CN110873774A

CN110873774A - 一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法

Info

Publication number: CN110873774A
Application number: CN201811007796.8A
Authority: CN
Inventors: 董光明; 杜双喜; 郝津芳; 许信学; 李廷灵; 侯文林
Original assignee: Huakang Pharmaceutical Co Ltd Shanxi
Current assignee: Huakang Pharmaceutical Co Ltd Shanxi
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN110873774B

Abstract

一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，涉及指纹图谱建立方法技术领域，具体方法包含以下步骤：步骤一、供试品的制备，对照品溶液的制备，测定方法，吸取对照品溶液和供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，将供试品和混合对照品溶液的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》软件，经数据匹配，生成对照指纹图谱。本发明所提供的方法所建立的止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱，能有效的表征止嗽立效丸的质量，有利于全面监控药物的质量。且本发明的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

Description

一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法

技术领域

本发明涉及一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，具体为指纹图谱检测建立方法技术领域。

背景技术

止嗽立效丸在中医和西医临床上均应用广泛，为国家四类中药新药，服用方便，安全，释放快，吸收快，起效快。对于所有因风寒而引起的呼吸***疾病，风寒咳嗽、咯血、痰多、胸闷、胸痛、喘息等证状，均有明显的治疗效果。是治疗风寒咳嗽的理想用药。

中药指纹图谱是国际公认的控制中药质量的一种研究模式和技术平台，它通过分析中药有效成分和无效成分的种类和含量分布信息，使中药的研究方法和质量分析手段由针对一个或者少数几个活性成分的分析，发展为对整个中药化学指纹图谱的综合分析，具有普适性和经济性。中药指纹图谱反映了中药多成分协同作用、多层次复杂性及整体性。

止嗽立效丸组方中共有多种中药药材，必须对它的物质群整体予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体上有效的表征中药质量。所以建立一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱方法势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法。

本发明止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，具体方法包含以下步骤：步骤一、供试品的制备，准确称取止嗽立效丸药材粉末0.50g，置具塞锥形瓶中，准确加入80％的甲醇水溶液10ml，其中甲醇水溶液中含0.5％磷酸，盖塞，称重，超声提取30分钟，冷却，称重，以提取溶剂补足失重，过滤，续滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品；

步骤二、对照品溶液的制备，准确称取麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、罂粟碱和甘草酸单铵盐对照品约1.0mg，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，进HPLC之前经0.22μm微孔滤膜过滤；

步骤三、测定方法，吸取对照品溶液和供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，将供试品和混合对照品溶液的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》软件，经数据匹配，生成对照指纹图谱。

作为优选，所述的高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.1％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为0-24分钟，210nm；24-42分钟，250nm；42-78分钟，210nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/分钟；进样量为15μl，理论板数按甘草酸单铵盐峰计算应不低于20000。

作为优选，所述的梯度洗脱方式为

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明所提供的方法所建立的止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱，能有效的表征止嗽立效丸的质量，有利于全面监控药物的质量。且本发明的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

附图说明

图1为实施例中12批样品批号图；

图2为实施例中供试品2小时后色谱图；

图3为实施例中12批样品匹配后HPLC色谱图；

图4为实施例中12批样品共有峰面积匹配结果图；

图5为实施例中参照物HPLC色谱图；

图6为实施例中供试品图谱共有峰面积的比值图；

图7为实施例中供试品与指纹图谱各共有峰面积比值的差值图；

图8为实施例中12批样品相似度评价结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本具体实施方式一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，具体方法为：步骤一、供试品的制备，准确称取止嗽立效丸药材粉末0.50g，置具塞锥形瓶中，准确加入80％的甲醇水溶液10ml，其中甲醇水溶液中含0.5％磷酸，盖塞，称重，超声提取30分钟，冷却，称重，以提取溶剂补足失重，过滤，续滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品；

其中，梯度洗脱方式为

实施例：一、批量止嗽立效丸指纹图谱的相似度评价：止嗽立效丸药材样品共12批，批号见图1。

将供试品的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》软件，以S1为参照图谱，剪切前5分钟溶剂峰后，对12批样品(S1-S12)的色谱图进行数据匹配，采用平均数法生成对照图谱(R)。

将检测时间设置为120分钟，流动相梯度设定为76-120分钟：96％乙腈，记录2小时以内色谱图，结果见图2。由图2可见，色谱图在78分钟之后没有出现新的色谱峰。

共有指纹峰的标定，选择对照品甘草酸单铵盐(S)为参照物，以其保留时间为1，计算指纹峰的相对保留时间。根据12批样品的检测结果，选择稳定性较好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰。积分参数选择斜率灵敏度为5，峰宽为0.05，最小峰面积为500。结果共标定23个共有指纹峰，12批样品匹配后色谱图见图3，共有峰面积匹配数据见图4。结果显示，供试品共有峰相对保留时间RSD<1.0％。

供试品指纹图谱中分别呈现了与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰见图5，各参照物色谱峰保留时间分别为：1.麻黄碱7.53分钟，2.苦杏仁苷12.31分钟，3.甘草苷23.04分钟，4.罂粟碱27.81分钟，5.甘草酸单铵盐40.57分钟。样品图谱图2中峰3为麻黄碱，峰6为苦杏仁苷，峰11为甘草苷，峰13为罂粟碱，峰14为甘草酸单铵盐。

共有峰面积的比值，以甘草酸单铵盐峰面积为l，计算供试品共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值见图6，并比较供试品图谱中各共有峰面积比值和指纹图谱各共有峰面积比值的差值，结果见图7，计算公式如下：

由结果可见，单峰面积占总峰面积大于等于10％而小于20％的共有峰，其差值均小于±25％(符合《注射用中药材指纹图谱研究的技术要求》)；而单峰面积占总峰面积大于等于5％而大于10％的共有峰，其差值均小于±30％(符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》)。

非共有峰面积，12批供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比见表3，与对照指纹图谱比较，非共有峰面积占总峰面积比值小于10％。

相似度评价，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》，对12批供试品的色谱图进行相似度评价，结果见图8。结果表明，12批供试品的相似度在0.966-0.999之间，表明12批供试品具有较高的相似度。

二、供试品制备方法的考察：提取方式的考察，常用提取方式有回流提取、浸渍提取、超声提取、索氏提取等，因索氏提取操作繁琐，因此本试验考察了前3种方式，即在其他条件相同的情况下，分别选择回流提取30分钟、浸渍提取12小时和超声提取30分钟，其他操作见“1.供试品的制备”。结果显示，回流提取色谱峰面积明显小于其他二者，而浸提与超声提取峰面积差异不明显，但浸提耗费时间过长、效率低，因此选择超声提取方式。

提取溶剂的考察，分别考察了1％磷酸水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、含5％氨水的氯仿、石油醚以及石油醚脱脂后甲醇提取的效果。结果表明，甲醇提取物的色谱峰最多，1％磷酸水提取物只有前30分钟的色谱峰；乙酸乙酯提取物只有40分钟以后的色谱峰，氯仿提取物在前35分钟只有2个色谱峰；乙醇前40分钟色谱峰很少且峰面积很小；石油醚提取物中只有65分钟以后的色谱峰，而石油醚脱脂后的甲醇提取物65分钟以后的峰面积虽然明显减小，但仍有明显的峰。综上，我们选择提取峰最多的甲醇作为提取溶剂，并进一步考察了不同浓度甲醇的提取效果。

经预实验考察发现含有一定浓度水的甲醇提取效果更好且基线较平稳，因此分别考察了不同浓度甲醇的提取效果，包括30％、60％、70％、80％和90％。由结果得知，随着甲醇浓度的升高，强极性成分峰面积减小而弱极性峰面积增大。经色谱峰数据匹配，比较总峰面积。结果表明，80％甲醇提取物前后峰大小分布相对一致且总峰面积最大，因此选择80％甲醇作为提取溶剂。

提取溶剂加酸种类和浓度的考察，分别考察了提取溶剂中加入1％盐酸、1％冰醋酸和1％磷酸的提取效果。结果发现，溶剂中加入1％盐酸时，可能酸性较强导致某些成分发生了酸解而在73min后新增2个色谱峰。而加入1％冰醋酸的提取效果与1％磷酸相似，但前20min组分色谱峰峰型较差，因此加入磷酸效果较好。进一步考察了提取溶剂中加入磷酸的浓度，分别为0.2％、0.5％、1.0％和1.5％。结果显示，当磷酸浓度为0.2％时提取物中碱性指标成分的如罂粟碱、甘草酸单铵盐等峰面积会明显减小，而其他3个浓度提取效果无明显差异。因此，在不影响指标成分含量的前提下，选择低浓度的0.5％磷酸以保护色谱柱。

提取时间的考察，分别考察了超声提取时间20分钟、30分钟、40分钟提取情况。结果发现，三者提取效果较为接近，而超声30分钟提取的总峰面积最大，因此选择超声时间为30分钟。

参照物的制备，参照物的选择和试验样品制备主要依据《中国药典》2015版第一部中各单味药材的含量测定指标，以及相关参考文献。

供试品检测方法的考察，流动相组成的考察，分别考察了(1)0.1％甲酸-乙腈、(2)0.1％冰醋酸-乙腈、(3)0.1％磷酸-乙腈、(4)水-乙腈、(5)0.1％磷酸-甲醇5种流动相体系的色谱图出峰情况。结果显示，在210nm时，(1)、(2)和(5)体系都出现了较严重的基线漂移，而在254nm时，各体系基线均较好。但(4)体系因不含酸，导致出峰时间为7分钟的色谱峰(经指认为盐酸麻黄碱，210nm)和出峰时间为40分钟的最高峰(经指认为甘草酸单铵盐，254nm)未出峰，而其他4种体系的流动相中均有此2峰。因此，选择(3)即0.1％磷酸-乙腈体系为流动相。

检测波长的考察，分别考察了210nm、237nm、254nm、320nm、360nm波长的出峰情况。结果显示，在210nm下，供试品溶液色谱峰最多，色谱峰的分离情况较好，信号较强，因此选择210nm作为主要检测波长；经对照品全波长扫描发现，罂粟碱和甘草酸单铵盐的最大吸收波长为250nm，因此采取210nm和250nm切换波长的方式进行检测，即检测波长设定为：0～24分钟，210nm；24～42分钟，250nm；42～78分钟，210nm。

稳定性试验，取同一供试品溶液分别于制备后0、2、6、10、24、48小时进行测定，记录指纹图谱，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值。结果表明，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰的相对保留时间RSD小于1％，相对峰面积的RSD小于3％。测得的5份供试品色谱指纹图谱直观观察全貌无明显变化。将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》，进行相似度评价。结果表明各供试品指纹图谱的相似度均大于0.98，表明样品在48小时内稳定性良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

精密度试验，精密吸取同一供试品溶液(批号Q201711103)15μl，连续测定5次，记录色谱图。以甘草酸单铵盐为参照物峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积比值，并计算其RSD值。结果表明，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰相对保留时间RSD小于1％，相对峰面积的RSD小于3％。测得的5份供试品色谱指纹图谱直观观察全貌无明显变化。将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》，进行相似度评价。结果表明，各供试品指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

重现性试验，称取同一批供试品药材粉末平行制备5份供试品溶液，经HPLC测定，记录色谱图。以甘草酸单铵盐为参照物峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积比值，并计算其RSD值。结果表明，单峰面积大于总峰面积5％的共有峰相对保留时间RSD小于1％，相对峰面积的RSD小于3％。测得的5份供试品色谱指纹图谱直观全貌无明显变化。将数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》，进行相似度评价。结果表明，各供试品指纹图谱的相似度均大于0.98，表明方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

耐用性试验，分别选用①美国安捷伦ZORBAX SBC18色谱柱(5μm，4.6×250mm)、②上海安谱Athena C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)和③上海月旭Ultinate XB C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)进行耐用性考察，其中①②号为新色谱柱，③号为旧色谱柱。结果显示，三支色谱柱在保留时间和色谱峰分离上稍有差异，①②号色谱柱出峰情况一致，各峰分离情况良好，基线平稳，且柱效较高。③号柱中2、3号相邻峰以及5、6号相邻峰分离情况变差，其他峰分离情况与①②号类似。本研究选择安捷伦ZORBAX SB-C18柱作为分析柱。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，其特征在于：具体方法包含以下步骤：步骤一、供试品的制备，准确称取止嗽立效丸药材粉末0.50g，置具塞锥形瓶中，准确加入80％的甲醇水溶液10ml，其中甲醇水溶液中含0.5％磷酸，盖塞，称重，超声提取30分钟，冷却，称重，以提取溶剂补足失重，过滤，续滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品；

步骤三、测定方法，吸取对照品溶液和供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，将供试品和混合对照品溶液的检测结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***》软件，经数据匹配，生成对照指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，其特征在于：所述的高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.1％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为0-24分钟，210nm；24-42分钟，250nm；42-78分钟，210nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/分钟；进样量为15μl，理论板数按甘草酸单铵盐峰计算应不低于20000。

3.根据权利要求2所述的一种止嗽立效丸高效液相色谱指纹图谱建立方法，其特征在于：所述的梯度洗脱方式为

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