CN110452968B - 一种基于定量dna技术检测食品中维生素b12的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法;该方法通过制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液、微生物对食品中维生素B12的增值转换、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定、总DNA的提取与鉴定、DNA定量检测和计算检测结果六个步骤,实现维生素B12的含量检测,该方法可操作性强,反映的是基质中总的维生素B12含量,优于只能针对某种特定结构维生素B12的仪器分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及食品及乳品中维生素B12测定技术领域,具体涉及一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法。
背景技术
维生素B12是迄今为止人类发现最晚的一种B族维生素,对它的研究任然不够充分。维生素B12是一类化合物的统称,具有多种存在形式,如氰钴胺素(cyanocobalamin)、羟钴胺素(hydroxocobalamine)、甲钴胺素(mecobalamine)和5′-脱氧腺苷钴胺素(5′-deoxyadenosy lcobalamin)等,由于维生素B12自身具有多种分子构造和差异化的生物效价,使得食品中维生素B12的检测成为技术上的难点,尤其在微量存在水平的食品中,使用人工合成或天然维生素B12均存在巨大的检测误差,严重影响了行业的发展与技术进步。国内外现有的测定方法都存在明显的技术局限,如文献报道的分光光度法、高效液相色谱/质谱法、电泳法、离子交换法和等离子发射光谱法等化学分析法,以有限的各别结构含量代表维生素B12总量,缺乏令人信服的理论支持;微生物检测法理论相对完整,但最终测量的是微生物代谢物产生的溶液混浊度,属于典型的模拟信号,导致即便微弱的色差或杂质就能干扰结果,可操作性极差。因此,维生素B12至今缺少实用完善的测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法,旨在解决现有维生素B12检测方法可操作性低、重复性差的缺点的问题。
为实现上述目的本发明采用的技术方案是:
一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法,包括如下步骤:
(1)、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液;采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌,37 ℃厌氧培养,取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液;
(2)、微生物对食品中维生素B12的增值转换:将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基 ,取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中,然后放入恒温培养箱内进行定时增值;
(3)、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定:对培养后的试样溶液进行灭活操作;
(4)、总DNA的提取与鉴定:取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min,弃上清,采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA,并经超微量分光光度计检测浓度和纯度;
(5)、DNA定量检测:采用微滴式数字PCR进行结果分析,获得DNA拷贝数(y);
(6)、计算检测结果;样品维生素B12含量(x)与DNA拷贝数(y)成线性关系,根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。
进一步,所述步骤(2)中 ,莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25 μL 添加于121 ℃灭菌5min的试样溶液试管中,将试管放入恒温培养箱内,36 ℃ ± 1 ℃培养20 h。
进一步,所述步骤(3)中 ,灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃± 1 ℃环境中,保温30min以后急速冷却到4℃± 1 ℃。
进一步,所述步骤(5)中,采用微滴式数字PCR进行结果分析按如下步骤完成:
1)、配置反应体系:10 μL ddPCR Master Mix(2X),上下游引物各1.0 μL,2.5 μL探针,4.5μL dd H2O,1μL cDNA 模板,反应总体积为20 μL。并用去离子水代替模板作为阴性对照;
2)、生成微滴:将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge微滴反应卡中,加入70ul微滴生成油(DG Oil),时长2分钟后生成微滴;
3)、微滴封膜密封:转移微滴进入96孔板内,用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封,以防止油挥发,运行程序为:180℃,5s ;
4)、PCR反应 :程序:37 ℃保温10 min,95 ℃预变性10 min,然后94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,98 ℃延伸15 s,40个循环,最后98 ℃延伸5 min,降至室温;
5)、获取DNA拷贝数:将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好并放入微滴读取仪中,打开QuantaSoft软件,对96孔板中样品信息进行Setup,进行QX200实验,得到DNA拷贝数(y)。
本发明的有益效果是:
本发明在微生物方法基础上引入定量DNA技术,最大程度延伸了微生物方法对具有生物活性的维生素B12高度灵敏的优势,同时规避了微生物法可操作性低、重复性差的缺点,本发明可操作性强,反映的是基质中总的维生素B12含量,优于只能针对某种特定结构维生素B12的仪器分析方法。
附图说明
图1为本发明中由维生素B12和对应工作菌株DNA含量构成的散点图。
具体实施方式
以下结合优选实施方式对本发明作进一步说明:
一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法,包括如下步骤:
(1)、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液;采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌,37 ℃厌氧培养 ,取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液;相较于常规微生物检测维生素B12,由于无需采用现有微生物方法中的透光率检测原理,因此无需进行肉汤培养二次增值,可简化操作工艺。
(2)、微生物对食品中维生素B12的增值转换:将食品通过高温水解、沉淀和过滤等方法除去蛋白、脂肪和淀粉等干扰物质,保留的维生素B12作为特定营养因子用于莱士曼氏乳酸杆菌特异性增值培养,食品中维生素B12转化为特定营养因子后添加于测定用培养基;取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25 μL 添加于121 ℃灭菌5 min的试样溶液试管中,将试管放入恒温培养箱内进行增值,恒温培养控制36 ℃ ± 1 ℃培养20 h;该菌的增值量与食品中维生素B12成对应关系。
(3)、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定:对培养后的试样溶液试管进行灭活操作;具体的灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃环境中,保温30min以后急速冷却到4℃,或68℃± 1 ℃环境中保温30min以后急速冷却到4℃± 1 ℃;这样可使细菌停止生理活性避免后期数量波动,同时保持细胞线粒体中16S rDNA结构完整。
(4)、总DNA的提取与鉴定:取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min,弃上清,采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA,并经超微量分光光度计检测浓度和纯度;通过浓度和纯度可判定总DNA的提取是否成功。
(5)、DNA定量检测:采用微滴式数字PCR进行结果分析,获取DNA拷贝数(y);具体实现步骤是:
1)、配置反应体系:10 μL ddPCR Master Mix(2X),上下游引物各1.0 μL,2.5 μL探针,4.5μL dd H2O,1μL cDNA 模板,反应总体积为20 μL。并用去离子水代替模板作为阴性对照;其中leichmannii F:GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA,leichmannii R:ACTTAACCCAACATCTCACGACAC,leichmannii-probe:FAM-CTACGCATTCCACCGCTACACA-MGB;
2)、生成微滴:将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge微滴反应卡中,加入70ul微滴生成油(DG Oil),时长2分钟后生成微滴;
3)、微滴封膜密封:转移微滴进入96孔板内,用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封,以防止油挥发,运行程序为:180℃,5s;
4)、PCR反应:程序:37 ℃保温10 min,95 ℃预变性10 min,然后94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,98 ℃延伸15 s,40个循环,最后98 ℃延伸5 min,降至室温;
5)、获取DNA拷贝数:将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好并放入微滴读取仪中,打开QuantaSoft软件,对96孔板中样品信息进行Setup,进行QX200实验,得到DNA拷贝数(y)。
(5)、计算检测结果;样品维生素B12含量(x)与DNA拷贝数(y)成线性关系,根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。
其中,标准液获取的维生素B12含量和DNA拷贝数的回归方程可通过如下方式获得:
①、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液;采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌,37 ℃厌氧培养 ,取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液;
②、精密配制维生素B12标准品工作液, 加水稀释至含维生素B12质量浓度分别为0, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, 0.008, 0.016, 0.032, 0.064, 0.128 ng/m L的系列标准品溶液,取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25 μL 添加于121 ℃灭菌5 min的上述标准品溶液的试管中,然后将试管放入恒温培养箱内进行增值,恒温培养控制36 ℃ ± 1 ℃培养20 h;
③、吸取1ml标准品工作菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min,弃上清,采用细菌DNA提取试剂提取溶液的总DNA,并经超微量分光光度计检测浓度和纯度;
④、按照上述步骤5)的操作方法进行DNA定量检测,并获取DNA拷贝数(含量);维生素B12不同质量浓度下对应检测出的DNA拷贝数见下表;
VB12含量(x)ng/mL | 0 | 0.001 | 0.002 | 0.004 | 0.008 | 0.016 | 0.032 | 0.064 | 0.128 |
DNA含量(y)copies/mL | 86 | 170 | 298 | 674 | 1296 | 2660 | 5360 | 11360 | 23720 |
⑤、根据步骤④中表格实测数据,由Excel生成图谱及线性公式和对应R2;主要利用Excel生成x y(散点图),可获得回归方程为:y=184575x -160,线性相关系数R2 =0.999;具体详见说明书附图1。
本发明利用莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)对维生素B12的特异性和灵敏性,在测定用培养基中供给除维生素B12 以外的所有营养成分,这样微生物生长就会同待测食品中维生素B12 的含量相对应,通过PCR方法定量检测微生物含量,可计算出原食品中维生素B12 的含量。本发明采用DNA检测技术并利用标准量的维生素B12获取对用的DNA含量,进而获得回归方程及线性相关系数,其中线性相关系数R2可达到0.999,由此可见本发明方法具有更好的方法稳定性和准确性。
Claims (4)
1.一种基于定量dna技术检测食品中维生素B12的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液;采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌,37℃厌氧培养,取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液; (2)、微生物对食品中维生素B12的增值转换:将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基,取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中,然后放入恒温培养箱内进行定时增值; (3)、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定:对培养后的试样溶液进行灭活操作; (4)、总DNA的提取与鉴定:将试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min,弃上清,采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA,并经超微量分光光度计检测浓度和纯度; (5)、DNA定量检测:采用微滴式数字PCR进行结果分析,获得DNA拷贝数(y); (6)、计算检测结果;样品维生素B12含量(x)与DNA拷贝数(y)成线性关系,根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。
2.如权利要求1所述的一种基于定量dna技术检测食品中维生素B12的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25μL添加于121℃灭菌5min的试样溶液试管中,将试管放入恒温培养箱内,36℃±1℃培养20h。
3.如权利要求1所述的一种基于定量dna技术检测食品中维生素B12的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃± 1℃环境中,保温30min以后急速冷却到4℃±1℃。
4.如权利要求1所述的一种基于定量dna技术检测食品中维生素B12的方法,其特征在于,所述步骤(5)中,采用微滴式数字PCR进行结果分析按如下步骤完成: 1)、配置反应体系:10μLddPCRMasterMix(2X),上下游引物各1.0μL,2.5 μL探针,4.5μL ddH2O,1μLcDNA模板,反应总体积为20μL,并用去离子水代替模板作为阴性对照; 2)、生成微滴:将20ul样品反应体系加入到DG8cartridge微滴反应卡中,加入70ul微滴生成油(DG Oil),时长2分钟后生成微滴; 3)、微滴封膜密封:转移微滴进入96孔板内,用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封,以防止油挥发,运行程序为:180℃,5s; 4)、PCR反应 :程序:37 ℃保温10min,95℃预变性10min,然后94℃变性30s,55℃退火30s,98℃延伸15s,40个循环,最后98℃延伸5min,降至室温; 5)、获取DNA拷贝数:将完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好并放入微滴读取仪中,打开QuantaSoft软件,对96孔板中样品信息进行Setup,进行QX200实验,得到DNA拷贝数(y)。
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