CN103088031A - 一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用。本发明的昆虫翅盘异常发育基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO：1，以其为模板合成的dsRNA能够用于致死害虫。本发明通过人工合成斜纹夜蛾AWD基因片段的dsRNA沉默AWD基因，使蛹期斜纹夜蛾致死或使其成虫的翅发育畸形。将斜纹夜蛾AWD基因极高的特异性作为害虫控制的靶标防治害虫，对环境生态安全和食品安全没有任何影响，同时，有效避免产生严重的抗性问题。本发明为以该基因序列为靶标的新型生物杀虫剂的研发提供分子生物学技术，有利于鳞翅目食叶性害虫综合治理体系的建立。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害虫的应用。
背景技术
害虫危害极大地制约了我国农作物产量和质量的提高，目前控制害虫的主要手段是施用化学杀虫剂，但是大量施用化学杀虫剂会导致一系列问题，诸如：1）害虫抗药性增强，防治成本提高；2）农药残留引起一系列环境污染和食品安全问题；3）破坏生态平衡，对非靶标生物有较大的影响。现有的生物防治方法如生物杀虫剂等作用时间长且起效慢，而敲除害虫生长发育的特异性基因的方法是将来害虫综合治理的发展趋势之一。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源或内源的双链RNA（double2stranded RNA，dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象。它具有稳定转座子、清除异常RNA、调节基因表达等功能，且RNAi沉默基因的高效率、高特异性以及能在细胞内进行人工诱导，使RNAi作为一种反向遗传技术广泛应用于基因功能的研究。
RNAi一直广泛应用于基因功能的研究，在利用该技术成功鉴定了多种昆虫基因功能的同时，科学家们试图将该技术应用于害虫防治领域，目前已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。通过对棉铃虫幼虫饲喂表达P450基因（CYP6AE14)）和谷胱甘肽基因GST1dsRNA的棉花，诱导RNAi并阻碍了幼虫发育，这一技术为田间害虫控制开辟了新领域（Mao et al.，2007)；采用RNA干扰技术，开展翅盘异常发育基因dsRNA在害虫防治中的应用具有重要的意义。
相比于传统的害虫控制策略，害虫基因沉默控制的优势在于：(1)根据害虫基因序列的特异性，可以设计使目的基因沉默的专一性基因，同时由于RNA分子的不稳定性，不会出现残留污染问题，因此对环境生态安全和食品安全没有任何影响；(2)防治对象的特异性极高，不会对其他昆虫特别是害虫天敌产生负面影响，有利于害虫生物防治和综合治理体系的实施；(3)对由于基因突变产生的抗性问题，很容易通过改变小RNA的序列来解决，以变制变，因此不会产生严重的抗性问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种昆虫翅盘异常发育基因片段。
本发明的另一目的在于提供上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA。
本发明的再一目的在于提供上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种昆虫翅盘异常发育基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。
上述的昆虫翅盘异常发育基因片段（SEQ ID NO：1），是根据NCBI数据库设计上游引物（序列如SEQ ID NO：2所示）和下游引物（序列如SEQ ID NO：3所示），通过PCR扩增获得SEQ ID NO：1。
一种昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA，是以上述的昆虫翅盘异常发育基因片段（SEQ ID NO：1）为模板，通过试剂盒合成。
上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA可以用于致死害虫，即将dsRNA注射到昆虫体腔。实验结果表明：上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA可以特异性地沉默昆虫体内翅盘异常发育基因的mRNA表达，使昆虫在蜕皮化蛹和羽化过程中死亡。
在RNAi过程中，只有导入到生物体内的dsRNA被Dicer酶切割成siRNA后才能发挥作用。一般而言，具有功能性的siRNA分子其最小剪辑长度为19bp。即设计的能够沉默目标基因的dsRNA与这个物种之中的其他基因相比，没有连续19bp以上的碱基完全相同，那么就能保证降低特异性目的片段的转录水平。但是，如果设计的dsRNA是针对同一物种的很多基因共有保守序列，特别是对具有大于19bp以上完全相同的连续碱基的两个或多个目标基因，那么则有可能会导致目标基因的“脱靶效应”。根据上述理论，我们就可以利用“脱靶效应”沉默一个基因家族的多个基因或不同物种的同类基因。
本发明根据上述dsRNA设计的基本原则，在斜纹夜蛾AWD mRNA序列(即JF690666)上选取了537bp的片段作为dsRNA的表达区域，通过序列分析和单一性检测没有发现连续19bp以上碱基序列完全相同的基因，因此确定该序列可以作为靶标基因序列。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过人工合成斜纹夜蛾AWD基因片段的dsRNA沉默AWD基因，使蛹期斜纹夜蛾致死或使其成虫的翅发育畸形。将斜纹夜蛾AWD基因极高的特异性作为害虫控制的靶标防治害虫，对环境生态安全和食品安全没有任何影响，同时，有效避免产生严重的抗性问题。本发明为以该基因序列为靶标的新型生物杀虫剂的研发提供分子生物学技术，有利于鳞翅目食叶性害虫综合治理体系的建立。
相比于传统的害虫控制策略，害虫基因沉默控制的优势在于：(1)根据害虫基因序列的特异性，可以设计使目的基因沉默的专一性基因，同时由于RNA分子的不稳定性，不会出现残留污染问题，因此对环境生态安全和食品安全没有任何影响；(2)防治对象的特异性极高，不会对其他昆虫特别是害虫天敌产生负面影响，有利于害虫生物防治和综合治理体系的实施；(3)对由于基因突变产生的抗性问题，很容易通过改变小RNA的序列来解决，以变制变，因此不会产生严重的抗性问题。
附图说明
图1是实施例1合成的dsRNA的纯度检测结果示意图；其中，M-Marker，1、2泳道-dsRNA，箭头所指为合成的SLAWD dsRNA。
图2是dsRNA注射24h后对6龄斜纹夜蛾发育的影响。
图3是注射dsRNA后对6龄斜纹夜蛾蛹发育的影响。
图4是注射dsRNA后对6龄斜纹夜蛾翅发育的影响。
图5是注射dsRNA后对6龄斜纹夜蛾翅盘异常发育基因转录表达的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段的获得及其dsRNA的合成，包括以下步骤：
（1）斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段的获得
根据NCBI数据库中登录号为JF690666的斜纹夜蛾翅盘异常发育基因序列，采用primer premier5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：2，下游引物序列为SEQ ID NO：3，所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。
SEQ ID NO：2：ATGATTGCCACTTTGCTATACC
SEQ ID NO：3：TTATTCATAAACCCAGTTTTCGGC
斜纹夜蛾总RNA的提取按照OMEGA公司的Trizol kit试剂盒进行。利用反转录TaKaRa试剂盒PrimerScriptTM Reverse Transcriptase反转录成第一条链的cDNA，以此为模板进行PCR扩增获得斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段（即SEQID NO：1），并对所获得的翅盘异常发育基因片段进行表达纯化。
（2）以步骤（1）所获得的翅盘异常发育基因片段为模板，以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物（SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5是按照T7RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒的说明在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的5’端多加一个T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG后得到的），扩增合成dsRNA。得到的dsRNA用酶标仪OD260检测，确定其浓度。并用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测其单一性。结果如图1所示。
上游引物SEQ ID NO：4：
5’-TAATACGACTCACTATAGGGATGATTGCCACTTTGCTATACC-3’
下游引物SEQ ID NO：5：
5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTATTCATAAACCCAGTTTTCGGC-3’
实施例2
斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段的dsRNA致死斜纹夜蛾实验
1）斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段的dsRNA注射
选取同一批次发育良好的6龄第三天斜纹夜蛾幼虫，用玻璃毛细针吸取5μL实施例1合成的dsRNA，顺着昆虫血液流动的方向将dsRNA溶液注射入幼虫近第一腹足处，要避开气门。每批次20头，实验重复3次。同时，设dsGFP的对照组。注射完毕后，将斜纹夜蛾幼虫置于人工气候箱中进行饲养（温度26±1℃，光照L14:D10，湿度60~70%）。每隔6小时观察其发育状况。
2）注射dsRNA对斜纹夜蛾生长发育的表型观察
dsRNA注射24h后，虫体进入预蛹期。图2中，对照组（注射dsGFP）和dsRNA实验组的虫体均能正常生长（自然死亡除外）。
dsRNA注射48h后，斜纹夜蛾幼虫完成最后一次蜕皮化蛹。比较对照组和实验组的化蛹畸形表型发现（图3），对照组蛹的个体饱满，外表无损伤，生长发育正常；而dsRNA处理组多表现为蛹体头胸部干瘪，头胸部器官的形成和发育受阻而死亡。
比较对照组和实验组的畸形羽化表型发现（图4）：dsRNA实验组的斜纹夜蛾成虫翅的发育存在缺陷，发育较短或畸形，并最终死亡。
3）注射dsRNA对斜纹夜蛾翅盘异常发育基因的干扰效应检测
在注射dsRNA后，分别提取对照组和处理组的预蛹、雌蛹、雄蛹、雌成虫、雄成虫总RNA进行荧光定量PCR，检测斜纹夜蛾AWD基因（S.litura AWD，简称SLAWD）的mRNA表达水平变化。以斜纹夜蛾Actin基因为内参，荧光定量PCR结果如图5。对照组中AWD基因mRNA水平的表达在误差范围内符合斜纹夜蛾不同发育阶段的正常表达。而经dsRNA实验组的斜纹夜蛾预蛹、雌蛹、雄蛹、雌成虫、雄成虫中AWD基因mRNA水平均显著降低。该结果说明，通过微注射dsRNA的方法在斜纹夜蛾中可以诱导***性RNAi，从而沉默斜纹夜蛾AWD基因。
4）注射dsRNA后斜纹夜蛾的死亡情况统计
注射dsRNA的斜纹夜蛾实验组死亡率为70.00±3.16%。这与微注射dsGFP的对照组相比（死亡率为34.17±2.39%），致死效果明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种昆虫翅盘异常发育基因片段，其特征在于核苷酸序列是SEQ ID NO：1。
2.一种昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA，其特征在于：是以权利要求1所述的昆虫翅盘异常发育基因片段为模板合成的。
3.权利要求2所述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA在致死害虫中的应用。
4.根据权利要求3所述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA在致死害虫中的应用，其特征在于：将dsRNA注射到昆虫体腔。
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