CN110904123A - 一种用于促进酿酒酵母高产甘蔗糖蜜酒精的基因及其应用 - Google Patents

一种用于促进酿酒酵母高产甘蔗糖蜜酒精的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及了一种用于促进酿酒酵母高产甘蔗糖蜜酒精的基因PHO4，及利用其重组高产菌株作为生产菌株，采用甘蔗糖蜜为原料生产高浓度酒精。该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018917，保藏日期为2018年12月21日，分类学名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌株号为MF01‑PH04。本发明的基因PHO4，关于此基因在此方面所具有的用途，目前未见报道。本发明的菌株56小时甘蔗糖蜜酒精产量达到最高值114.71克每升，发酵周期短，酒度高，适合甘蔗糖蜜高浓度酒精发酵，从而提高了原料的利用率，降低了酒精生产成本，能够为酒精发酵工业带来显著的经济利益。

Description

一种用于促进酿酒酵母高产甘蔗糖蜜酒精的基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于促进酿酒酵母利用甘蔗糖蜜进行高浓度酒精发酵的基因及其重组高产酵母菌株的构建方法与在生产燃料酒精中的应用。
背景技术
生物燃料酒精作为可再生能源是目前为止最为成功的液体替代燃料。如何开发和利用燃料酒精是目前世界各国共同关注的焦点。我国也不例外，将非粮生物燃料酒精作为战略性新兴产业。甘蔗糖蜜是蔗糖生产的副产物，已成为广西等我国南方地区生产燃料酒精的主要原料。实际上，甘蔗糖蜜燃料酒精产业已成为广西农业新兴优势产业。目前，甘蔗糖蜜燃料酒精产业仍普通存在酒精发酵水平低、环境污染严重等两大突出问题，而最关键的是缺乏高性能的工业菌种。针对我国甘蔗糖蜜酒精所存在的上述两大难题及结合广西实际情况，本发明团队前期已从广西甘蔗糖厂的废弃物中选育出酒精发酵性能/表型(酒精浓度、发酵速度、菌株生长速率、对糖分的利用能力、呼吸强度等)不同的系列野生型酿酒酵母工业菌株：低产、中产、高产等酵母菌群，建立了一个较为完整的，针对甘蔗糖蜜酒精发酵的菌种库。高产菌株具有以下表型：酒度最高，但生长最慢(造成发酵周期长)，而低产菌株酒度虽最低但具备生长最快且最为快速利用糖分的优点(发酵周期短)，中产菌株性能介于两者之间。高产菌株已应用于年产5万吨甘蔗糖蜜酒精，且能在夏天高温下(37℃)进行糖蜜酒精发酵，酒度达到了94g/L，节约能耗，生产效益显著。
本发明团队前期通过了对高、中、低产3个系列酵母菌群各菌种的发酵性能(表型)的综合比较分析，从中分别选取高、中、低产酵母各1株进行全基因组重测序和比较基因组学分析，发现高产酵母具有更强的接纳异源基因的能力，挖掘出可能与高产甘蔗糖蜜乙醇的关键调控基因56个。PH04基因属于这56个基因中的一个，是磷酸盐调控***(PHOregulon)中最重要的正调控基因，位于第六号(VI)染色体上。本发明是将低产菌株MC15的PH04基因导入高产野生菌株MF01，通过基因同源重组的方法置换了原始高产菌株MF01的PH04基因，
获得比原始高产野生菌株MF01更能快速利用甘蔗糖蜜进行高浓度酒精发酵的PH04基因重组高产菌株。本发明能实现高浓度酒精发酵，缩短酒精发酵时间，节约能耗，对糖蜜酒精生产意义重大。
发明内容
本发明提供一种用于促进酿酒酵母利用甘蔗糖蜜进行高浓度酒精发酵的基因及其重组高产酵母菌株的构建方法。重组高产菌株能很好地在甘蔗糖蜜酒精发酵生产中应用。
本发明的技术方案是：提供的一种用于促进酿酒酵母利用甘蔗糖蜜进行高浓度酒精发酵的基因，该基因为PH04。
本发明所述的一株能快速利用甘蔗糖蜜原料进行高浓度酒精发酵的菌株，该菌株为MF01-PH04，分类学名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018917，保藏地址为武汉市洪山区八一路武汉大学。
本发明所述的能快速利用甘蔗糖蜜原料进行高浓度酒精发酵的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：PCR克隆低产酵母MC15的PH04基因，将其电转化导入高产酵母MF01单倍体原生质体中，获得重组高产酵母MF01-PH04，经传代至30代，扩增其PH04基因，测序发现，该基因是稳定的。
本发明所述的酿酒酵母菌株MF01-PH04在甘蔗糖蜜高浓度酒精发酵生产中的应用，包括以下步骤：以接种量5％加入酿酒酵母在20°Bx糖蜜中，30℃，180rpm培养形成种子液后，加入等体积50°Bx的高浓度糖蜜培养24小时后静置发酵，再经32小时发酵，酒精产量达到最高值114.71克每升，发酵时间比出发高产菌株缩短了8小时，且酒度提高了5.3％。
本发明的突出优点在于：所述的能快速生长利用甘蔗糖蜜原料进行高浓度酒精发酵的基因是PH04，磷***正调控基因，关于这基因在此方面所具有的用途，目前未见报道；所获得的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)MF01-PH04与原始高产酵母菌株MF01相比，发酵时间比出发高产菌株缩短了8小时，且酒度提高了5.3％，酒精产量达到最高值114.71克每升，比一般工业酵母菌发酵周期短，酒度高，适合甘蔗糖蜜高浓度酒精发酵，提高了原料的利用率，降低了酒精生产成本，能够为酒精发酵工业带来显著的经济利益。
附图说明
图1为低产酵母MC15的PH04基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(ML：DL2000 DNAMarker；1，2：PH04基因；M：1kb DNA Ladder Marker)，基因大小为1139bp。
图2为重组高产酵母MF01-PH04与原始高产菌株MF01的产气差异，2个平行。
图3为重组高产酵母MF01-PH04与原始高产菌株MF01、低产菌株MC15的甘蔗糖蜜酒精发酵曲线。
具体实施方式
实施例1：克隆低产酵母MC15的PH04基因。
1.低产酵母MC15基因组DNA的提取。
培养基YPD：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉。
酵母活化培养过夜，收集2mL菌体沉淀，水洗2次，加入裂解液250微升，100微升1XTE，以及约为液体三分之一体积的无菌石英砂，振荡3分钟，加入等体积酚氯仿(1∶1)，缓慢颠倒摇匀几次，离心12000rpm，10分钟，吸取上清100微升，适量70％乙醇洗2次，风干，加入适量ddH2O，-20℃冰箱保存。
2.克隆PH04基因及电泳检验、测序验证。
PCR反应体系：10×ExTaq PCR Buffer 5微升，PH04-F/R引物各2微升，dNTPMixture(各2.5mM)2微升，DNA 1微升，酶0.2微升，ddH2O 36.8微升。
PH04-F引物：5’-TTTCCAGCAAAGCGCCTCTT-3’。
PH04-R引物：5’-GAAGTCATGCTTCGGAAGGACC-3’。
PCR反应程序：85℃ 10s，85℃ Pause加酶Continue，94℃ 3min，35 cycles(94℃30s，53.5℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min。
PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果(图1)，大小验证正确(基因上游下各加了同源臂100bp，故大小为1139bp)后，送样测序，测序结果进行比对，验证正确。
3.PCR产物纯化获得PH04基因。
利用胶回收试剂盒进行回收纯化PH04基因的PCR产物，操作根据试剂盒说明书进行，常规操作，纯化产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃冰箱保存。
实施例2：重组高产酵母MF01-PH04的获得。
1.原始高产酵母产孢培养。
McClay生孢培养基：葡萄糖0.1％，氯化钾0.18％，醋酸钠0.82％，酵母粉0.25％。
酵母菌株经活化后，收集种子液，菌体沉淀无菌水洗2次后，接种至McClay生孢培养基中，28℃培养5d左右，取样显微镜检测产孢效果。
2.原始高产酵母单倍体原生质体制备。
收集上述1中的产孢子培养液，58℃水浴15min杀死营养细胞，无菌水洗2次，去上清，沉淀用混合酶液(4％蜗牛酶，2％纤维素酶)重悬，30℃ 200rpm酶解8h(4h后每隔1h镜检)，观察原生质体情况，数原生质体数量。
3.原生质体电转化。
控制原生质体数量在2×108个每毫升，用0.7M氯化钾洗一次，4℃低速离心4000rpm，5min，去上清，1M山梨醇洗2次(4℃低速离心4000rpm，5min)，去上清，加1M山梨醇，调整原生质体数量在2×109个每毫升，分装至1毫升无菌EP管(80-90微升每管)，加入10微升PH04基因片段，混匀后吸至电转杯(冰浴预冷)，冰浴5min，电转1.5KV 200Ω 25μF，迅速加入900微升1M山梨醇(冰浴预冷)。
4.原生质体再生。
再生培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％，氯化钾5.22％。
上述3中的转化液混匀后，吸出至一无菌1.5mL EP管中，30℃水浴预培养2h，加入2mL再生培养基，30℃ 130rpm再生培养24h，镜检再生情况。
5.重组高产酵母MF01-PH04的验证。
上述4中的培养液，划线YPD平板，随机挑选单菌落，参照实施例1中提取低产酵母基因组DNA的方法，提取菌落的DNA，然后参照实施例1中PCR克隆PH04基因的方法，扩增出候选菌落的PH04基因，送PCR产物进行测序，测序结果进行比对，验证能将原始高产酵母PH04基因置换为低产酵母PH04基因，从而获得重组高产酵母MF01-PH04。
6.重组高产酵母MF01-PH04的稳定性。
经传代至30代，参照实施例1中PCR克隆PH04基因的方法，扩增出30代重组酵母的PH04基因，送PCR产物进行测序，测序结果进行比对，测序发现，该基因是稳定的。
实施例3：重组高产酵母MF01-PH04的甘蔗糖蜜酒精发酵试验。
1.重组高产菌株MF01-PH04与原始高产菌株MF01产气差异。
活化菌种至对数期，显微计数，控制菌数一致，以初始菌数1×106个每毫升的终浓度接种至装有倒置杜氏小管(充满YPD液体培养基)、6mL YPD的试管中，放入培养箱，30℃培养，4h起每个1h观察产气情况，结果重组高产菌株MF01-PH04比原始高产菌株MF01产气快速(见图2)。
2.低产菌株、原始高产菌株、重组高产菌株的甘蔗糖蜜酒精发酵试验比较。
糖蜜酒精发酵按照目前甘蔗糖蜜酒精生产的工艺进行。糖蜜培养基：标准糖蜜80-85°Bx，来自糖厂。初始采用20°-25°Bx糖蜜，优选20°Bx，补料采用50°-55°Bx糖蜜，优选50°Bx。两者均用水称重配置，硫酸调节pH值3.8-4.0，添加0.2％(W/V)尿素、0.02％(W/V)磷酸。
活化菌种至对数期，以接种量5％加入酿酒酵母在20°Bx糖蜜中，30℃，180rpm培养形成种子液后，加入等体积50°Bx的高浓度糖蜜培养24小时后静置发酵，每隔8小时取样测酒精含量，再经32小时发酵，重组高产菌株MF01-PH04酒精产量达到最高值114.71克每升(56h)，而原始高产菌株酒精最高值为108.94克每升，前者的酒度比后者的提高了5.3％，原始高产菌株再经8h才达到最高值112.58克每升(64h)，而低产菌株的酒精产量最高为86.35克每升(64h)，这些结果见图3。
乙醇含量测定：利用气相色谱法(内标法)，常规方法，气相色谱仪为安捷伦6890N。
实施例所涉及的重组高产菌株MF01-PH04的PH04基因，其核苷酸序列如序列表NO.1所示，所编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表NO.2所示。
Figure ISA0000183219070000011
Figure ISA0000183219070000021

Claims (6)

1.一种用于促进酿酒酵母利用甘蔗糖蜜原料进行高浓度酒精发酵的基因，其特征在于，该基因是PHO4，磷***正调控基因，其核苷酸序列如序列表NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如序列表NO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述基因的酿酒酵母菌株，其特征在于：是以高产甘蔗糖蜜酒精的野生型酿酒酵母菌株为出发菌株，将能快速生长但低产甘蔗糖蜜酒精的酿酒酵母菌株的PHO4基因导入出发菌株，导入基因与出发菌株基因组发生同源重组，经筛选获得的。
4.权利要求1所述基因，其特征在于，该基因来源于一株能快速利用甘蔗糖蜜原料进行高浓度酒精发酵的菌株MF01-PH04，分类学名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2018年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018917。
5.权利要求3所述的菌株可以应用于甘蔗糖蜜高浓度酒精发酵生产，其特征在于：按目前甘蔗糖蜜酒精生产的发酵工艺，采用20°-25°Bx糖蜜，优选20°Bx，硫酸调pH3.8-4.0，培养形成种子液后，补加等体积50°-55°Bx糖蜜，优选50°Bx，硫酸调pH3.8-4.0，30℃发酵56小时，酒精产量达到最高值114.71克每升。
6.权利要求3所述的菌株，其特征在于：该菌株是工业酿酒酵母菌株。
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