菌数(N) |
| 第一次菌数(个) | 78 | 79 | 70 | 73 | 75 | 375 |
| 第二次菌数(个) | 80 | 74 | 77 | 76 | 70 | 377 |
| 第三次菌数(个) | 75 | 73 | 79 | 79 | 74 | 380 |
(2)浓缩
将抽滤瓶装好，滤杯下放0.22μm滤膜，放好滤杯，用夹子固定好，然后通过硅胶管连接真空泵。取种子液100mL至滤杯，打开真空泵，过滤压力维持在-0.05MPa～-0.06MPa，开始过滤；当滤杯内的浓缩种子液至5mL时，停止过滤。
(3)镜检
取滤杯内浓缩种子液镜检，镜检发现球菌量大且未发现有染菌现象。
实施例2透明质酸发酵过程中发酵培养3小时发酵液杂菌检测
(1)计算发酵液菌浓
取批号为181203培养时间为3小时的发酵液液，根据镜检经验，这时球菌还处于迟缓期球菌基本没有增殖，镜检时球菌的量很小，不适合直接用血球计数板来计算菌浓，因此根据转种量及发酵体积先进行第一步浓缩，浓缩倍数为：发酵体积/种子体积＝4000L/400L＝10。取已浓缩10倍的发酵液用血球计数板(型号：XB.K.25、0.1mm、1/400mm2，厂家：上海市求精生化试剂仪器有限公司)按照说明计数三次浓缩后的发酵液的菌浓依次为：1.78×1010(RBCs)/L、1.74×1010(RBCs)/L、1.77×1010(RBCs)/L进一步确定样品的最低浓缩倍数为17～23倍，优选为20倍。
| 小方格位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中间 | 总菌数(N) |
| 第一次计数(个) | 74 | 68 | 70 | 75 | 69 | 356 |
| 第二次计数(个) | 69 | 64 | 70 | 73 | 72 | 348 |
| 第三次计数(个) | 68 | 71 | 72 | 69 | 74 | 354 |
(2)浓缩
将抽滤瓶装好，滤杯下放0.22μm滤膜，放好滤杯，用夹子固定好，然后通过硅胶管连接真空泵。取已浓缩10倍的发酵液90mL至滤杯，打开真空泵，过滤压力维持在-0.05MPa～-0.06MPa，开始过滤；当滤杯内的浓缩种子液6mL时，停止过滤。
(3)镜检
取滤杯内浓缩种子液镜检，镜检发现球菌量大未发现染菌现象。
实施例3透明质酸发酵过程中发酵培养7小时发酵液杂菌检测
(1)计算发酵液菌浓
取批号为181203培养时间为7小时的发酵液，根据镜检经验，这时球菌处于对数期前期，球菌有了一定数量的增殖，同样菌体量较大不适用于血球计数板直接计数。可以对发酵液进行稀释，稀释倍数以稀释至适宜计数为宜，可自行调整。对批号为181203培养时间为7小时的发酵液稀释5倍，用血球计数板计数三次稀释后的发酵液的菌浓依次为：1.79×1010(RBCs)/L、1.81×1010(RBCs)/L、1.75×1010(RBCs)/L，进一步确定稀释后的发酵液需要浓缩17～22倍，优选为20倍。因计数时发酵液已经稀释5倍，所以批号为181203培养时间为7小时的发酵液需要浓缩4倍。
| 小方格位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中间 | 总菌数(N) |
| 第一次计数(个) | 77 | 70 | 68 | 73 | 70 | 358 |
| 第二次计数(个) | 69 | 75 | 74 | 73 | 70 | 361 |
| 第三次计数(个) | 68 | 74 | 75 | 67 | 66 | 350 |
(2)浓缩
将抽滤瓶装好，滤杯下放0.22μm滤膜，放好滤杯，用夹子固定好，然后通过硅胶管连接真空泵。取未稀释的发酵液60mL至滤杯，打开真空泵，过滤压力维持在-0.05MPa～-0.06MPa，开始过滤；当滤杯内的浓缩种子液为10mL时，停止过滤。
(3)镜检
取滤杯内浓缩种子液镜检，镜检发现球菌量大，未发现染菌现象。
实施例4透明质酸发酵过程中发酵培养3.5小时发酵液杂菌检测
(1)计算发酵液菌浓
取批号为190112培养时间为3.5小时的发酵液，根据镜检经验，这时球菌还处于迟缓期球菌基本没有增殖，镜检时球菌的量很小，不适合直接用血球计数板来计算菌浓，因此根据转种量及发酵体积先进行第一步浓缩，浓缩倍数为：发酵体积/种子体积＝4000L/400L＝10。取已浓缩10倍的发酵液用血球计数板(型号：XB.K.25、0.1mm、1/400mm2，厂家：上海市求精生化试剂仪器有限公司)按照说明计数三次浓缩后的发酵液的菌浓依次为：1.91×1010(RBCs)/L、1.92×1010(RBCs)/L、1.91×1010(RBCs)/L进一步确定样品的最低浓缩倍数为16～21倍，优选为20倍。因此还需将浓缩后的发酵液进一步浓缩20倍。
| 小方格位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中间 | 总菌数(N) |
| 第一次计数(个) | 75 | 78 | 76 | 80 | 74 | 383 |
| 第二次计数(个) | 76 | 79 | 82 | 69 | 78 | 384 |
| 第三次计数(个) | 77 | 80 | 80 | 69 | 75 | 381 |
(2)浓缩
将抽滤瓶装好，滤杯下放0.22μm滤膜，放好滤杯，用夹子固定好，然后通过硅胶管连接真空泵。取已浓缩10倍的发酵液90mL至滤杯，打开真空泵，过滤压力维持在-0.05MPa～-0.06MPa，开始过滤；当滤杯内的浓缩种子液6mL时，停止过滤。
(3)镜检
取滤杯内浓缩种子液镜检，镜检发现球菌量大，在一个视野能发现1～2个游动杆菌。
二.在γ-氨基丁酸(生产菌种：乳酸杆菌)发酵生产过程中所需杆菌菌浓达到C((RBCs)/L)：2.6×1011～3.6×1011时，杆菌生长进入对数期，从此开始杆菌迅速繁殖，杆菌菌浓达到2.6×1011～3.6×1011(RBCs)/L时还未发现染菌，后期再染菌的概率就非常低了。即使染菌，杆菌本身对杂菌也能很好地抑制，对生产过程影响不大。
实施例5γ-氨基丁酸二级种子罐培养4.5小时种子液杂菌检测
(1)计算种子液菌浓
取批号为190308培养时间为4.5小时的种子液，根据镜检经验，这时杆菌菌体量不大，无需稀释可直接用血球板计数。取种子液用血球计数板(型号：XB.K.25、0.1mm、1/400mm2，厂家：上海市求精生化试剂仪器有限公司)按照说明计数三次种子液的菌浓依次为：1.83×1010(RBCs)/L、1.88×1010(RBCs)/L、1.87×1010(RBCs)/L进一步确定样品的最低浓缩倍数为14～19倍，优选为15倍。
| 小方格位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中间 | 总菌数(N) |
| 第一次计数(个) | 70 | 68 | 75 | 77 | 75 | 365 |
| 第二次计数(个) | 77 | 74 | 69 | 75 | 80 | 375 |
| 第三次计数(个) | 70 | 75 | 78 | 78 | 72 | 373 |
(2)浓缩
将抽滤瓶装好，滤杯下放0.22μm滤膜，放好滤杯，用夹子固定好，然后通过硅胶管连接真空泵。取种子液100mL至滤杯，打开真空泵，过滤压力维持在-0.05MPa～-0.06MPa，开始过滤；当滤杯内的浓缩种子液体积为10mL时，停止过滤。
(3)镜检
取滤杯内浓缩种子液镜检，镜检发现杆菌量大、无杂菌。
三.在糙米提取液(生产菌种：酵母菌)发酵生产过程中所需酵母菌菌浓达到C((RBCs)/L)：2.0×1011～3.0×1011时，酵母菌进入稳定期，此时还未发现染菌，后期再染菌的概率就非常低了。即使染菌，酵母菌本身对杂菌也能很好地抑制，对生产过程影响不大。
实施例6糙米发酵培养8小时发酵液杂菌检测
(1)计算发酵液菌浓
取批号为181215培养时间为8小时的发酵液，根据镜检经验，此时酵母菌菌体量不大，无需稀释可直接用血球板计数。取发酵液用血球计数板(型号：XB.K.25、0.1mm、1/400mm2，厂家：上海市求精生化试剂仪器有限公司)按照说明计数三次发酵液的菌浓依次为：1.68×1010(RBCs)/L、1.72×1010(RBCs)/L、1.68×1010(RBCs)/L进一步确定样品的最低浓缩倍数为12～18倍，优选为15倍。
| 小方格位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中间 | 总菌数(N) |
| 第一次计数(个) | 65 | 68 | 65 | 70 | 67 | 335 |
| 第二次计数(个) | 64 | 68 | 70 | 69 | 72 | 343 |
| 第三次计数(个) | 70 | 64 | 66 | 71 | 65 | 336 |
(2)浓缩
将抽滤瓶装好，滤杯下放0.22μm滤膜，放好滤杯，用夹子固定好，然后通过硅胶管连接真空泵。取发酵液100mL至滤杯，打开真空泵，过滤压力维持在-0.05MPa～-0.06MPa，开始过滤；当滤杯内的浓缩发酵液20mL时，停止过滤。
(3)镜检
取滤杯内浓缩发酵液镜检，镜检发现酵母菌量大、无杂菌。
由上述实施例可知本发明的发现微生物发酵过程早期染菌的方法，对种子罐、发酵罐以及各种微生物都适用。
尽管对本发明的实施例用透明质酸的发酵过程进行了描述，但本发明并不局限于上述的透明质酸的发酵过程，而是所有微生物发酵过程，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
Claims (9)
1.一种用于发现种子液或发酵液早期染菌的方法，其包括以下步骤：
提供种子液或发酵液取样样品，其中，发酵液取样样品由以下获得：准备培养基接入待进行发酵的菌种开始发酵，发酵进行一段时间当发酵液达到给定OD值之前，取出发酵液取样样品；
用血球计数板计算依上述获得的取样样品的菌浓度，根据所述取样样品的菌浓度来确定所述取样样品的待浓缩倍数，所述浓缩倍数为足以将所述取样样品浓缩至适合在显微镜下观察的给定的镜检菌浓度；
按照确定的浓缩倍数，将所述取样样品浓缩至所述给定的镜检菌浓度；
在显微镜下在给定面积内观察浓缩后样品，确定有无杂菌的存在以及杂菌的数量；
基于浓缩后样品在给定面积内所包含的杂菌的有无和数量来判定种子液或发酵液是否存在染菌现象。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给定OD值为0.8～2，优选1.0～1.8，进一步优选1.2～1.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述镜检菌浓度的范围在1×1011(RBCs)/L至5×1011(RBCs)/L，优选1.5×1011(RBCs)/L至4.5×1011(RBCs)/L，进一步优选2×1011(RBCs)/L至4×1011(RBCs)/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩方法为采用滤膜通过真空抽滤来浓缩。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在显微镜下观察浓缩后样品时，所需要观察的给定面积为至少3.39cm2。
6.根据权利要求1至5的任一项所述的方法，其特征在于，发酵菌种为球菌、杆菌或真菌，进一步优选所述球菌为兽疫链球菌，所述杆菌选自乳酸杆菌或希式乳杆菌，所述真菌为酵母。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于球菌，所述给定OD值为1.0～1.5，优选为1.3，所述镜检菌浓度为3.0×1011(RBCs)/L～4.0×1011(RBCs)/L，优选为3.5×1011(RBCs)/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于杆菌，所述给定OD值为0.8～1.3，优选为1.2，所述镜检菌浓度为2.6×1011(RBCs)/L～3.6×1011(RBCs)/L，优选为3.1×1011(RBCs)/L。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于真菌，所述给定OD值为1.2～1.8，优选为1.5，所述镜检菌浓度为2×1011(RBCs)/L～3×1011(RBCs)/L，优选为2.5×1011(RBCs)/L。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201911227425.5A CN110923290A (zh) | 2019-12-04 | 2019-12-04 | 一种快速发现微生物发酵过程早期染菌的方法 |
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- 2019-12-04 CN CN201911227425.5A patent/CN110923290A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 桑亚新等: "现代食品微生物学实验技术", vol. 2, 华南理工大学出版社, pages: 230 - 232 * |
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