CN108300671A - 一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株，其为SEB10，保藏编号为CGMCC No.14777；本发明还涉及一株上述酿酒酵母菌株的构建方法，其包括如下步骤：选取出发菌株；利用Cre‑LoxP***敲除出发菌株的KanMX基因，构建SEB6kan菌株；利用CRISPR/Cas9***突变SEB6kan菌株的HXT3基因，构建SEB6kan‑M‑HXT3菌株。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以定点迅速而准确地将转运蛋白HXT3的367位由天冬酰胺突变为丙氨酸；通过本发明所述构建方法制备的酿酒酵母菌株在初始葡萄糖浓度较高的条件下，提高木糖转运速率从而提高酿酒酵母共发酵木糖和葡萄糖的能力，提高其产木糖醇乙醇的性能；在发酵罐的条件下，木糖消耗速率提升12％，木糖醇产量提升13％，乙醇产量提升22％，木糖醇的收率接近理论值1.0。

Description

一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵 母菌株及构建方法

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一株利用CRISPR/Cas9***突变HXT3基因提高木糖转运速率的共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术

木质纤维素生物质主要来源于农业废弃物，而秸秆等农业废弃物是地球上储量最为丰富的可再生有机物质，在中国每年约有9亿吨秸秆产生，转化处理方式上仍多为废弃或直接田间焚烧，处理成本过高造成极大的资源浪费、污染大气环境，破坏生态平衡。而利用生物质资源生产生物能源产品，其产生过程不会导致温室气体总量的净增加，减轻环境压力，是环境友好的可再生清洁能源。

木质纤维素生物质原料主要由纤维素，半纤维素和木质素三部分组成。其水解液中主要六碳糖为葡萄糖，主要五碳糖为木糖，而木糖醇可由木糖还原制得，乙醇可由葡萄糖转化获得。

木糖醇在医药食品等行业应用广泛，且作为21世纪新兴最有前途的生物平台化合物之一，经济价值十分可观。

生产木糖醇的方法主要有化学加氢法和生物转化法。化学法对设备要求极高，副产物成分复杂、提纯难、成本高，且该过程所需的镍催化剂对环境污染严重，木糖醇的收益低。生物法则反应条件温和、工艺简单可行，操作性可控性强。且后者污染少，分离成本低，具有良好的应用前景，是实现废物资源化、无害化，替代化学加氢法生产的有效途径。

可生产木糖醇的微生物总体可分三类：细菌、丝状真菌以及酵母菌，酵母的产率明显高于其他。2013年酵母产品的全球市场已达到58亿美元，预计2019 年将达到92亿美元。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是经由GRAS(Generally Recognized As Safe)认证的安全菌株。而工业酿酒酵母具有耐热性能好，耐受抑制物性能佳等优点，用其作为基因工程改造的出发菌株，将木糖还原酶(XR，由XYL1编码)基因导入酿酒酵母可使木糖还原为木糖醇，并可获得高产木糖醇的工程菌。但是在葡萄糖和木糖共发酵的情况下，由于葡萄糖效应的存在，胞内木糖的高速代谢仍处于瓶颈，目前为止并未在酿酒酵母中发现可与葡萄糖代谢相匹敌的转运子。酿酒酵母中有多种单糖转运子(HXT1～HXT17和GAL2)，但他们均是对己糖具有特异亲和性的转运子。只有一部分转运子如HXT1，HXT2， HXT4，HXT5，HXT7以及GAL2可以转运木糖。且在混合糖(木糖和葡萄糖同时存在)的情况下，这些转运子会优先利用葡萄糖，木糖的转运会受到限制。许多研究通过突变一些转运子的特殊位点以提高其对木糖的亲和性，从而提高木糖的代谢速率。

而由国家发展改革委、国家能源局、财政部等十五部委联合印发《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》要求，到2020年，我国全国范围将推广使用车用乙醇汽油。因而，利用农业废弃物变废为宝同时生产木糖醇和乙醇，产生经济效益的同时还可作为环保处理农业废弃物的有效途径，一举两得。

简洁便捷的基因编辑技术越来越受到热捧，而第3代基因组编辑技术 CRISPR-Cas9基因编辑技术正应运而生，Cas9既可作为双链的内切酶也可被改造成为切口酶，并在特定位点对DNA进行切割，形成双链断裂(Double strand break,DSB)，通过非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制或在同源重组(Homologousrecombination，HR)修复机制以及修复模板 (Donor template)DNA存在的条件下，实现定点单碱基突变、长片段的***、敲除以及突变。该***是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，通过一段短的引导RNA(Guide RNA，gRNA)识别特定的DNA序列，通过改变gRNA序列即可使蛋白定位到新的DNA序列。设计打靶位点时，只需在原有含gRNA 载体的基础上替换20bp的gRNA核苷酸序列，另外靶点的唯一限制是3'端必须有原间隔相关基序(PAM)序列(NGG)，所以它的靶点在基因中出现的频率较高。且Cas9可与多个不同靶位点的gRNA同时导入细胞中，可同时实现多基因编辑，极大的提高了基因编辑的效率。该基因编辑技术相比于传统的基因编辑技术，无需标记基因，流程少、时间短、成本低，在各领域必将有越来越有广阔的应用前景，并且产生深远的影响。

工业酿酒酵母表达***较为复杂，目前采用的来源于热带假丝酵母CtXYL1 (编码木糖还原酶)基因在酿酒酵母中异源表达后，为了模拟其在木质纤维素水解液中的发酵过程，选取初始浓度高的葡萄糖作为碳源供给时，其构建的重组菌，木糖代谢速率慢、木糖醇产量低，不能满足发酵需求的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株利用CRISPR/Cas9***突变HXT3基因提高木糖转运速率共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法，其通过人为改造工业酿酒酵母使其在高浓度葡萄糖存在的条件下，提高木糖转运速率从而提高酿酒酵母共发酵木糖和葡萄糖的能力，提高其产木糖醇和乙醇的性能，这通过新型基因编辑技术、突变目的基因的表达来实现。

本发明使用具有木糖代谢背景的絮凝性工业酵母SEB6作为出发菌株，构建一株高产木糖醇菌株。为了确保重组菌株在工业生产中的安全性，需要对G418 抗性筛选标记KanMX基因进行敲除，即通过将已含热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖还原酶(xylose reductase，XR)基因CtXYL1、含有kanMX的絮凝性工业酿酒酵母SEB6的抗性基因kanMX利用Cre-LoxP***，通过识别 LoxP位点将其切除，然后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术来突变HXT3基因，提高菌株对木糖的亲和性，进一步提高木糖代谢速率，从而提高木糖醇和乙醇产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株的转运蛋白HXT3的367位上的氨基酸天冬酰胺突变为丙氨酸。

进一步地，所述酿酒酵母菌株为SEB10，其分类命名为酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.14777，保藏日期为2017 年10月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种上述的共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其包括以下步骤：

步骤a)选取出发菌株，所述出发菌株为絮凝性工业酵母SEB6，其保藏编号为CGMCCNo.11326；

步骤b)利用Cre-LoxP***敲除出发菌株的KanMX基因，构建SEB6kan 菌株；

步骤c)利用CRISPR/Cas9***突变步骤b)所构建的SEB6kan菌株的HXT3 基因，构建SEB6kan-M-HXT3菌株。

为了进一步优化上述酿酒酵母菌株的构建方法，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，在步骤c)之后，还包括步骤d)筛选最优SEB6kan-M-HXT3菌株，并命名为SEB10。

进一步地，所述SEB6菌株含有热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖还原酶(xylose reductase，XR)基因CtXYL1。

进一步地，步骤c)中构建SEB6kan-M-HXT3菌株的步骤包括：

步骤1)将Cas9-NAT质粒导入步骤b)构建的SEB6kan菌株，粗提酿酒酵母转化子基因组DNA并以该DNA作为模板进行PCR扩增，发酵筛选高产木糖醇的菌株，将该菌株命名为SEB6kan-Cas9菌株；

步骤2)以pMEL13质粒为模板，PCR扩增并切胶纯化回收PCR扩增产物，制得含gRNA的质粒线性骨架，命名为pMEL13-backbone；

步骤3)设计识别HXT3基因的gRNA片段以及HXT3单突变修复重组片段，分别命名为M-HXT3-gRNA、M-HXT3-repair；

步骤4)利用步骤2)制备的pMEL13-backbone和步骤3)设计的 M-HXT3-gRNA构建pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒；

步骤5)将步骤4)构建的pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒和步骤3)设计的 M-HXT3-repair转化到步骤1)制备的SEB6kan-Cas9菌株，利用CRISPR/Cas9 ***突变HXT3基因，并对HXT3突变菌株进行测序筛选，脱除Cas9-NAT质粒以及pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒，构建SEB6kan-M-HXT3菌株；

其中，步骤1)～步骤3)的操作顺序可进行互换。

进一步地，所述Cas9-NAT质粒的序列如SEQ ID NO：1所示；扩增所述酿酒酵母转化子基因组DNA的引物序列如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：3所示；所述pMEL13质粒的序列如SEQID NO：4所示，其采用的引物序列如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6所示；所述M-HXT3-gRNA的序列如SEQ ID NO：9所示，所述M-HXT3-repair的序列如SEQ ID NO：11所示。

进一步地，所述步骤1)中酿酒酵母转化子基因组DNA的PCR扩增程序为： 98.0℃预变性30s，98.0℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，上述过程进行30个循环。

进一步地，所述步骤2)中pMEL13质粒的PCR扩增程序为：98.0℃预变性 30s，98.0℃变性10s，67℃退火15s，72℃延伸6min 10s，上述过程进行35个循环后，于4℃保存。

进一步地，在步骤3)中，还包括设计HXT3编码区验证引物的步骤，所述 HXT3编码区验证引物的序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；在步骤3)中还采用如SEQ ID NO.10所示序列的测序引物。

进一步地，在步骤4)中采用了如SEQ ID NO.12所示序列的测序引物。

进一步地，步骤d)中筛选最优SEB6kan-M-HXT3菌株包括以下步骤：利用试管发酵筛选具有高木糖消耗率的SEB6kan-M-HXT3菌株，将该菌株进行培养发酵，并测定发酵参数，计算木糖消耗率以及木糖醇的产率，筛选出木糖消耗速率最快的菌株作为最优SEB6kan-M-HXT3菌株，并命名为SEB10。

进一步地，在上述酿酒酵母菌株的构建方法中使用的培养基包括液体培养基 (如2％YPD培养基、YPDX培养基、YPDX发酵罐用培养基等)、固体培养基(如LB/Amp培养基、2％YPD/G418/NAT固体培养基等)等，也可使用其他任一合适的培养基。

本发明的第三个目的是提供一种上述工业酿酒酵母菌株在木糖醇及乙醇生产中的应用。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

1、本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以定点迅速而准确地将转运蛋白HXT3的367位由天冬酰胺突变为丙氨酸。

2、通过本发明所述构建方法制备的酿酒酵母菌株SEB10在初始葡萄糖浓度较高的条件下，木糖消耗速率，木糖醇乙醇产量均有所提升。试管发酵条件下，木糖消耗速率提高80.6％，木糖醇产量提高93.5％；发酵罐的条件下，木糖消耗速率提升12％，发酵生产木糖醇的性能优越，木糖醇产量提升13％，乙醇产量提升22％，木糖醇的收率接近理论值1.0。

附图说明

本发明公开的一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株为SEB10，其已进行保藏，其分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.14777，保藏日期为2017年10月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

图1是本发明一实施例中的出发菌株SEB6kan发酵罐的发酵示意图；

图2是本发明一实施例中的HXT3(N367A)突变菌株SEB10发酵罐的发酵示意图。

具体实施方式

本发明涉及一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的培养基配方如下：

本发明的培养基配方如下：

1、液体培养基；

2％YPD培养基(10g/L Yeast Extract酵母浸出粉、20g/L Peptone蛋白胨、 20g/Lglucose葡萄糖)，121℃，灭菌15min，冷却至60℃，可根据情况添加 100μg/mLG418或80μg/mL诺尔斯菌素。用于酵母发酵前的预培养。

YPDX培养基(10g/L Yeast Extract酵母浸出粉、20g/L Peptone蛋白胨、40 g/LD-Xylose木糖，60g/L或20g/Lglucose葡萄糖)，121℃灭菌15min，冷却至60℃，可根据情况添加100μg/mLG418或80μg/mL诺尔斯菌素。用于木糖的试管发酵。

YPDX发酵罐用培养基(10g/LYeast Extract酵母浸出粉、20g/LPeptone蛋白胨、45g/L D-Xylose木糖，60g/L glucose葡萄糖)，121℃灭菌15min，冷却至60℃，可根据情况添加100μg/mLG418或80μg/mL诺尔斯菌素。用于木糖的发酵罐发酵。

2、固体培养基；

LB/Kana培养基(10g/LPeptone蛋白胨、5g/LYeast Extract酵母浸出粉、10 g/LNaCl)，121℃，冷却至60℃，加入100μg/Ml卡那霉素。用于培养大肠杆菌。

2％YPD/G418/NAT固体培养基(10g/LYeast Extract酵母浸出粉、20 g/LPeptone蛋白胨、20g/Lglucose葡萄糖、15g/L Agar琼脂)，121℃，冷却至60℃，加入100μg/mLG418，80μg/mL诺尔斯菌素。用于培养酵母，根据试验情况添加两种抗生素筛选酵母转化子。

实施例1

本实施例为酿酒酵母菌株SEB10的构建方法，其包括如下步骤：

(1)敲除筛选标记KanMX基因：采用醋酸锂转化法将含Cre酶酵母表达的诱导型质粒pSH47/ZEO(1μg)转化到出发酿酒酵母菌株SEB6中，在含有Zeocin 最佳耐受浓度的pH7.2的2％YPD平板中筛选菌落形态完好的阳性转化子。质粒 pSH47/ZEO为现有质粒，敲除筛选标记G418的KanMX基因的方法公开在2013 年Tomitaka等人报道的一篇文献中，该文献名称为：分离及鉴定一株经突变和重组的能高效利用木糖的酿酒酵母；作者有：Tomitaka M、Taguchi H、Fukuda K、 Akamatsu T、Kida K；公开的刊物为：生物科学与生物工程杂志.2013，116(6)： 706-715。上述利用同源重组的方式，利用Cre-LoxP15***，通过识别LoxP位点将KanMX基因切除，该敲除筛选标记G418的KanMX基因的方法采用本领域的常规技术手段，将敲除KanMX基因的菌株命名为SEB6kan；

(2)将Cas9-NAT质粒导入酿酒酵母SEB6kan：将现有质粒Cas9-NAT(1μg) (SEQ IDNO.1)通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母SEB6kan菌株中，在含有诺尔斯菌素的2％YPD平板中筛选菌落形态完好的阳性转化子；

(3)粗提酿酒酵母转化子基因组DNA：将可能的阳性转化子用牙签挑取至95μl 1％SDS(十二烷基磺酸钠)中，并加入4μl 4M醋酸锂溶液，之后操作步骤按照公开在2015年Robert Mans等人报道的一篇文献中，该文献名称为： CRISPR/Cas9：在酿酒酵母中同时引入多基因修饰的一种分子瑞士军刀；作者有： Harmen M.van Rossum#,Melanie Wijsman,Antoon Backx,Niels G.A.Kuijpers, Marcel van den Broek,Pascale Daran-Lapujade,Jack T.Pronk,Antonius J.A.van Maris and Jean-Marc G.Daran；公开的刊物为：FEMSYeast Research(欧洲微生物学联合会酵母研究杂志)2015，15(2)：1-15。

(4)通过菌落PCR验证以及试管发酵筛选SEB6kan-Cas9菌株：从上述步骤中得到的转化子基因组DNA为模板，Cas9-dg-F(SEQ ID NO.2)，Cas9-dg-R (SEQ ID NO.3)为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系25μl组成如下：PCR 反应体系50μl组成如下：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+plus)5μl；dNTP Mixture (各2.5mM)2μl；引物Cas9-dg-F，Cas9-dg-R各10μM，0.3μl；PrimeSTAR HS DNA polymerase(5U/μl)0.3μl；转化子DNA 30-50ng；以灭菌双蒸水补加至25μl。 PCR扩增程序为：将上述25μl反应体系在98.0℃预变性30s，98.0℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，上述过程进行30个循环后，取适量液体于100V 电压条件下进行凝胶电泳，如果出现753bp的电泳条带则为阳性转化子。将验证的阳性转化子于35℃，140rpm条件下，利用YPDX(10g/L Yeast Extract酵母浸出粉、20g/L Peptone蛋白胨、50g/LD-Xylose木糖，20g/L glucose葡萄糖) 进行试管发酵，根据发酵结果筛选出一株高产木糖醇菌株，命名为 SEB6kan-Cas9；

利用试管发酵筛选SEB6kan-Cas9菌株的结果如表1所示：

表1 试管发酵筛选SEB6kan-Cas9菌株

根据表1的结果可知：C2号菌的木糖发酵以及生产木糖醇的性能最优越，因而用其作为突变HXT3基因的出发菌SEB6kan-Cas9菌株。

(5)含gRNA的线性骨架的制备：以pMEL13质粒(SEQ ID NO.4)为模板，6006-Fv(SEQID NO.5)、6005-Rw(SEQ ID NO.6)为引物，PCR扩增并切胶纯化回收PCR扩增得到的质粒线性化骨架。PCR反应体系50μl组成如下： 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10μl；dNTPMixture(各2.5mM)4μl；引物6006-Fv、6005-Rw各10μM，0.5μl；PrimeSTAR HS DNApolymerase(5U/μl) 0.5μl；质粒pK-XR-Ct 50ng；以灭菌双蒸水补加至50μl。μM是浓度单位，是μmol/l的意思。gRNA的线性骨架的PCR扩增程序为：将含有pMEL13质粒、引物6006-Fv、6005-Rw的反应体系在98.0℃预变性30s，98.0℃变性10s，67℃退火15s，72℃延伸6min10s，上述过程进行35个循环后，于4℃保存。PCR 完成后，用Quick CutTM Dpn I快切酶(TAKARA公司)在37℃处理2h以消化质粒模板。最后在1％琼脂糖凝胶上上样，在50V电压条件下进行凝胶电泳，用胶纯化回收试剂盒(Omega公司)切胶回收获得线型骨架，骨架长度为6110bp，命名为pMEL13-backbone；

(6)设计识别HXT3基因的gRNA片段以及合成HXT3突变DNA双链片段：根据公开在2014年Jeroen G Nijland等人报道的一篇文献中，该文献名称为：通过基因工程手段将内源性己糖转运蛋白转化为一种特异性D-木糖转运蛋白以促进酿酒酵母共消耗葡萄糖-木糖；作者有：Jeroen G Nijland,Hyun Yong Shin,Ren é M de Jong,Paul P de Waal,PaulKlaassen and Arnold JM Driessen；公开的刊物为：Biotechnology for Biofuels(生物能源生物技术杂志)2014，7：168，将文中的相关转运子的氨基酸位点突变作为参考，我们将转运蛋白HXT3进行单突变 (N367A)，即367位的氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸。然后在网站 http://yeastriction.tnw.tudelft.nl上，以模式酵母S288c为基准，可在线设计HXT3编码区验证引物HXT3-dg-Fw(SEQ ID NO.7)和HXT3-dg-Rv(SEQ ID NO.8)。并通过参考PAM(NGG)距离突变位点的远近，gRNA靶位点序列GC碱基比大于65％的原则，设计识别HXT3基因的gRNA片段以及该片段命名为 M-HXT3-gRNA(SEQ ID NO.9)。然后以SEB6基因组DNA为模板，HXT3-dg-Fw、 HXT3-dg-Rv为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系50μl组成如下：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10μl；dNTP Mixture(各2.5mM)4μl；引物HXT3-dg-Fw、HXT3-dg-Rv各10μM，0.5μl；PrimeSTAR HS DNA polymerase(5U/μl)0.5μl；SEB6基因组DNA 50ng；以灭菌双蒸水补加至50μ l。PCR扩增程序为：将上述50μl反应体系在98.0℃预变性30s，98.0℃变性10s，67℃退火15s，72℃延伸1min 50s，上述过程进行30个循环后，于 4℃保存，获得HXT3基因片段，并用引物HXT3-Mdg-F(SEQ ID NO.10)于擎科生物技术有限公司(成都)进行测序。然后依照测序的HXT3基因片段设计出 HXT3单突变修复重组片段144bp，该片段命名为M-HXT3-repair(SEQ ID NO.11),并在生工生物工程(上海)股份有限公司订购合成双链；

(7)构建pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒：根据NEB公司的Gibson Assembly (Gibson连接)操作说明稍作更改，以下列反应体系构建 pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒。反应体系5μl组成如下：Gibson Mix(2×)2.5μ l；pMEL13-backbone(6110bp)0.025pmol；M-HXT3-gRNA(144bp)，0.125pmol；以灭菌双蒸水补加至5μl。反应程序为：将上述5μl反应体系在50℃温浴 15min后全部用于做大肠杆菌转化实验，该转化方法为本行业常规技术手段，因此在此不再赘述。将转化的菌落在含有卡那霉素的LB培养基上生长，并于5mL LB/kana培养基过夜培养，根据生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒。并于擎科生物技术有限公司(成都)进行测序，测序引物为pMEL13-cxF(SEQ ID NO.12)，并与设计的M-HXT3-gRNA序列相比对，确认正确的转化子。

(8)利用CRISPR/Cas9***突变HXT3基因：将现有质粒pMEL13-M-HXT3-gRNA(600ng)以及重组修复片段M-HXT3-repair(1.6μg)通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母SEB6kan-Cas9菌株中，在含有G418以及诺尔斯菌素的2％YPD平板中筛选菌落形态完好的阳性转化子；

(9)测序筛选HXT3突变菌株：以上述步骤中提取的转化子基因组DNA为模板，HXT3-dg-Fw，HXT3-dg-Rv为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系25 μl组成如下：10×PCR Buffer(Mg2+plus)10μl；dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl；引物HXT3-dg-Fw，HXT3-dg-Rv各10μM，0.5μl；TaKaRa Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.5μl；转化子DNA 30-50ng；以灭菌双蒸水补加至25μl。PCR扩增程序为：将上述25μl反应体系在95.0℃预变性4min，95.0℃变性 30s，52℃退火30s，72℃延伸1min 50s，上述过程进行30个循环后，于4℃保存。获得的基因片段用HXT3-Mdg-F为引物于擎科生物技术有限公司(成都) 进行测序，与设计的M-HXT3-repair序列进行比对，以筛选正确的转化子；

(10)脱除Cas9-NAT质粒以及pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒：针对上述步骤的阳性转化子，在营养丰富的YPD培养基中30℃，160rpm进行试管过夜培养，稀释一定倍数后，涂布于YPD平板上。之后挑取单菌落分别于YPD平板， YPD/G418平板，YPD/NAT平板上，于30℃静置培养2-3天，选取在YPD上生长，而不在含有抗性平板上生长的菌落再次重复这样的筛选，最终得到的菌株即为不含Cas9-NAT质粒以及pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒的菌株；

(11)试管发酵筛选高木糖消耗率SEB6kan-M-HXT3菌株：从上述步骤中得到的菌株于35℃，140rpm条件下，利用YPDX(10g/L Yeast Extract酵母浸出粉、20g/L Peptone蛋白胨、40g/LD-Xylose木糖，60g/L glucose葡萄糖)进行试管发酵，根据发酵结果筛选出一株高木糖消耗菌株；

利用管发酵筛选高木糖消耗率SEB6kan-M-HXT3菌株的结果如表2所示：

表2 试管发酵筛选高木糖消耗率SEB6kan-M-HXT3菌株

根据表2的结果可知：酿酒酵母菌株编号为M5的木糖消耗速率最快，发酵生产木糖醇的性能优越，收率可达到理论值1.0，与出发菌株SEB6kan相比，木糖消耗速率提高80.6％，木糖醇产量提高93.5％，记M5为SEB10。

(12)发酵罐评价：用上述步骤中筛选出的一株菌与出发菌株作比较，将这两株接种于2％YPD平板，30℃恒温箱内培养1d；预培养：将活化后的菌株接种于含100ml 2％YPD液体培养基的锥形瓶(规格500mL)中，30℃160rpm 过夜培养16h。发酵：按照干重为0.5g/L接种于1L发酵罐中在35℃，300rpm，曝气率0.13vvm条件下，利用工作体积为600mL的YPDX(10g/LYeast Extract 酵母浸出粉、20g/LPeptone蛋白胨、45g/L D-Xylose木糖，60g/Lglucose葡萄糖)进行发酵，8h后，补加600g/L的葡萄糖溶液，补加速率为1mL/h。采样时间分别为0h，3h，8h，20h，24h，28h，32h以及48h，56h，72h每个采样点采样5ml；

(13)发酵参数的测定：评价菌株生长情况是在紫外分光光度计600nm处测600nm的吸光度值记为OD600，通过OD600与载体酿酒酵母菌株干重的关系，计算出重组酵母干重；通过气象色谱仪GC(353B)(GL Science Inc.公司)测出乙醇含量，通过HPLC(SHIMADZU)液相色谱仪测出葡萄糖、木糖以及木糖醇的含量。

(14)计算相关代谢参数：通过计算消耗的木糖以及产生的木糖醇的数据，计算木糖消耗率以及木糖醇的产率；筛选出木糖消耗速率最快的菌株作为最优菌株。由上述实施例可知，本发明利用CRISPR/Cas9***敲除XKS1基因构建了能高效产木糖醇的工业酿酒酵母菌株，其与出发菌株相比，能有效提高木糖醇的收率和木糖醇产量，该菌株具有良好的应用前景。

出发菌株SEB6kan发酵罐发酵和HXT3(N367A)突变菌株SEB10发酵罐发酵的发酵示意图分别如图1和图2所示，两者的发酵罐发酵木糖醇产率比较如表3所示：

表3 发酵罐发酵木糖醇产率比较

根据图1，图2以及表3的结果可知：通过基因工程将转运蛋白HXT3的367 位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，所构建的酿酒酵母菌株SEB10在以初始高浓度葡萄糖与木糖的混合发酵中，与出发菌株SEB6kan相比，木糖消耗速率提高了约12％，木糖醇乙醇产量均有所提升，木糖醇产量提升了13％，乙醇产量提升了22.3％。木糖醇收率可接近理论值1.0。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中石化上海工程有限公司

<120> 一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10447

<212> DNA

<213> Cas9-NAT质粒(人工序列)

<400> 1

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgga tcgcttgcct gtaacttaca cgcgcctcgt atcttttaat gatggaataa 120

tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt ttatgttttg tatttggatt ttagaaagta 180

aataaagaag gtagaagagt tacggaatga agaaaaaaaa ataaacaaag gtttaaaaaa 240

tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata tttattagac aagaaaagca gattaaatag 300

atatacattc gattaacgat aagtaaaatg taaaatcaca ggattttcgt gtgtggtctt 360

ctacacagac aagatgaaac aattcggcat taatacctga gagcaggaag agcaagataa 420

aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga gtcttttaca tcttcggaaa acaaaaacta 480

ttttttcttt aatttctttt tttactttct atttttaatt tatatattta tattaaaaaa 540

tttaaattat aattattttt atagcacgtg atgaaaagga cccaggtggc acttttcggg 600

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 660

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 720

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 780

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 840

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 900

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 960

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 1020

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 1080

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 1140

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 1200

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 1260

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 1320

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 1380

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 1440

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 1500

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 1560

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 1620

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 1680

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 1740

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 1800

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 1860

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 1920

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 1980

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 2040

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2100

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2160

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 2220

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 2280

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2340

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 2400

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 2460

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 2520

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 2580

ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tacctcactc 2640

attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcc tatgttgtgt ggaattgtga 2700

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta 2760

accctcacta aagggaacaa aagctggagc tcatagcttc aaaatgtttc tactcctttt 2820

ttactcttcc agattttctc ggactccgcg catcgccgta ccacttcaaa acacccaagc 2880

acagcatact aaatttcccc tctttcttcc tctagggtgt cgttaattac ccgtactaaa 2940

ggtttggaaa agaaaaaaga gaccgcctcg tttctttttc ttcgtcgaaa aaggcaataa 3000

aaatttttat cacgtttctt tttcttgaaa attttttttt tgattttttt ctctttcgat 3060

gacctcccat tgatatttaa gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat 3120

ttttcttgtt ctattacaac tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat 3180

ctaatctaag ttttctagaa ctagtggatc ccccgggaaa aatggacaag aagtactcca 3240

ttgggctcga tatcggcaca aacagcgtcg gttgggccgt cattacggac gagtacaagg 3300

tgccgagcaa aaaattcaaa gttctgggca ataccgatcg ccacagcata aagaagaacc 3360

tcattggcgc cctcctgttc gactccgggg agacggccga agccacgcgg ctcaaaagaa 3420

cagcacggcg cagatatacc cgcagaaaga atcggatctg ctacctgcag gagatcttta 3480

gtaatgagat ggctaaggtg gatgactctt tcttccatag gctggaggag tcctttttgg 3540

tggaggagga taaaaagcac gagcgccacc caatctttgg caatatcgtg gacgaggtgg 3600

cgtaccatga aaagtaccca accatatatc atctgaggaa gaagcttgta gacagtactg 3660

ataaggctga cttgcggttg atctatctcg cgctggcgca tatgatcaaa tttcggggac 3720

acttcctcat cgagggggac ctgaacccag acaacagcga tgtcgacaaa ctctttatcc 3780

aactggttca gacttacaat cagcttttcg aagagaaccc gatcaacgca tccggagttg 3840

acgccaaagc aatcctgagc gctaggctgt ccaaatcccg gcggctcgaa aacctcatcg 3900

cacagctccc tggggagaag aagaacggcc tgtttggtaa tcttatcgcc ctgtcactcg 3960

ggctgacccc caactttaaa tctaacttcg acctggccga agatgccaag cttcaactga 4020

gcaaagacac ctacgatgat gatctcgaca atctgctggc ccagatcggc gaccagtacg 4080

cagacctttt tttggcggca aagaacctgt cagacgccat tctgctgagt gatattctgc 4140

gagtgaacac ggagatcacc aaagctccgc tgagcgctag tatgatcaag cgctatgatg 4200

agcaccacca agacttgact ttgctgaagg cccttgtcag acagcaactg cctgagaagt 4260

acaaggaaat tttcttcgat cagtctaaaa atggctacgc cggatacatt gacggcggag 4320

caagccagga ggaattttac aaatttatta agcccatctt ggaaaaaatg gacggcaccg 4380

aggagctgct ggtaaagctt aacagagaag atctgttgcg caaacagcgc actttcgaca 4440

atggaagcat cccccaccag attcacctgg gcgaactgca cgctatcctc aggcggcaag 4500

aggatttcta cccctttttg aaagataaca gggaaaagat tgagaaaatc ctcacatttc 4560

ggatacccta ctatgtaggc cccctcgccc ggggaaattc cagattcgcg tggatgactc 4620

gcaaatcaga agagaccatc actccctgga acttcgagga agtcgtggat aagggggcct 4680

ctgcccagtc cttcatcgaa aggatgacta actttgataa aaatctgcct aacgaaaagg 4740

tgcttcctaa acactctctg ctgtacgagt acttcacagt ttataacgag ctcaccaagg 4800

tcaaatacgt cacagaaggg atgagaaagc cagcattcct gtctggagag cagaagaaag 4860

ctatcgtgga cctcctcttc aagacgaacc ggaaagttac cgtgaaacag ctcaaagaag 4920

actatttcaa aaagattgaa tgtttcgact ctgttgaaat cagcggagtg gaggatcgct 4980

tcaacgcatc cctgggaacg tatcacgatc tcctgaaaat cattaaagac aaggacttcc 5040

tggacaatga ggagaacgag gacattcttg aggacattgt cctcaccctt acgttgtttg 5100

aagataggga gatgattgaa gaacgcttga aaacttacgc tcatctcttc gacgacaaag 5160

tcatgaaaca gctcaagagg cgccgatata caggatgggg gcggctgtca agaaaactga 5220

tcaatgggat ccgagacaag cagagtggaa agacaatcct ggattttctt aagtccgatg 5280

gatttgccaa ccggaacttc atgcagttga tccatgatga ctctctcacc tttaaggagg 5340

acatccagaa agcacaagtt tctggccagg gggacagtct tcacgagcac atcgctaatc 5400

ttgcaggtag cccagctatc aaaaagggaa tactgcagac cgttaaggtc gtggatgaac 5460

tcgtcaaagt aatgggaagg cataagcccg agaatatcgt tatcgagatg gcccgagaga 5520

accaaactac ccagaaggga cagaagaaca gtagggaaag gatgaagagg attgaagagg 5580

gtataaaaga actggggtcc caaatcctta aggaacaccc agttgaaaac acccagcttc 5640

agaatgagaa gctctacctg tactacctgc agaacggcag ggacatgtac gtggatcagg 5700

aactggacat caatcggctc tccgactacg acgtggatca tatcgtgccc cagtcttttc 5760

tcaaagatga ttctattgat aataaagtgt tgacaagatc cgataaaaat agagggaaga 5820

gtgataacgt cccctcagaa gaagttgtca agaaaatgaa aaattattgg cggcagctgc 5880

tgaacgccaa actgatcaca caacggaagt tcgataatct gactaaggct gaacgaggtg 5940

gcctgtctga gttggataaa gccggcttca tcaaaaggca gcttgttgag acacgccaga 6000

tcaccaagca cgtggcccaa attctcgatt cacgcatgaa caccaagtac gatgaaaatg 6060

acaaactgat tcgagaggtg aaagttatta ctctgaagtc taagctggtc tcagatttca 6120

gaaaggactt tcagttttat aaggtgagag agatcaacaa ttaccaccat gcgcatgatg 6180

cctacctgaa tgcagtggta ggcactgcac ttatcaaaaa atatcccaag cttgaatctg 6240

aatttgttta cggagactat aaagtgtacg atgttaggaa aatgatcgca aagtctgagc 6300

aggaaatagg caaggccacc gctaagtact tcttttacag caatattatg aattttttca 6360

agaccgagat tacactggcc aatggagaga ttcggaagcg accacttatc gaaacaaacg 6420

gagaaacagg agaaatcgtg tgggacaagg gtagggattt cgcgacagtc cggaaggtcc 6480

tgtccatgcc gcaggtgaac atcgttaaaa agaccgaagt acagaccgga ggcttctcca 6540

aggaaagtat cctcccgaaa aggaacagcg acaagctgat cgcacgcaaa aaagattggg 6600

accccaagaa atacggcgga ttcgattctc ctacagtcgc ttacagtgta ctggttgtgg 6660

ccaaagtgga gaaagggaag tctaaaaaac tcaaaagcgt caaggaactg ctgggcatca 6720

caatcatgga gcgatcaagc ttcgaaaaaa accccatcga ctttctcgag gcgaaaggat 6780

ataaagaggt caaaaaagac ctcatcatta agcttcccaa gtactctctc tttgagcttg 6840

aaaacggccg gaaacgaatg ctcgctagtg cgggcgagct gcagaaaggt aacgagctgg 6900

cactgccctc taaatacgtt aatttcttgt atctggccag ccactatgaa aagctcaaag 6960

ggtctcccga agataatgag cagaagcagc tgttcgtgga acaacacaaa cactaccttg 7020

atgagatcat cgagcaaata agcgaattct ccaaaagagt gatcctcgcc gacgctaacc 7080

tcgataaggt gctttctgct tacaataagc acagggataa gcccatcagg gagcaggcag 7140

aaaacattat ccacttgttt actctgacca acttgggcgc gcctgcagcc ttcaagtact 7200

tcgacaccac catagacaga aagcggtaca cctctacaaa ggaggtcctg gacgccacac 7260

tgattcatca gtcaattacg gggctctatg aaacaagaat cgacctctct cagctcggtg 7320

gagacagcag ggctgacccc aagaagaaga ggaaggtgtg atctcttctc gagtcatgta 7380

attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca tccgctctaa ccgaaaagga 7440

aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt tttatagtta tgttagtatt 7500

aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacagacgcg tgtacgcatg 7560

taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg ctttaatttg 7620

cggccggtac ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg cgcgctcact ggccgtcgtt 7680

ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 7740

ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 7800

ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg 7860

ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct 7920

ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 7980

cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 8040

gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 8100

acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 8160

cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta 8220

aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca 8280

atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcataggca 8340

agtgcacaaa caatacttaa ataaatacta ctcagtaata acctatttct tagcattttt 8400

gacgaaattt gctattttgt tagagtcttt tacaccattt gtctccacac ctccgcttac 8460

atcaacacca ataacgccat ttaatctaag cgcatcacca acattttctg gcgtcagtcc 8520

accagctaac ataaaatgta agctttcggg gctctcttgc cttccaaccc agtcagaaat 8580

cgagttccaa tccaaaagtt cacctgtccc acctgcttct gaatcaaaca agggaataaa 8640

cgaatgaggt ttctgtgaag ctgcactgag tagtatgttg cagtcttttg gaaatacgag 8700

tcttttaata actggcaaac cgaggaactc ttggtattct tgccacgact catctccatg 8760

cagttggacg atatcaatgc cgtaatcatt gaccagagcc aaaacatcct ccttaggttg 8820

attacgaaac acgccaacca agtatttcgg agtgcctgaa ctatttttat atgcttttac 8880

aagacttgaa attttccttg caataaccgg gtcaattgcg ttttcgacac tggatggcgg 8940

cgttagtatc gaatcgacag cagtatagcg accagcattc acatacgatt gacgcatgat 9000

attactttct gcgcacttaa cttcgcatct gggcagatga tgtcgaggcg aaaaaaaata 9060

taaatcacgc taacatttga ttaaaataga acaactacaa tataaaaaaa ctatacaaat 9120

gacaagttct tgaaaacaag aatcttttta ttgtcagtac tgattagggg cagggcatgc 9180

tcatgtagag cgcctgctcg ccgtccgagg cggtgccgtc gtacagggcg gtgtccaggc 9240

cgcagagggt gaaccccatc cgccggtacg cgtggatcgc cggtgcgttg acgttggtga 9300

cctccagcca gaggtgcccg gcgccccgct cgcgggcgaa ctccgtcgcg agccccatca 9360

acgcgcgccc gaccccgtgc ccccggtgct ccggggcgac ctcgatgtcc tcgacggtca 9420

gccggcggtt ccagccggag tacgagacga ccacgaagcc cgccaggtcg ccgtcgtccc 9480

cgtacgcgac gaacgtccgg gagtccgggt cgccgtcctc cccgtcgtcc gattcgtcgt 9540

ccgattcgtc gtcggggaac accttggtca ggggcgggtc caccggcacc tcccgcaggg 9600

tgaagccgtc cccggtggcg gtgacgcgga agacggtgtc ggtggtgaag gacccatcca 9660

gtgcctcgat ggcctcggcg tcccccggga cactggtgcg gtaccggtaa gccgtgtcgt 9720

caagagtggt acccatggtt gtttatgttc ggatgtgatg tgagaactgt atcctagcaa 9780

gattttaaaa ggaagtatat gaaagaagaa cctcagtggc aaatcctaac cttttatatt 9840

tctctacagg ggcgcggcgt ggggacaatt caacgcgtct gtgaggggag cgtttccctg 9900

ctcgcaggtc tgcagcgagg agccgtaatt tttgcttcgc gccgtgcggc catcaaaatg 9960

tatggatgca aatgattata catggggatg tatgggctaa atgtacgggc gacagtcaca 10020

tcatgcccct gagctgcgca cgtcaagact gtcaaggagg gtattctggg cctccatgtc 10080

gctggccggg tgacccggcg gggacaaggc aagctaaaca gatctacgta aggtgacaag 10140

ctatttttca ataaagaata tcttccacta ctgccatctg gcgtcataac tgcaaagtac 10200

acatatatta cgatgctgtt ctattaaatg cttcctatat tatatatata gtaatgtcgt 10260

ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac 10320

ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 10380

caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 10440

cgcgcga 10447

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Cas9-dg-F引物(人工序列)

<400> 2

tcacccttac gttgtttgaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Cas9-dg-R引物(人工序列)

<400> 3

aggggacgtt atcactcttc 20

<210> 4

<211> 6130

<212> DNA

<213> pMEL13质粒(人工序列)

<400> 4

acaggcaaca cgcagatata ggtgcgacgt gaacagtgag ctgtatgtgc gcagctcgcg 60

ttgcattttc ggaagcgctc gttttcggaa acgctttgaa gttcctattc cgaagttcct 120

attctctaga aagtatagga acttcagagc gcttttgaaa accaaaagcg ctctgaagac 180

gcactttcaa aaaaccaaaa acgcaccgga ctgtaacgag ctactaaaat attgcgaata 240

ccgcttccac aaacattgct caaaagtatc tctttgctat atatctctgt gctatatccc 300

tatataacct acccatccac ctttcgctcc ttgaacttgc atctaaactc gacctctaca 360

ttttttatgt ttatctctag tattactctt tagacaaaaa aattgtagta agaactattc 420

atagagtgaa tcgaaaacaa tacgaaaatg taaacatttc ctatacgtag tatatagaga 480

caaaatagaa gaaaccgttc ataattttct gaccaatgaa gaatcatcaa cgctatcact 540

ttctgttcac aaagtatgcg caatccacat cggtatagaa tataatcggg gatgccttta 600

tcttgaaaaa atgcacccgc agcttcgcta gtaatcagta aacgcgggaa gtggagtcag 660

gcttttttta tggaagagaa aatagacacc aaagtagcct tcttctaacc ttaacggacc 720

tacagtgcaa aaagttatca agagactgca ttatagagcg cacaaaggag aaaaaaagta 780

atctaagatg ctttgttaga aaaatagcgc tctcgggatg catttttgta gaacaaaaaa 840

gaagtataga ttctttgttg gtaaaatagc gctctcgcgt tgcatttctg ttctgtaaaa 900

atgcagctca gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt ttgttttaca 960

aaaatgaagc acagattctt cgttggtaaa atagcgcttt cgcgttgcat ttctgttctg 1020

taaaaatgca gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg catttttgtt 1080

ctacaaaatg aagcacagat gcttcgttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 1140

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 1200

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 1260

gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 1320

ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 1380

gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 1440

agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 1500

caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 1560

gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 1620

agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 1680

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 1740

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 1800

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 1860

tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 1920

tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 1980

gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 2040

atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 2100

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 2160

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 2220

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 2280

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 2340

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 2400

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 2460

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 2520

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 2580

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 2640

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 2700

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 2760

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 2820

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 2880

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 2940

gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 3000

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 3060

cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 3120

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttacc tcactcatta ggcaccccag 3180

gctttacact ttatgcttcc ggctcctatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 3240

cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg 3300

gaacaaaagc tggagcttct ttgaaaagat aatgtatgat tatgctttca ctcatattta 3360

tacagaaact tgatgttttc tttcgagtat atacaaggtg attacatgta cgtttgaagt 3420

acaactctag attttgtagt gccctcttgg gctagcggta aaggtgcgca ttttttcaca 3480

ccctacaatg ttctgttcaa aagattttgg tcaaacgctg tagaagtgaa agttggtgcg 3540

catgtttcgg cgttcgaaac ttctccgcag tgaaagataa atgatcgata cgttctctat 3600

ggaggagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 3660

aaaagtggca ccgagtcggt ggtgcttttt ttgtttttta tgtcttcgag tcatgtaatt 3720

agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg 3780

agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 3840

aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa 3900

cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcgg 3960

ccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc cgtcgtttta 4020

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 4080

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 4140

cgcagcctga atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4200

gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4260

gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4320

gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4380

tagggtgatg gttcacgtag tgggccgttg aacattctta ggctggtcga atcatttaga 4440

cacgggcatc gtcctctcga aaggtggcat aggccactag tggatctgat atcacctaat 4500

aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atattaaggg ttctcgagag ctcgttttcg 4560

acactggatg gcggcgttag tatcgaatcg acagcagtat agcgaccagc attcacatac 4620

gattgacgca tgatattact ttctgcgcac ttaacttcgc atctgggcag atgatgtcga 4680

ggcgaaaaaa aatataaatc acgctaacat ttgattaaaa tagaacaact acaatataaa 4740

aaaactatac aaatgacaag ttcttgaaaa caagaatctt tttattgtca gtactgatta 4800

gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc 4860

atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag 4920

gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat 4980

taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga 5040

atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc 5100

attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc 5160

ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg 5220

caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc 5280

ttctaatacc tggaatgctg ttttgccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc 5340

aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag 5400

tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa 5460

ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt 5520

atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct 5580

cgaaacgtga gtcttttcct tacccatggt tgtttatgtt cggatgtgat gtgagaactg 5640

tatcctagca agattttaaa aggaagtata tgaaagaaga acctcagtgg caaatcctaa 5700

ccttttatat ttctctacag gggcgcggcg tggggacaat tcaacgcgtc tgtgagggga 5760

gcgtttccct gctcgcaggt ctgcagcgag gagccgtaat ttttgcttcg cgccgtgcgg 5820

ccatcaaaat gtatggatgc aaatgattat acatggggat gtatgggcta aatgtacggg 5880

cgacagtcac atcatgcccc tgagctgcgc acgtcaagac tgtcaaggag ggtattctgg 5940

gcctccatgt cgctggccgg gtgacccggc ggggacgagg caagctaaac agatctctag 6000

acctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata ttaagggttg tcgacctgca 6060

gcgtacgaag gtgcctattg atgatctggc ggaatgtctg ccgtgccata gccatgcctt 6120

cacatatagt 6130

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 6006-Fv引物(人工序列)

<400> 5

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 40

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 6005-Rw引物(人工序列)

<400> 6

gatcatttat ctttcactgc ggagaag 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> HXT3-dg-Fw HXT3编码区验证引物(人工序列)

<400> 7

tcggtcgcgg attatcacag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> HXT3-dg-Rv HXT3编码区验证引物(人工序列)

<400> 8

ggctcgaaaa tggttggtgg 20

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> M-HXT3-gRNA 识别HXT3基因的gRNA片段(人工序列)

<400> 9

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc ttgtacactg 60

tcgatcgttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> HXT3-Mdg-F 测序引物(人工序列)

<400> 10

gctttgttta tgatcggtgg 20

<210> 11

<211> 144

<212> DNA

<213> M-HXT3-repair HXT3单突变修复重组片段(人工序列)

<400> 11

gttggtatga gtgattcttt cgaaacttct attgttttcg gtgtcgtcgc cttcttctct 60

acttgttgtt ctttgtacac cgttgacaga ttcggacgtc gtaactgtct gttatatggt 120

gccgttggta tggtctgctg ttat 144

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> pMEL13-cxF 测序引物(人工序列)

<400> 12

acttgatgtt ttctttcgag 20

Claims (9)

1.一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株的转运蛋白HXT3的367位上的氨基酸天冬酰胺突变为丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的工业酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为SEB10，其分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.14777。

3.一株如权利要求1或2所述的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤a)选取出发菌株，所述出发菌株为絮凝性工业酵母SEB6，其保藏编号为CGMCCNo.11326；

步骤b)利用Cre-LoxP***敲除出发菌株的KanMX基因，构建SEB6kan菌株；

步骤c)利用CRISPR/Cas9***突变步骤b)所构建的SEB6kan菌株的HXT3基因，构建SEB6kan-M-HXT3菌株。

4.根据权利要求3所述的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，在步骤c)之后，还包括步骤d)筛选最优SEB6kan-M-HXT3菌株，并命名为SEB10。

5.根据权利要求3所述的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，步骤c)中构建SEB6kan-M-HXT3菌株的步骤包括：

步骤1)将Cas9-NAT质粒导入步骤b)构建的SEB6kan菌株，粗提酿酒酵母转化子基因组DNA并以该DNA作为模板进行PCR扩增，发酵筛选高产木糖醇的菌株，将该菌株命名为SEB6kan-Cas9菌株；

步骤2)以pMEL13质粒为模板，PCR扩增并切胶纯化回收PCR扩增产物，制得含gRNA的质粒线性骨架，命名为pMEL13-backbone；

步骤3)设计识别HXT3基因的gRNA片段以及HXT3单突变修复重组片段，分别命名为M-HXT3-gRNA、M-HXT3-repair；

步骤4)利用步骤2)制备的pMEL13-backbone和步骤3)设计的M-HXT3-gRNA构建pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒；

步骤5)将步骤4)构建的pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒和步骤3)设计的M-HXT3-repair转化到步骤1)制备的SEB6kan-Cas9菌株，利用CRISPR/Cas9***突变HXT3基因，并对HXT3突变菌株进行测序筛选，脱除Cas9-NAT质粒以及pMEL13-M-HXT3-gRNA质粒，构建SEB6kan-M-HXT3菌株。

6.根据权利要求5所述的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述Cas9-NAT质粒的序列如SEQ ID NO：1所示；扩增所述酿酒酵母转化子基因组DNA的引物序列如SEQ IDNO：2～SEQ ID NO：3所示；所述pMEL13质粒的序列如SEQ ID NO：4所示，其采用的引物序列如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6所示；所述M-HXT3-gRNA的序列如SEQ ID NO：9所示，所述M-HXT3-repair的序列如SEQ ID NO：11所示。

7.根据权利要求4所述的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤d)中筛选最优SEB6kan-M-HXT3菌株包括以下步骤：利用试管发酵筛选具有高木糖消耗率的SEB6kan-M-HXT3菌株，将该菌株进行培养发酵，并测定发酵参数，计算木糖消耗率以及木糖醇的产率，筛选出木糖消耗速率最快的菌株作为最优SEB6kan-M-HXT3菌株，并命名为SEB10。

8.根据权利要求7所述的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述发酵参数包括重组酵母干重、乙醇含量、葡萄糖含量、木糖含量以及木糖醇含量。

9.根据权利要求2所述的工业酿酒酵母菌株在木糖醇及乙醇生产中的应用。