CN112695045A - 一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用，本发明的第一目的在于提供一种鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12；第二目的在于提供所述的鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12的克隆方法；第三目的在于提供所述的鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12的应用。本发明将鳞翅目昆虫Hpx12基因被抑制表达后会抑制虫体的先天免疫反应，增加虫体对病菌的易感性，家蚕更容易感染BmNPV病毒，进而大大增加鳞翅目昆虫的死亡率。如果抑制鳞翅目昆虫Hpx12的表达，可实现害虫防治的目的。对于解决由于化学杀虫剂导致的生态恶化以及杀虫剂抗性等问题具有积极意义。

Description

一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用

技术领域

本发明涉及属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用。

背景技术

鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫，属有翅亚纲、全***类。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。有许多重要害虫，如桃小食心虫、苹果小卷叶蛾、棉铃虫、菜粉蝶、小菜蛾以及许多鳞翅目仓虫，如印度谷螟等。此外，著名的家蚕、柞蚕也属于本目昆虫。家蚕是一种以桑叶为食料的鳞翅目泌丝昆虫,蚕一生经过卵、幼虫、蛹、成虫个形态上和生理机能上完全不同的发育阶段。

昆虫是目前地球陆地上最繁盛的物种类群，是人类取之不尽的资源宝库。近年来，昆虫的免疫在其基础和应用研究方面受到极大关注，通过实验来研究与昆虫免疫相关的基因、信号等问题，对害虫防治、益虫防病、开发利用抗菌物、研究人类免疫机制等有着非常重要的现实意义。

Hpx12蛋白是一种多功能蛋白，具有过氧化物酶保守结构域，存在整合素结合位点，可与跨膜受体整合素结合，从而实现细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附作用，使血细胞发挥吞噬和包被作用。昆虫纲动物中有关Hpx12蛋白的研究较少，家蚕中对该蛋白的功能研究更少。

发明内容

本发明正是基于上述技术问题至少之一，本发明将鳞翅目昆虫Hpx12基因被抑制表达后会抑制虫体的先天免疫反应，增加虫体对病菌的易感性，家蚕更容易感染BmNPV病毒，进而大大增加鳞翅目昆虫的死亡率。如果抑制鳞翅目昆虫Hpx12基因的表达，可实现害虫防治的目的。对于解决由于化学杀虫剂导致的生态恶化以及杀虫剂抗性等问题具有积极意义。

有鉴于此，本发明提出了一种鳞翅目昆虫Hpx12基因， Hpx12基因为鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因，核苷酸序列为SEQ ID No.1。

根据本发明第二个方向，提出了Hpx12基因表达抑制剂和/或活性抑制剂作为害虫防治靶点在鳞翅目昆虫中应用。

根据本发明第三个方向，提出了Hpx12基因编码的蛋白，蛋白的氨基酸序列为SEQID No.2。

根据本发明第四个方向，提出了Hpx12基因编码的蛋白在鳞翅目昆虫体内抑制Hpx12基因表达的ds RNA，降低鳞翅目昆虫先天免疫反应增加虫体对病菌的易感性中的应用。

进一步的， ds RNA序列为SEQ ID No.3。

进一步的，扩增ds RNA的引物序列为SEQ ID No.6- SEQ ID No.7；

正向引物：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTCGCTAT

GAATCGTTTTC -3’；SEQ ID No. 6；

反向引物：5’- GTAATACGACTCACTATAGGGAGATTAGTTGCAGCTT

TAAAATCATTAA -3’；SEQ ID No. 7。

进一步的，鳞翅目昆虫为蚕。

根据本发明第四个方向，提出了克隆权Hpx12基因的方法，包括如下步骤：

（1）根据按蚊Hpx12基因（Gen Bank登录号(XP_311449)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到家蚕中同源基因Hpx12序列。利用此序列设计基因克隆引物：SEQ ID No.4 - SEQID No.5。

鳞翅目昆虫虫体cDNA合成：提取鳞翅目昆虫RNA，反转录得到第一链cDNA；

提取家蚕整蚕RNA，反转录得到第一链c DNA；

（2）Hpx12基因的PCR扩增：以鳞翅目昆虫虫体cDNA为模板，根据鳞翅目昆虫虫体的序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

根据Hpx12基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链c DNA作为模板，进行PCR扩增，选用TransStart高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×TransStart® FastPfu反应缓冲液10μL，10m Md NTP 1μL，2U的TransStart®FastPfu DNA Polymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，4分钟；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟；回收和纯化PCR产物。

纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与pEASY®-Blunt Cloning Kit载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL pEASY®-Blunt Cloning Kit混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

本发明首次提出了鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12在用于抑制鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12的表达，可降低鳞翅目昆虫先天免疫反应，进而增加虫体对病菌的易感性，导致鳞翅目昆虫死亡率大大增加的理论，对于解决由于化学杀虫剂导致的生态恶化以及杀虫剂抗性等问题具有积极意义。

进一步的，步骤（2）中的引物序列为SEQ ID No.4 - SEQ ID No.5；

正向引物：5’-CGGGATCCGTTCGCTATGAATCGTTTTC-3’； SEQ ID No.4；

反向引物：5’-GGGTTCGAATTAGTTGCAGCTTTAAAATCATTAA-3’；SEQ ID No.5。

通过以上技术方案，本发明提出了一种鳞翅目昆虫Hpx12基因、蛋白质以及应用，本发明利用同源克隆技术从家蚕中得到一个鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12，首次提出利用Hpx12基因表达的蛋白，抑制鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12的表达：降低鳞翅目昆虫先天免疫反应，进而增加虫体对病菌的易感性，进而大大增加鳞翅目昆虫的死亡率。

附图说明

图1为本发明实施例1中Hpx12基因的琼脂糖凝胶电泳结果；

其中，M为DNA Marker，1为目的片段。

图2为本发明实施例2中Hpx12基因 ds RNA注射到虫体内后，Hpx12基因在不同时间的表达量。

图3为本发明实施例3中将Hpx12基因 ds RNA注射到虫体内后，用BmNPV病毒处理的家蚕幼虫的结节数。

图4为本发明实施例4中将Hpx12基因ds RNA注射到虫体内后48 h抗菌肽相关基因的表达量。

图5为本发明实施例5中Hpx12基因 ds RNA注射到虫体内后48 h家蚕幼虫的死亡率。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1

Hpx12基因的克隆

（1）根据按蚊Hpx12基因（Gen Bank登录号(XP_311449)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到家蚕中同源基因Hpx12序列。

鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因Hpx12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

利用此序列设计基因克隆引物ID No.4 - SEQ ID No.5；

正向引物：5’-CGGGATCCGTTCGCTATGAATCGTTTTC-3’； SEQ ID No.4；

反向引物：5’-GGGTTCGAATTAGTTGCAGCTTTAAAATCATTAA-3’；SEQ ID No.5。

B、提取家蚕整蚕RNA，反转录得到第一链c DNA；

C、根据Hpx12基因序列，利用引物SEQ ID No.4 - SEQ ID No.5，以反转录得到的第一链c DNA作为模板，进行PCR扩增，选用TransStart高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng c DNA，5×TransStart® FastPfu反应缓冲液10μL，10m Md NTP 1μL，2U的TransStart® FastPfu DNA Polymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，4分钟；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟；回收和纯化PCR产物，结果如图1所示，如图1得到目的产物基因。

纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与pEASY®-Blunt Cloning Kit载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL pEASY®-Blunt Cloning Kit混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

实施例2

鳞翅目昆虫Hpx12基因ds RNA的合成和显微注射

根据实施例1克隆获得的鳞翅目昆虫Hpx12基因中全长序列SEQ ID NO.1，设计Hpx12基因的ds RNA，通过体外转录试剂合成ds RNA，ds RNA序列为SEQ ID No.3，具体地，通过RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7试剂盒，设计引物SEQ ID No.6-SEQ ID No.7；

正向引物：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTCGCTAT

GAATCGTTTTC -3’；SEQ ID No. 6；

反向引物：5’- GTAATACGACTCACTATAGGGAGATTAGTTGCAGCTT

TAAAATCATTAA -3’；SEQ ID No. 7。

选取5龄2天、大小均一、健康状况一致的家蚕幼虫，设置注射的dsGFP对照组和注射dsHpx12的实验组，注射前将家蚕幼虫在冰上麻醉，然后利用微量注射器将体外合成的dsRNA注射至家蚕幼虫的体腔，ds RNA的注射量为10 μg/头，每组注射60头，设置3个生物学重复，注射完毕后，将家蚕幼虫置于人工气候箱内饲养。

利用荧光定量PCR检测显微注射后6h、12h、24h及48h时Hpx12基因的表达，效果如图2，由图2可知，发现24h的干扰效果最佳，此时能够高效沉默家蚕Hpx12基因的表达，具有较好的靶基因沉默效果。

实施例3

鳞翅目昆虫Hpx12基因的ds RNA会抑制虫体的先天免疫反应，增加虫体对病菌的易感性

用75%乙醇对家蚕5龄3天幼虫进行表面消毒。用微量注射器将2ml BmNPV注入已经注射dsRNA的家蚕血腔内。在25℃下放置2h后，在放大50倍的显微镜下计数黑色素和暗结节。对照昆虫只注射2毫升BmNPV。每种试验方法分别重复三次如图3。由图3可知，注射dsRNA的处理组与对照组相比，其结节的数目明显减少，表明鳞翅目昆虫Hpx12基因的表达被抑制后，家蚕的免疫力大大降低。

利用荧光定量PCR检测显微注射ds RNA后24h时抗菌肽基因（Defension1基因和CeCA基因）的表达，注射ds RNA的处理组与对照组相比结果如图4，由图4可知，其抗菌肽基因的表达量明显降低，表明鳞翅目昆虫Hpx12基因的表达被抑制后，家蚕的免疫应答大大降低。

将家蚕Hpx12基因被下调表达的个体饲喂含有1.5×10⁴ BmNPV的新鲜桑叶上进行生测结果如图5，由图5可知Hpx12被下调表达的家蚕对BmNPV的敏感性显著增强，在48h时，其死亡率均显著地高于于对照。

可见，本发明基于分子层面降低害虫抗药性的设计方法，对于提高生物农药的药效，增强害虫防治效果具有重要意义。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。。

序列表

<110> 郑州轻工业大学

<120> 一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctctggt cattagtttt cttggcgttt ctgaagctga ccgccggtgt tcgctatgaa 60

tcgttttctg gtctaccagc gactgatgaa aagatccaat acttcatcaa acaggaaaat 120

ttagataact gcaccaatga cattcaactc ccctgcgacc ccaatgagag acgacgtcta 180

gatggctcat gcagtaattt cgactatccg tcaagaggaa cattccatac ccctgtgata 240

agattgttac ccgaagccga ctgtggagac gatgaaacct ctccatctgg agctccttta 300

aaatctgccc gggaagtcag gcagcgtatt ttacagacag ggaaggcatc agacctctca 360

tacacacaac tattggcgat tatctcgaca atcatatttg ctgaccttgg ttcaatccat 420

gattccgtga atttgttaac ggagaccaca aattgttgca cagcggaagg aaaatcaaat 480

tatatgtgca cgcctataga tattccccag gacgaccctg tccataggtt ctctggtata 540

cgctgcttga atctcactcg accgaaatcg ttccagactt atggctgcct tgctgactcg 600

aatgtagaca gaatcgaatt cacaacaccg ttatttgatt tatcgactat ctaccgatcg 660

accgaaccgg ctccagaata cagaacatac agtggcggat tactgatgac ccaagaggcc 720

gatggcacca tcttcccccc acaagaagga ccgcacagca ataaatgctt gcaaaacgac 780

gcgtctaatg gagaaacgaa atgttttggc cctgtttcaa catcgattct gccggtcaca 840

ttgttggtcg tgtggtggtg gagactacac aataagatcg ccaaagaact aaacgaaatc 900

aatcctcatt gggatgacga aacattgttc caaactgcaa gggacattaa catcgcaata 960

acaaaccaat ttgtttacta cgaattgctg ccaactctat tcggtgaaga attctgtttg 1020

aaaaatgagc tgattcactc tgaatctgga cacagagacc tttacgatga gtctatacct 1080

gctacttatc tcgaatacta cctcgctttg agatggttcc acttggtttc agagggtgat 1140

ttgaaacttt tcgacgagga tttcaagtac gtgggcaaaa aaatggtaac agacctctct 1200

ttacatactg atttcttgat gagagataag aacttggcaa aaatgacacg aggaacttac 1260

tatcaggctg gaggagataa tgatagagct gtagacccgg ccatttgtga taagggatta 1320

ggaataatgc aaaaagcatc cgaccttaca gcagcggatt tgaggaaaaa tcagcttttc 1380

aaaattccac cttacgtcga ctacgtaaaa ctgtgccatg atgtcgaaat taaaacatgg 1440

aaagacatgt tgaaattcat tgacatggat cgaattgaaa gtctgcaaga aatttacgaa 1500

acccctggtg acgtggaact cctggcagga atctggattg aaagacctat ggagggaggt 1560

tacgttcctc caaccgcagc ttgtatcata aacaaacaac tgtctctcac tatgaaagct 1620

gacagacatt ggtatgagag atcggacaga ccctacgctt tcaatgtcgc tcagctggcg 1680

gaaataagaa aagcaacagt tgcaggcttc ctttgcgaag ttggtgacgg tgtagagaga 1740

atccaacggg aggcacttaa aagagtgact gcttcgaatc cattggtcag ctgccaagaa 1800

atcccgagat ggaatctcgc tgcttggaaa gaatctaagt ga 1842

<210> 2

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Thr Ser Leu Val Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Ala Thr Gly Ser Pro Ser Gly Leu Pro Ala Thr Ala Gly Leu Ile

20 25 30

Gly Thr Pro Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ala Cys Thr Ala Ala Ile

35 40 45

Gly Leu Pro Cys Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ser Cys

50 55 60

Ser Ala Pro Ala Thr Pro Ser Ala Gly Thr Pro His Thr Pro Val Ile

65 70 75 80

Ala Leu Leu Pro Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Ser Pro Ser

85 90 95

Gly Ala Pro Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ile Leu Gly

100 105 110

Thr Gly Leu Ala Ser Ala Leu Ser Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Ile Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Ser Val Ala

130 135 140

Leu Leu Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala Gly Gly Leu Ser Ala

145 150 155 160

Thr Met Cys Thr Pro Ile Ala Ile Pro Gly Ala Ala Pro Val His Ala

165 170 175

Pro Ser Gly Ile Ala Cys Leu Ala Leu Thr Ala Pro Leu Ser Pro Gly

180 185 190

Thr Thr Gly Cys Leu Ala Ala Ser Ala Val Ala Ala Ile Gly Pro Thr

195 200 205

Thr Pro Leu Pro Ala Leu Ser Thr Ile Thr Ala Ser Thr Gly Pro Ala

210 215 220

Pro Gly Thr Ala Thr Thr Ser Gly Gly Leu Leu Met Thr Gly Gly Ala

225 230 235 240

Ala Gly Thr Ile Pro Pro Pro Gly Gly Gly Pro His Ser Ala Leu Cys

245 250 255

Leu Gly Ala Ala Ala Ser Ala Gly Gly Thr Leu Cys Pro Gly Pro Val

260 265 270

Ser Thr Ser Ile Leu Pro Val Thr Leu Leu Val Val Thr Thr Thr Ala

275 280 285

Leu His Ala Leu Ile Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ile Ala Pro His Thr

290 295 300

Ala Ala Gly Thr Leu Pro Gly Thr Ala Ala Ala Ile Ala Ile Ala Ile

305 310 315 320

Thr Ala Gly Pro Val Thr Thr Gly Leu Leu Pro Thr Leu Pro Gly Gly

325 330 335

Gly Pro Cys Leu Leu Ala Gly Leu Ile His Ser Gly Ser Gly His Ala

340 345 350

Ala Leu Thr Ala Gly Ser Ile Pro Ala Thr Thr Leu Gly Thr Thr Leu

355 360 365

Ala Leu Ala Thr Pro His Leu Val Ser Gly Gly Ala Leu Leu Leu Pro

370 375 380

Ala Gly Ala Pro Leu Thr Val Gly Leu Leu Met Val Thr Ala Leu Ser

385 390 395 400

Leu His Thr Ala Pro Leu Met Ala Ala Leu Ala Leu Ala Leu Met Thr

405 410 415

Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala

420 425 430

Pro Ala Ile Cys Ala Leu Gly Leu Gly Ile Met Gly Leu Ala Ser Ala

435 440 445

Leu Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Pro Leu Ile Pro Pro

450 455 460

Thr Val Ala Thr Val Leu Leu Cys His Ala Val Gly Ile Leu Thr Thr

465 470 475 480

Leu Ala Met Leu Leu Pro Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Ser Leu Gly

485 490 495

Gly Ile Thr Gly Thr Pro Gly Ala Val Gly Leu Leu Ala Gly Ile Thr

500 505 510

Ile Gly Ala Pro Met Gly Gly Gly Thr Val Pro Pro Thr Ala Ala Cys

515 520 525

Ile Ile Ala Leu Gly Leu Ser Leu Thr Met Leu Ala Ala Ala His Thr

530 535 540

Thr Gly Ala Ser Ala Ala Pro Thr Ala Pro Ala Val Ala Gly Leu Ala

545 550 555 560

Gly Ile Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Pro Leu Cys Gly Val Gly Ala

565 570 575

Gly Val Gly Ala Ala Gly Pro Leu Cys Gly Val Gly Ala Gly Val Gly

580 585 590

Ala Ile Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ala Val Thr Ala Ser Ala Pro Leu

595 600 605

Val Ser Cys Gly Gly Ile Pro Ala Thr Ala Leu Ala Ala Thr Leu Gly

610 615 620

Ser Leu

625

<210> 3

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaatacgac tcactatagg gagagttcgc tatgaatcgt tttctggtct accagcgact 60

gatgaaaaga tccaatactt catcaaacag gaaaatttag ataactgcac caatgacatt 120

caactcccct gcgaccccaa tgagagacga cgtctagatg gctcatgcag taatttcgac 180

tatccgtcaa gaggaacatt ccatacccct gtgataagat tgttacccga agccgactgt 240

ggagacgatg aaacctctcc atctggagct cctttaaaat ctgcccggga agtcaggcag 300

cgtattttac agacagggaa ggcatcagac ctctcataca cacaactatt ggcgattatc 360

tcgacaatca tatttgctga ccttggttca atccatgatt ccgtgaattt gttaacggag 420

accacaaatt gttgcacagc ggaaggaaaa tcaaattata tgtgcacgcc tatagatatt 480

ccccaggacg accctgtcca taggttctct ggtatacgct gcttgaatct cactcgaccg 540

aaatcgttcc agacttatgg ctgccttgct gactcgaatg tagacagaat cgaattcaca 600

acaccgttat ttgatttatc gactatctac cgatcgaccg aaccggctcc agaatacaga 660

acatacagtg gcggattact gatgacccaa gaggccgatg gcaccatctt ccccccacaa 720

gaaggaccgc acagcaataa atgcttgcaa aacgacgcgt ctaatggaga aacgaaatgt 780

tttggccctg tttcaacatc gattctgccg gtcacattgt tggtcgtgtg gtggtggaga 840

ctacacaata agatcgccaa agaactaaac gaaatcaatc ctcattggga tgacgaaaca 900

ttgttccaaa ctgcaaggga cattaacatc gcaataacaa accaatttgt ttactacgaa 960

ttgctgccaa ctctattcgg tgaagaattc tgtttgaaaa atgagctgat tcactctgaa 1020

tctggacaca gagaccttta cgatgagtct atacctgcta cttatctcga atactacctc 1080

gctttgagat ggttccactt ggtttcagag ggtgatttga aacttttcga cgaggatttc 1140

aagtacgtgg gcaaaaaaat ggtaacagac ctctctttac atactgattt cttgatgaga 1200

gataagaact tggcaaaaat gacacgagga acttactatc aggctggagg agataatgat 1260

agagctgtag acccggccat ttgtgataag ggattaggaa taatgcaaaa agcatccgac 1320

cttacagcag cggatttgag gaaaaatcag cttttcaaaa ttccacctta cgtcgactac 1380

gtaaaactgt gccatgatgt cgaaattaaa acatggaaag acatgttgaa attcattgac 1440

atggatcgaa ttgaaagtct gcaagaaatt tacgaaaccc ctggtgacgt ggaactcctg 1500

gcaggaatct ggattgaaag acctatggag ggaggttacg ttcctccaac cgcagcttgt 1560

atcataaaca aacaactgtc tctcactatg aaagctgaca gacattggta tgagagatcg 1620

gacagaccct acgctttcaa tgtcgctcag ctggcggaaa taagaaaagc aacagttgca 1680

ggcttccttt gcgaagttgg tgacggtgta gagagaatcc aacgggaggc acttaaaaga 1740

gtgactgctt cgaatccatt ggtcagctgc caagaaatcc cgagatggaa tctcgctgct 1800

tggaaagaat ctaagtgaga ttaatgattt taaagctgca actaatctcc ctatagtgag 1860

tcgtattac 1869

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccgt tcgctatgaa tcgttttc 28

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggttcgaat tagttgcagc tttaaaatca ttaa 34

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtaatacgac tcactatagg gagagttcgc tatgaatcgt tttc 44

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtaatacgac tcactatagg gagattagtt gcagctttaa aatcattaa 49

Claims (9)

1.一种鳞翅目昆虫Hpx12基因，其特征在于：所述Hpx12基因为所述鳞翅目昆虫先天免疫反应调控基因，核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述的Hpx12基因表达抑制剂和/或活性抑制剂作为害虫防治靶点在鳞翅目昆虫中应用。

3.权利要求1所述的Hpx12基因编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列为SEQID No.2。

4.权利要求3所述的Hpx12基因编码的蛋白在鳞翅目昆虫体内抑制所述Hpx12基因表达的ds RNA，降低鳞翅目昆虫先天免疫反应增加虫体对病菌的易感性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：ds RNA序列为SEQ ID No.3。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：扩增ds RNA的引物序列为SEQ ID No.6-SEQ ID No.7；

正向引物：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTCGCTAT

GAATCGTTTTC -3’；SEQ ID No. 6；

反向引物：5’- GTAATACGACTCACTATAGGGAGATTAGTTGCAGCTT

TAAAATCATTAA -3’；SEQ ID No. 7。

7.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于：所述鳞翅目昆虫为蚕。

8.克隆权利要求1所述的Hpx12基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）鳞翅目昆虫虫体cDNA合成：提取鳞翅目昆虫RNA，反转录得到第一链cDNA；

（2）Hpx12基因的PCR扩增：以鳞翅目昆虫虫体cDNA为模板，根据鳞翅目昆虫虫体的序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（2）中的引物序列为SEQ ID No.4 -SEQ ID No.5；

正向引物：5’-CGGGATCCGTTCGCTATGAATCGTTTTC-3’； SEQ ID No.4；

反向引物：5’-GGGTTCGAATTAGTTGCAGCTTTAAAATCATTAA-3’；SEQ ID No.5。

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