CN108362790B - 一种中成药“清胰利胆颗粒”hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种中成药“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱的构建方法，属于中药技术领域，该方法包括：(1)供试品溶液的制备；(2)参照物溶液的制备；(3)色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB‑C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速0.9～1.1ml/min，柱温30～40℃，检测波长为235～245nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。(4)测定：照高效液相色谱法测定特征图谱。通过建立10批清胰利胆颗粒HPLC特征图谱，确定了10个特征峰，建立了清胰利胆颗粒标准特征图谱。本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高、重现性好等特点，可有效控制清胰利胆颗粒质量。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及中成药HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术
清胰利胆颗粒(由牡蛎、姜黄、金银花、柴胡、大黄、醋延胡索、牡丹皮、赤芍八味药材组成。)标准收载于国家药品标准，标准编号：YBZ01052015。本品质量标准中包括颗粒的性状；大黄、金银花和醋延胡索的薄层鉴别；芍药苷的含量测定。其质量标准只控制一味药的定性定量检测方法，难以整体全面的控制产品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种中成药“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱的构建方法。用于清胰利胆颗粒生产中的质量控制，克服现有技术的上述不足，
本发明的清胰利胆颗粒HPLC特征图谱的构建方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒研细粉末0.5～1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20～30ml，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得。
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱。
前述方法中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速0.9～1.1ml/min，柱温30～40℃，检测波长为235～245nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
优选的，所述的一种中成药“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒研细粉末1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得。
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱。
所述高效液相色谱测定的色谱条件优选为：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温35℃，检测波长为240nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～10min，A相5％，B相95％；10～15min，A相5％～10％，B相95％～90％；15～45min，A相10％～20％，B相90％～80％；45～50min，A相20％～25％，B相80％～75％；50～60min，A相25％～30％，B相75％～70％；即梯度洗脱程序表：
用前述一种“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱的构建方法建立10批次清胰利胆颗粒HPLC特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价***》2004A版分析，得到由10个特征峰构成的清胰利胆颗粒HPLC标准特征图谱。其中第5号峰为绿原酸峰，第6号峰为芍药苷峰。对10个特征峰进行归属：1、2、6、10号特征峰归属为牡丹皮药材，3、4、5号特征峰归属为金银花药材，6、7号特征峰归属为赤芍药材，8、9号特征峰归属为柴胡药材。
在标准特征图谱中，以芍药苷峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±5％之内，所述规定值分别为：0.11-峰1、0.18-峰2、0.60-峰3、0.61-峰4、0.67-峰5、1.00-峰6、1.02-峰7、1.39-峰8、1.47-峰9、1.59-峰10。
取清胰利胆颗粒样品，按上述同法操作，得到清胰利胆颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价***》2004A版对清胰利胆颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
有益效果：
1.本发明建立了一种中成药“清胰利胆颗粒”的HPLC特征图谱共有模式，标定了10个特征峰，建立的特征图谱比较全面的反应了所含化学成分的种类和数量，避免了清胰利胆颗粒质量控制的单一性和片面性，有利于全面控制产品质量。
2.本发明选择在240nm检测波长处进行测定，其出峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，稳定性好，准确可靠。
3.本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高、重现性好等特点，可有效控制清胰利胆颗粒质量。
附图说明
图1是本发明测得的清胰利胆颗粒HPLC特征图谱；
图2是10批次清胰利胆颗粒的特征图谱及共有模式；
图3是清胰利胆颗粒的标准特征图谱；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：一种清胰利胆颗粒的HPLC特征图谱构建方法
仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平
试药：芍药苷对照品、绿原酸对照品、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、清胰利胆颗粒由抚松县中药有限责任公司提供。
供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒细粉0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得。
测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长为235nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各15μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱。如图1所示。
供试品特征图谱与清胰利胆颗粒标准特征图谱相似度大于0.90，参照峰为6号峰，为芍药苷峰；5号峰为绿原酸峰。
实施例2：一种清胰利胆颗粒的HPLC特征图谱构建方法
仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平
试药：芍药苷对照品、绿原酸对照品、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、清胰利胆颗粒由抚松县中药有限责任公司提供。
供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒细粉1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得。
测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.1ml/min，柱温40℃，检测波长为245nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱。如图1所示。
供试品特征图谱与清胰利胆颗粒标准特征图谱相似度大于0.90，参照峰为6号峰，为芍药苷峰；5号峰为绿原酸峰。
实施例3：一种清胰利胆颗粒的HPLC特征图谱构建方法
仪器：戴安U-3000型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平
试药：芍药苷对照品、绿原酸对照品、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、清胰利胆颗粒由抚松县中药有限责任公司提供。
供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得。
测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温35℃，检测波长为240nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱。如图1所示。
供试品特征图谱与清胰利胆颗粒标准特征图谱相似度大于0.90，参照峰为6号峰，为芍药苷峰；5号峰为绿原酸峰。
实施例4：一种清胰利胆颗粒的HPLC标准特征图谱的建立
仪器：戴安U-3000型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平
试药：芍药苷对照品、绿原酸对照品、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、清胰利胆颗粒(批号分别为：160101、160102、160103、161201、161202、161203、170101、170102、170103、171001)由抚松县中药有限责任公司提供。
供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得。
色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温35℃，检测波长为240nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：
测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。
方法学考察
精密度试验：取同一份供试品溶液连续进样6次，记录色谱图，比较各特征峰的相对保留时间。结果所有特征峰的相对保留时间的RSD值小于3.0％，表明仪器精密度良好。详细结果如下：
重复性试验：取同一批(批号：160101)清胰利胆颗粒6份，分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样，记录色谱图。结果所有特征峰的相对保留时间的RSD值小于3.0％，表明方法重复性良好。详细结果如下：
稳定性试验：取同一份清胰利胆颗粒的供试品溶液，分别在0、2、6、8、12、18、24小时进样，记录色谱图。结果所有特征峰的相对保留时间的RSD值小于3.0％，表明溶液24小时稳定性良好。详细结果如下：
特征图谱测定
采用上述方法测定10个批次的清胰利胆颗粒，记录特征图谱，比较相对保留时间，结果10批清胰利胆颗粒相对保留时间RSD值小于3.0％，详细结果如下：
采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价***》
2004A版分析，得到10个批次的清胰利胆颗粒的特征图谱及共有模式如图2所示。对10批清胰利胆颗粒特征图谱进行相似度计算，10批清胰利胆颗粒特征图谱与标准特征图谱相似度均大于0.90。详细结果如下：
通过上述方法所建立的清胰利胆颗粒标准特征图谱如图3所示。
Claims (2)
1.一种中成药“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒研细粉末0.5～1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20～30ml，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱；
步骤(3)中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，5μm，4.6×250mm，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～10min，A相5％，B相95％；10～15min，A相5％～10％，B相95％～90％；15～45min，A相10％～20％，B相90％～80％；45～50min，A相20％～25％，B相80％～75％；50～60min，A相25％～30％，B相75％～70％；流速0.9～1.1ml/min，柱温30～40℃，检测波长为235～245nm；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
2.根据权利要求1所述的一种中成药“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于：
(1)供试品溶液的制备：取清胰利胆颗粒研细粉末1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：分别取芍药苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含芍药苷100μg、绿原酸50μg的溶液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“清胰利胆颗粒”HPLC特征图谱；
步骤(3)中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，5μm，4.6×250mm，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～10min，A相5％，B相95％；10～15min，A相5％～10％，B相95％～90％；15～45min，A相10％～20％，B相90％～80％；45～50min，A相20％～25％，B相80％～75％；50～60min，A相25％～30％，B相75％～70％；流速1.0ml/min，柱温35℃，检测波长为240nm；理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
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