CN111718976A - 一种cip清洗残留水中耐热菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种CIP清洗残留水中耐热菌的检测方法，包括以下步骤：(1)量取残留水50～150mL，在无菌操作下用过滤装置对残留水过滤，将残留水中微生物收集到滤膜上；(2)富集培养：将滤膜用第一培养基在35～37℃下培养36～60h；(3)将步骤(2)中培养的菌落置于稀释剂中稀释，在85‑100℃下处理10‑20min；(4)分别量取热处理后的稀释液1mL为第一样品和第二样品，用第二培养基分别在32～38℃和50～60℃下各培养36～60h，计数；(5)革兰氏染色及镜检。本发明扩大了CIP清洗残留水的样品量，针对不同生长条件的耐热菌全面地、有效地检测出耐热菌的菌落数和形态，以此来判定CIP清洗效果及生产各环节设备的运行状况，在食品的生产中具有指导作用。
Description
技术领域
本发明涉及食品分析检测技术领域，具体为一种CIP清洗残留水中耐热菌的检测方法。
背景技术
CIP***(原位清洗***)是用水和不同的洗涤液，按照一定的程序，通过循环，无需拆装设备即可达到清洗的目的清洗***，被广泛应用于食品、饮料和制药行业。CIP清洗后微生物的检测也是食品加工的卫生关键控制点，如果清洗完毕之后CIP***冲洗水中残留微生物过高，会对后期食品加工带来微生物污染的隐患。CIP过程中大肠杆菌等是很容易杀死的，残留菌多为耐热菌，这些耐热菌产生芽孢，对热的抵抗力特别强，在食品加工后期可经受生产中巴氏杀菌过程而存活，甚至有一些耐热菌在UHT(超高温)灭菌和高压灭菌措施也难以将其完全杀灭。耐热菌留在食品中会对食品中营养物质的分解和利用，引起食品的腐败变质，甚至危害人体健康。因此，CIP***清洗残留水中耐热菌的检测对于食品生产加工卫生管控具有重大的指导意义，必须严格控制。常见的耐热菌有球拍型耐热芽孢、洛非不动杆菌、肠球菌等，一般的耐热菌最适合的生长温度在28～42℃，一些耐热菌中的嗜热菌需要在40度以上才能正常发育，其最适合生长温度一般在50～60度，因此，不同种类的耐热菌生长环境会不同。
中国专利文献CN106906304A公开了一种乳制品中耐热菌的检测方法，从乳制品中分离出耐热菌，然后菌落培养计数，选取出形态典型的菌落再划线分离培养；分别对培养出的耐热菌提取DNA，采用PCR(聚合酶链式反应)测序，检测出耐热菌种类。这种方法可以检测出耐热菌种类与数量，定性能力强，但这种基于PCR技术的分子生物学检测方法需要对不同形态的耐热菌逐一检测，检测成本高、耗时费力。中国专利文献CN108676841A公开了一种芽孢及耐热芽孢的检验方法，量取了第一样品和第二样品，分别对第一样品和第二样品进行不同温度热处理，然后稀释，在不同温度下平板培养，对样品中嗜热菌数和嗜中温菌数计数，通过计数结果判断UHT杀菌是否合格。该方法的优点是可以对不同生长条件的耐热菌进行检测，但因为取样时分别取了第一样品和第二样品，由于取样的差异，采用该方法检测CIP清洗后残留水的耐热菌可能导致检测结果的不准确，且CIP清洗后残留水的耐热菌数比较少，使用该方法可能无法有效地检测出残留水中的耐热菌数。因此，目前仍需要提出一种能够有效地、准确地对CIP清洗残留水中耐热菌进行检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服CIP清洗后残留水的耐热菌数比较少，无法准确地对不同生长条件的耐热菌进行检测的问题，提供了一种CIP清洗残留水中耐热菌的检测方法，该方法能准确的检测出残留水中耐热菌的菌落数和菌落形态，用于判断判定CIP清洗效果及生产各环节设备的运行状况，在食品的生产中具有指导作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种CIP清洗残留水中耐热菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)过滤富集：量取CIP清洗残留水50～150mL，在无菌操作下用过滤装置对残留水过滤，将残留水中微生物收集到滤膜上；
(2)富集培养：将步骤(1)所得收集有微生物的滤膜用第一培养基在35～37℃下培养36～60h；
(3)热处理：在无菌操作下将步骤(2)培养的菌落置于灭菌容器中，用稀释剂稀释得到稀释液，塞住出口，将容器放置于85～100℃下保温处理10～20min，冷却；
(4)培养及计数：分别取步骤(3)热处理后的稀释液作为第一样品和第二样品，第一样品用第二培养基在32～38℃下培养，第二样品用第二培养基在50～60℃下培养，各培养36～60h后对耐热菌计数，得到两种培养温度下残留水中耐热菌的菌落数；
(5)革兰氏染色及镜检，观察菌落形态。
在本发明中，通过扩大CIP清洗残留水的取样量，经过过滤将微生物收集在滤膜上，将带有微生物的滤膜用培养基培养，使残留水中的微生物富集，再经过热处理后留下耐热菌，分别在两种不同的温度下培养后计数及染色镜检，最终检测出两种培养温度下残留水中的菌落数和菌落形态，不同的培养温度可以检测出不同生长条件的耐热菌，以此可以判定设备清洗、消毒等工艺流程、执行参数是否满足生产需求，在食品的生产中具有指导作用。
作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中，所述第一培养基为PCA培养基(平板计数琼脂培养基)或BHI培养基(脑心浸液肉汤培养基)。
作为本发明的优选方案，所述PCA培养基制备过程为：称取市售平板计数琼脂颗粒23.5g加于蒸馏水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.0±0.2，定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，保温45～50℃左右，备用。
作为本发明的优选方案，所述BHI培养基制备过程：称取市售脑心浸出液肉汤颗粒38.5g加入蒸馏水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.0±0.2，定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，保温至45～50℃左右，备用。
作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中，滤膜用第一培养基培养时需要先将带有微生物的滤膜转移至培养基表面，此过程要求保证滤膜与培养基间接触不留气泡，过程中微生物随着滤膜一起转移到培养基表面。
作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中，所述稀释剂为无菌生理盐水，所述稀释剂体积为8～20mL。
作为本发明的优选方案，所述无菌生理盐水的制备方法为：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，备用。
作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中，所述冷却过程为：将热处理后的容器取出，置于流动水中冷却至室温，冷却时间为5～12min，此过程需要快速的冷却，快速冷却是为了防止残留的耐热芽孢在缓慢降温的过程中繁殖，造成结果偏高。
作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中所得热处理后地稀释液用稀释剂进行10～100倍稀释。在热处理过后，若微生物的数量级过大，则需要对热处理后的稀释液进行稀释，然后培养。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中取的稀释液的体积为0.5～3mL。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中，所述第二培养基为PCA培养基或BHI培养基，第一培养基和第二培养基各自独立的选取。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中，所述第一样品和第二样品各设置有两个平行样。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中，所述第一样品在32～38℃下培养，优选的培养温度为35～37℃。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中，所述第二样品在50～60℃下培养，优选的培养温度为54～56℃。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中，所述残留水中耐热菌的菌落数的计算方法为：平板计数后菌落数乘以步骤(3)中稀释剂的体积，再除以步骤(4)中取的稀释液的体积和步骤(1)中量取的残留水的体积，即得到每1mL残留水中耐热菌的菌落数。根据检测到的残留水中耐热菌数判断是否偏离正常水平值，以此判定生产过程各环节设备清洗、运行状况是否满足生产质量需求。
作为本发明的优选方案，所述革兰氏染色包括初染、媒染、脱色、复染四步操作。具体操作为：用接种环挑菌进行涂片，先用结晶紫初染，再用碘液媒染，乙醇脱色后用复红染液复染。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明提供的的检测方法扩大了CIP清洗残留水的取样量，通过过滤收集微生物后培养，在残留水中耐热菌数很少时，也可以准确的进行耐热菌的检测。
2、本发明提供的的检测方法在两种不同的温度下培养微生物，可以全面、有效地检测出残留水中不同生长条件的耐热菌的菌落数和形态。
3、本发明通过染色镜检可以明显的观察到耐热菌的形态，检测出不同形态的耐热菌可以判定CIP清洗效果及生产各环节设备的运行状况，对生产具有指导作用，保证产品的质量。
附图说明
图1为实施例1中36℃下培养的耐热菌镜检结果；
图2为实施例1中55℃下培养的耐热菌镜检结果；
图3为实施例2中36℃下培养的耐热菌镜检结果；
图4为实施例2中55℃下培养的耐热菌镜检结果。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
量取某设备CIP清洗后残留水50mL，将直径5cm、孔径0.45μm的无菌滤膜装入分体式漏斗，在无菌操作台上用漏斗真空抽滤将残留水过滤，残留水中的微生物被收集到滤膜上；将20mL保温在46℃左右的PCA培养基加入到100mm平皿中，PCA培养基凝固后，用无菌镊子将滤膜转移至培养基表面得到培养平板，平板倒置，在36℃下培养48h。
在无菌操作台上将上述培养的所有菌落挑入装有10mL无菌生理盐水的灭菌试管中，得到稀释液，用橡胶塞塞住瓶口后蜗旋2-3min混匀后，将试管放置于100℃的水浴中下保温处理10min，处理结束后取出试管，置于流动水中冷却至室温，冷却时间为8min；分别量取热处理后的稀释液1mL作为第一样品和第二样品，分别加入到两组100mm平皿中，每组设置有2个平行样，再量取1mL无菌生理盐水做空白对照，平皿中加入20mL保温在46℃左右的PCA培养基，摇动混合均匀；培养基凝固后得到培养平板，平板倒置，第一样品在36℃下培养，第二样品在55℃下培养，分别培养48h；培养结束后对第一样品和第二样品平板中的耐热菌计数，计算得到36℃和55℃培养下残留水中耐热菌的菌落数。计数后的平板用接种环挑取菌落，在载玻片上涂抹均匀，涂片在火焰上方快速多次通过，固定，滴加结晶紫染色液，染1min，及时水洗，滴加碘液，复染1min，及时水洗；滴加95％乙醇脱色，约15～30s，水洗，滴加沙皇复染液复染1min，水洗，待干，然后镜检。镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察染色情况和菌落形态。图1和图2展示了镜检观察到的菌落形态。
在36℃培养下残留水中耐热菌的菌落数为68CFU/mL，55℃下培养的残留水中耐热菌的菌落数为11CFU/mL，图1展示的是36℃下培养生长的耐热菌，染色后显示紫色，为革兰氏阳性(G+)菌，有G+杆菌、G+芽孢杆菌和G+胶囊状芽孢；图2展示的是55℃下培养生长的耐热菌，染色后显示紫色，为革兰氏阳性菌，有G+胶囊状芽孢。
实施例2
量取某设备CIP清洗后残留水100mL，将直径5cm、孔径0.45μm的无菌滤膜装入分体式漏斗，在无菌操作台上用漏斗真空抽滤将残留水过滤，残留水中的微生物被收集到滤膜上；将15mL保温在46℃左右的BHI培养基加入到100mm平皿中，BHI培养基凝固后，用无菌镊子将滤膜转移至培养基表面得到培养平板，平板倒置，在36℃下培养48h。
在无菌操作台上将上述培养的所有菌落挑入装有15mL无菌生理盐水的灭菌试管中，得到稀释液，用橡胶塞塞住瓶口后蜗旋2-3min混匀后，将试管放置于100℃的水浴中下保温处理10min，处理结束后取出试管，置于流动水中冷却至室温，冷却时间为10min；分别量取热处理后的稀释液1mL作为第一样品和第二样品，分别加入两组100mm平皿中，每组设置有2个平行样，再量取1mL无菌生理盐水做空白对照，平皿中加入15mL保温在46℃左右的BHI培养基，摇动混合均匀；培养基凝固后得到培养平板，平板倒置，第一样品在36℃下培养，第二样品在55℃下培养，分别培养48h；培养结束后对第一样品和第二样品平板中的耐热菌计数，计算得到36℃和55℃培养下残留水中耐热菌的菌落数。计数后的平板用接种环挑取菌落，在载玻片上涂抹均匀，涂片在火焰上方快速多次通过，固定，滴加结晶紫染色液，染1min，及时水洗，滴加碘液，复染1min，及时水洗；滴加95％乙醇脱色，约15～30s，水洗，滴加沙皇复染液复染1min，水洗，待干，然后镜检。镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察染色情况和菌落形态。图3和图4展示了镜检观察到的菌落形态。
样品在36℃下培养的残留水中耐热菌的菌落数为186CFU/mL，55℃下培养的残留水中耐热菌的菌落数为11CFU/mL，图3展示的是36℃下培养生长的耐热菌，除了有G+杆菌、G+芽孢杆菌和G+胶囊状芽孢，还有G+球拍状的芽孢；图4展示的是55℃下培养生长的耐热菌，染色后有显示为紫色的G+长丝状杆菌，又有显示为红色的革兰阴性(G-)长丝状杆菌，为阴阳共存的长杆菌，是嗜热菌。
实施例3
和实施例1检测方法相同，实施例3和实施例1的区别在于量取的CIP清洗残留水的体积分别为20mL、50mL、100mL、150mL和200mL，是为了测试不同取样量的残留水对菌落检测结果的影响。本实施例中量取了2种设备CIP清洗后残留水，分别为残留水1和残留水2，经过检测，检测结果见表1。
表1不同取样量对菌落检测结果的影响
由表1可知，残留水中耐热菌含量较少时，如残留水1，若取样20mL进行富集检测，特别是嗜热芽孢类，因量取的残留水体积偏少导致检测结果偏差较大，这样不利于结果的判断；残留水中耐热菌含量较多时，如残留水2，若抽取200mL以上进行富集检测，不利于热筛选后再接种时稀释度的选择，存在多次稀释导致误差或未选择到最佳稀释度时导致平板无法计数。所以，对CIP清洗残留水的耐热菌检测中量取的残留水体积为50～150mL。
实施例4
和实施例1检测方法相同，实施例4和实施例1的区别在于稀释液的热处理条件为分别为75℃/10min、85℃/10min、90℃/10min、100℃/10min、100℃/20min，是为了测试不同热处理条件对残留水中微生物检测结果的影响。选用同一残留水，检测中采用不同的处理温度和时间，检测结果见表2。
表2不同热处理条件对菌落检测结果的影响
由表2可知，稀释液在75℃下处理10min后，还有部份非耐热菌未灭失，稀释液在85℃、90℃或100℃下处理10min后均只有耐热菌存活，在100℃下处理20min后留下的微生物主要是变异性的芽孢，球拍状芽孢、胶囊状芽孢及长杆菌等，大多为嗜热芽孢。因此，热处理的温度为85～100℃，时间为10～20min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CIP清洗残留水中耐热菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)过滤富集：量取CIP清洗残留水50～150mL，在无菌操作下用过滤装置对残留水过滤，将残留水中微生物收集到滤膜上；
(2)富集培养：将步骤(1)所得收集有微生物的滤膜用第一培养基在35～37℃下培养36～60h；
(3)热处理：在无菌操作下将步骤(2)培养的菌落置于灭菌容器中，用稀释剂稀释得到稀释液，塞住出口，将容器放置于85～100℃下保温处理10～20min，冷却；
(4)培养及计数：分别取步骤(3)热处理后的稀释液作为第一样品和第二样品，第一样品用第二培养基在32～38℃下培养，第二样品用第二培养基在50～60℃下培养，各培养36～60h后对耐热菌计数，得到两种培养温度下残留水中耐热菌的菌落数；
(5)革兰氏染色及镜检，观察菌落形态。
2.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述第一培养基为PCA培养基或BHI培养基。
3.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述稀释剂为无菌生理盐水。
4.根据权利要求3所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述稀释剂的体积为8～20mL。
5.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述冷却的过程为：将热处理后的容器取出，置于流动水中冷却至室温，冷却时间为5～12min。
6.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中所得热处理后的稀释液用稀释剂进行10～100倍稀释。
7.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中取的稀释液的体积为0.5～3mL。
8.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述第二培养基为PCA培养基或BHI培养基。
9.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述第一样品和第二样品各设置有两个平行样。
10.根据权利要求1所述的耐热菌的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述残留水中耐热菌的菌落数的计算方法为：平板计数后菌落数乘以步骤(3)中稀释剂的体积，再除以步骤(4)中取的稀释液的体积和步骤(1)中量取的残留水的体积，即得到每1mL残留水中耐热菌的菌落数。
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