CN110869747A - 试样观察装置和试样观察方法 - Google Patents

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Abstract

试样观察装置(1)包括：向试样(S)照射面状光(L2)的照射部(11)；相对于面状光(L2)的照射面R在一个方向上扫描试样(S)的扫描部(12)；将来自试样(S)的荧光(J1)和散射光(J2)分别成像的成像部(17)；输出基于荧光(J1)的光像的第一图像数据(G1)和基于散射光(J2)的光像的第二图像数据(G2)的拍摄部(13)；基于多个第一图像数据(G1)生成荧光图像(F1)且基于多个第二图像数据(G2)生成散射光图像(F2)的图像处理部(32)；和基于散射光图像(F2)确定荧光图像(F1)中的试样(S)的存在区域(N4)，基于试样S的存在区域(N4)设定荧光图像(F1)中的解析区域(N5)的解析部(33)。

Description

试样观察装置和试样观察方法
技术领域
本发明涉及试样观察装置和试样观察方法。
背景技术
作为观察细胞等试样的技术，例如有非专利文献1所记载的方法。该现有的方法中，利用荧光物质染色细胞核，基于激发荧光物质而得到的荧光图像确定细胞核的位置。然后，基于确定的细胞核的位置推测试样的存在区域，设定解析区域。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Perkin Elmer APPLICATION NOTE,“Image-based Quantificationof Apoptosisusing the Operetta”
发明内容
发明所要解决的课题
上述现有的方法中，仅是基于细胞核的位置推测试样的存在区域，难以说确定解析区域的精度充分。为了基于荧光强度高精度地实施试样的分析，需要能够以充分的精度确定解析区域的技术。
本发明是为了解决上述课题而提出的，其目的在于提供能够以充分的精度确定解析区域的试样观察装置和试样观察方法。
用于解决课题的方案
本发明的一个方面提供一种试样观察装置，其使用荧光来观察保持于试样容器的试样，该试样观察装置包括：向试样照射面状光的照射部；相对于面状光的照射面在一个方向上扫描试样的扫描部；将通过面状光的照射而在试样产生的荧光和散射光分别成像的成像部；拍摄部，其拍摄由成像部成像的荧光的光像的至少一部分而输出第一图像数据，且拍摄由成像部成像的散射光的光像的至少一部分而输出第二图像数据；图像处理部，其基于对于一个方向得到的多个第一图像数据生成荧光图像，并基于对于一个方向得到的多个第二图像数据生成散射光图像；和解析部，其基于散射光图像确定荧光图像中的试样的存在区域，基于试样的存在区域设定荧光图像中的解析区域，解析解析区域中的荧光的强度。
该试样观察装置中，基于来自试样的荧光生成荧光图像，基于来自试样的散射光生成散射光图像。能够根据散射光图像确定试样的轮廓形状。因此，能够根据基于散射光图像确定的试样的轮廓形状以充分的精度确定试样的存在区域。荧光图像中，基于确定的试样的存在区域设定解析区域，求取解析区域中的荧光强度，由此能够高精度地实施试样的分析。
另外，也可以是，成像部具有切换部，该切换部在成像光路上切换使荧光透过的第一滤光片和使散射光透过的第二滤光片。此时，能够通过简单的结构实现荧光与散射光的分割。
另外，也可以是，成像部具有分割荧光与散射光的光分割元件，拍摄部具有：拍摄由光分割元件分割后的荧光的至少一部分的第一光检测器；和拍摄由光分割元件分割后的散射光的至少一部分的第二光检测器。此时，能够通过简单的结构实现荧光与散射光的分割。
另外，也可以是，成像部具有分割荧光与散射光的光分割元件，拍摄部包括光检测器，该光检测器具有包含拍摄由光分割元件分割后的荧光的至少一部分的第一拍摄区域和拍摄由光分割元件分割后的散射光的至少一部分的第二拍摄区域的受光面。此时，能够通过简单的结构实现荧光与散射光的分割。
另外，也可以是，成像部具有相对于照射面倾斜的观察轴。此时，不需要视野选择动作，能够同时进行试样的扫描和拍摄。因此，能够实现直到得到荧光图像和散射光图像的吞吐量的提高。
另外，本发明的一个方面提供一种试样观察方法，其使用荧光来观察保持于试样容器的试样，该试样观察方法包括：向试样照射面状光的照射步骤；相对于面状光的照射面在一个方向上扫描试样的扫描步骤；将通过面状光的照射而在试样产生的荧光和散射光分别成像的成像步骤；拍摄由成像步骤成像的荧光的光像的至少一部分而输出第一图像数据，且拍摄由成像步骤成像的散射光的光像的至少一部分而输出第二图像数据的拍摄步骤；基于对于一个方向得到的多个第一图像数据生成荧光图像，并基于对于一个方向得到的多个第二图像数据生成散射光图像的图像处理步骤；和基于散射光图像确定荧光图像中的试样的存在区域，基于试样的存在区域设定荧光图像的解析区域，解析解析区域中的荧光的强度的解析步骤。
该试样观察方法中，基于来自试样的荧光生成荧光图像，基于来自试样的散射光生成散射光图像。能够根据散射光图像确定试样的轮廓形状。因此，能够根据基于散射光图像确定的试样的轮廓形状以充分的精度确定试样的存在区域。荧光图像中，基于确定的试样的存在区域设定解析区域，求取解析区域中的荧光强度，由此能够高精度地实施试样的分析。
另外，也可以是，还具有在成像光路上切换使荧光透过的第一滤光片和使散射光透过的第二滤光片的切换步骤。此时，能够通过简单的结构实现荧光与散射光的分割。
另外，也可以是，还具有利用光分割元件分割荧光与散射光的光分割步骤，拍摄步骤具有拍摄由光分割元件分割后的荧光的至少一部分的第一拍摄步骤和拍摄由光分割元件分割后的散射光的至少一部分的第二拍摄步骤。此时，能够通过简单的结构实现荧光与散射光的分割。
另外，也可以是，还具有利用光分割元件分割荧光与散射光的光分割步骤，拍摄步骤中，利用具有包含第一拍摄区域和第二拍摄区域的受光面的光检测器，在第一拍摄区域拍摄由光分割元件分割后的荧光的至少一部分，在第二拍摄区域拍摄由光分割元件分割后的散射光的至少一部分。此时，能够通过简单的结构实现荧光与散射光的分割。
另外，也可以是，成像步骤使用具有相对于照射面倾斜的观察轴的成像部，将通过面状光的照射在试样产生的荧光和散射光分别成像。此时，不需要视野选择动作，能够同时进行试样的扫描和拍摄。因此，能够实现直到得到荧光图像和散射光图像的吞吐量的提高。
发明效果
根据本发明，能够以充分的精度确定解析区域。
附图说明
图1是表示试样观察装置的一个实施方式的框图。
图2是表示图1所示的试样观察装置的照射部、试样容器和成像部的结构例的概略图。
图3是表示拍摄部的结构例的图。
图4是表示构成试样观察装置的计算机的功能性的构成要素的一例的框图。
图5(a)是表示第一图像数据的一例的图，(b)是表示第二图像数据的一例的图。
图6(a)是表示第一图像数据的另一例的图，(b)是表示第二图像数据的另一例的图。
图7(a)是表示荧光图像的一例的图，(b)是表示散射光图像的一例的图。
图8是表示荧光图像的解析区域的设定的情况的图。
图9是表示使用了图1所示的试样观察装置的试样观察方法的一例的流程图。
图10是表示成像部的变形例的概略图。
图11是表示成像部的又一变形例的概略图。
图12是表示荧光图像的解析区域的设定的情况的变形例的图。
具体实施方式
以下，参照附图详细地说明本发明一个方面的试样观察装置和试样观察方法的优选的实施方式。
图1是表示试样观察装置的一个实施方式的框图。该试样观察装置1是使在试样S产生的荧光或散射光成像于成像面而取得试样S的观察图像数据，基于该观察图像数据进行试样S的解析和评价的装置。
作为这种试样观察装置，具有取得并显示保持于载片的试样S的图像的切片扫描仪，或取得保持于微板(Microplate)的试样S的图像数据并解析图像数据的读板仪等。作为成为观察对象的试样S，例如举出人或动物的细胞、组织等。试样S被由面状光L2(参照图2)激发的荧光物质染色。作为荧光物质，例如能够举出将活的细胞特异性地染色的钙黄绿素AM、与细胞的表面抗原特异性地结合的荧光抗体(例如利用荧光物质荧光素标记的抗体)等。此外，试样S也可以利用不同种类的多个荧光物质染色。
如图2所示，试样S保持于试样容器2。试样容器2例如为微板。试样容器2具有：配置试样S的多个孔(well)3排列成一直线状(或矩阵状)的板状的主体部4；和在主体部4的一面侧以堵塞孔3的一端侧的方式设置的板状的透明部件5。
透明部件5具有面状光L2相对于配置于孔3内的试样S的输入面5a。透明部件5的材质只要是相对于面状光L2的波长的透射率高的(例如透射率为70％以上)部件，则没有特别限定，例如为玻璃、石英、或合成树脂。此外，孔3的另一端侧成为向外部开放的状态。试样S向孔3内配置时，孔3内也可以用水等介质填充。
如图1所示，试样观察装置1包括照射部11、扫描部12、拍摄部13、计算机14。照射部11以面状光L2为激发光向试样S照射。如图2所示，照射部11包括光源15和面状光形成部16。光源15输出作为面状光L2的形成源的光L1。作为光源15，例如能够举出激光二极管、固体激光光源等激光光源等。另外，光源15也可以是发光二极管、超辐射发光二极管、灯类光源。从光源15输出的光L1被面状光形成部16导光。
面状光形成部16将从光源15输出的光L1调整成面状光L2，将调整后的面状光L2沿着光轴P1照射至试样S。本实施方式中，面状光形成部16的光轴为面状光L2的光轴P1。面状光形成部16例如包含柱面透镜、圆锥透镜、或空间光调制器等的光形状调整元件，相对于光源15光学性地结合。面状光形成部16也可以包含物镜、光闸等。
在试样S的厚度方向上进行观察时，考虑到分辨率，优选面状光L2为厚度2mm以下的薄的面状光。另外，在试样S的厚度非常小时，即在观察Z方向分辨率以下的厚度的试样S时，面状光L2的厚度不影响分辨率。在该情况下，也可以使用厚度超过2mm的面状光L2。由照射部11形成的面状光L2照射至保持于试样容器2的试样S。通过面状光L2的照射，在面状光L2的照射面R产生观察光。观察光中分别包含例如由面状光L2在试样S中激发的荧光J1、在试样S的表面散射的面状光L2的散射光J2。
扫描部(扫描仪)12是对面状光L2的照射面R扫描试样S的机构。扫描部12包含例如使保持试样S的试样容器2移动的移动台。移动台根据来自计算机14的控制信号，在预先设定的方向上扫描试样容器2。本实施方式中，移动台在与面状光L2的光轴P1正交的平面内的一个方向上扫描试样容器2。以下的说明中，如图2所示，将面状光L2的光轴P1方向称为Z轴，将移动台进行的试样容器2的扫描方向称为Y轴，将在与面状光L2的光轴P1正交的平面内与Y轴正交的方向称为X轴。面状光L2对试样S的照射面R成为XZ平面内的面。
本实施方式中，设置有将通过面状光L2的照射在试样S产生的荧光J1和散射光J2分别成像的成像部17。成像部17利用例如准直透镜18、成像透镜19、第一滤光片20A、第二滤光片20B、切换部Y。
准直透镜18是将在照射面R产生的荧光J1或散射光J2进行平行光化的透镜。另外，成像透镜19是将由准直透镜18平行光化后的荧光J1或散射光J2成像的透镜。第一滤光片20A是使荧光J1透射且截断其以外的波长的光的滤光片。第二滤光片20B是使散射光J2透射且截断其以外的波长的光的滤光片。
切换部Y具有例如载置第一滤光片20A和第二滤光片20B的切换台。切换台配置于准直透镜18与成像透镜19之间的成像光路上。切换部Y根据来自计算机14的控制信号，与光源15的驱动同步地在与成像部17的光轴交叉的方向上驱动切换台，在成像光路上切换使荧光J1透过的第一滤光片20A和使散射光J2透过的第二滤光片20B。第一滤光片20A利用切换部Y进入到成像光路上时，仅荧光J1利用成像部17成像。另一方面，第二滤光片20B利用切换部Y进入到成像光路上时，仅散射光J2利用成像部17成像。此外，切换部Y也可以具有载置第一滤光片20A和第二滤光片20B的滤光轮。
成像部17的光轴成为荧光J1和散射光J2的观察轴P2。该观察轴P2相对于面状光L2的照射面R保持倾斜角度θ地倾斜。倾斜角度θ与向试样S去的面状光L2的光轴P1与观察轴P2构成的角一致。倾斜角度θ为例如10°～80°。从提高观察图像的分辨率的观点来看，倾斜角度θ优选为20°～70°。另外，从观察图像的分辨率的提高和视野的稳定性的观点来看，倾斜角度θ更优选为30°～65°。
拍摄部13拍摄由成像部17成像的荧光J1的光像的至少一部分和散射光J2的光像的至少一部分。作为构成拍摄部13的光检测器，例如能够举出CMOS图像传感器、CCD图像传感器等区域图像传感器。这些区域图像传感器配置于成像部17的成像面，利用例如全局快门(global shutter)或卷帘快门(rolling shutter)拍摄光像，生成二维图像数据。
拍摄部13将基于荧光J1的光像的至少一部分的第一图像数据和基于散射光J2的光像的至少一部分的第二图像数据分别输出至计算机14。如上所述，试样观察装置1中，试样容器2相对于照射面R在Y轴方向(一个方向)上被扫描，并且来自照射面R的荧光J1的光像和散射光J2的光像由拍摄部13拍摄。即，拍摄部13中，对于Y轴方向生成多个第一图像数据(XZ图像)和多个第二图像数据(XZ图像)。
拍摄部13中，也可以在光检测器应用行扫描方式，局部拍摄来自照射面R的荧光J1和散射光J2。例如如图3(a)所示，也可以在区域图像传感器21的拍摄面中设定子阵列。此时，能够仅读出包含于子阵列的像素列21a，因此，能够局部拍摄荧光J1或散射光J2的光像。另外，如图3(b)所示，也可以将区域图像传感器21的所有的像素列设为读出区域，通过之后的图像处理提取二维图像的一部分。
另外，如图3(c)所示，也可以代替区域图像传感器21，而使用线传感器22等光检测器，将拍摄面本身限定为一个像素列而进行局部的拍摄。如图3(d)所示，可以将仅透射荧光J1或散射光J2的一部分的狭缝23配置于区域图像传感器21的前面，取得与狭缝23对应的像素列21a的图像数据。在使用狭缝23的情况下，也可以代替区域图像传感器，而使用光电倍增管等的点传感器等光检测器。
计算机14在物理上包括RAM、ROM等存储器和CPU等处理器(运算电路)、通信接口、硬盘等储存部、显示器等显示部。作为上述的计算机14，例如能够举出个人电脑、微型计算机、云服务器、智能器件(智能手机，平板终端等)等。计算机14通过利用计算机***的CPU执行存储于存储器的程序，作为控制光源15、扫描部12、切换部Y和拍摄部13的动作的控制器发挥作用。
作为控制器的计算机14接受用户进行的测定开始的操作的输入，使光源15、扫描部12和拍摄部13同步地驱动。由此，试样容器2相对于面状光L2的照射面R在Y方向上扫描，来自照射面R的荧光J1和散射光J2的多个XZ图像由拍摄部13拍摄。计算机14在扫描部12进行的试样容器2的移动中，可以控制光源15，使光源15连续地输出光L1，也可以配合拍摄部13进行的拍摄来控制光源15进行的光L1的输出的开/关(ON/OFF)。另外，在照射部11包括光快门(光闸)的情况下，计算机14也可以通过该光快门的控制使光L1的照射进行开/关。
另外，如图4所示，计算机14包括作为功能性的构成要素的、拍摄结果接收部31、图像处理部32、解析部33。拍摄结果接收部31是从拍摄部13接收拍摄数据的部分。即，拍摄结果接收部31从拍摄部13接收基于荧光J1的光像的至少一部分的第一图像数据和基于散射光J2的光像的至少一部分的第二图像数据，输出至图像处理部32。
图5(a)是表示第一图像数据的一例的图。第一图像数据G1与在试样S产生的荧光J1的XZ像对应。荧光J1由于将试样S染色的荧光物质被面状光L2激发而产生。因此，第一图像数据G1中能够出现与试样S对应的荧光像M1。图5(b)是表示第二图像数据的一例的图。第二图像数据G2与在试样S产生的散射光J2的XZ像对应。散射光J2由于面状光在试样S的表面散射而产生。因此，第二图像数据G2中能够出现主要与试样S的轮廓形状对应的散射光像M2。
图6(a)是表示第一图像数据的另一例的图。该例中，在试样S的一部分产生荧光J1。另外，还存在未产生荧光J1的试样S。因此，该另一例中，第一图像数据G1中能够出现与试样的一部分对应的荧光像M1。图6(b)是表示第二图像数据的另一例的图。即使在试样S的一部分产生荧光J1的情况下，散射光J2由于面状光在试样S的表面散射，也与图5(b)同样地产生。因此，该另一例中，第一图像数据G1的荧光像M1与第二图像数据G2的散射光像M2成为不一致的状态。
图像处理部32生成荧光图像和散射光图像。图像处理部32从拍摄结果接收部31接收关于Y轴方向得到的多个第一图像数据G1和关于Y轴方向得到的多个第二图像数据G2。图像处理部32在Z方向上压缩接收到的多个第一图像数据G1和多个第二图像数据G2。在Z轴方向被压缩的多个第一图像数据G1表示关于X轴方向的荧光亮度，在Z轴方向被压缩的多个第二图像数据G2表示关于X轴方向的散射光亮度。图像处理部32对于各个第一图像数据G1和第二图像数据G2，将在Z轴方向被压缩的多个图像数据在Y轴方向上合成，累计各图像数据中的荧光亮度和散射光强度，由此生成荧光图像和散射光图像。图像处理部32将生成的荧光图像和散射光图像输出至解析部33。
图7(a)是表示荧光图像的一例的图。荧光图像F1是将在Z轴方向上被压缩的多个第一图像数据G1在Y轴方向上合成的图像，出现于荧光图像F1的荧光像N1成为与试样S对应的荧光的XY像。图7(a)中包含在试样S的一部分产生荧光J1的图示和在试样S中未产生荧光J1的图示。另外，图7(b)是表示散射光图像的一例的图。散射光图像F2是将在Z轴方向被压缩的多个第二图像数据G2在Y轴方向上合成的图像，散射光图像F2中出现的散射光像N2成为与试样S的轮廓形状对应的散射光的XY像。
解析部33解析解析区域N5中的荧光的强度。解析部33从图像处理部32接收到荧光图像F1和散射光图像F2时，首先，将散射光图像F2中出现的散射光像N2的轮廓形状作为试样S的存在区域N4提取出来(参照图7(b))。接着，如图8所示，解析部33将试样S的存在区域N4作为解析区域N5分配给荧光图像F1，设定荧光图像F1的解析区域N5。然后，解析部33基于荧光图像F1解析设定的解析区域N5中的荧光的强度。
接着，对使用了上述试样观察装置1的试样观察方法进行说明。图9是表示使用了图1所示的试样观察装置1的试样观察方法的一例的流程图。
如图9所示，该试样观察方法包括如下步骤：准备步骤(步骤S01)、照射步骤(步骤S02)、扫描步骤(步骤S03)、成像步骤(步骤S04)，拍摄步骤(步骤S05)、图像处理步骤(步骤S06)、解析步骤(步骤S07)。
准备步骤中，进行试样S向试样容器2的保持。在此，利用荧光物质将试样S染色，保持于孔3内。试样S保持于孔3之后，将试样容器2放置于扫描部12。
照射步骤中，向试样容器2的孔3照射面状光L2。当用户向试样观察装置1输入测定开始的操作时，基于来自计算机14的控制信号驱动光源15，照射作为面状光L2的形成源的光L1。从光源15输出的光L1被面状光形成部16调整成为面状光L2，照射至保持于试样容器2的试样S。
扫描步骤中，相对于面状光L2的照射面R扫描试样容器2。当用户输入测定开始的操作时，基于来自计算机14的控制信号，与光源15的驱动同步地驱动扫描部12。由此，试样容器2在Y轴方向上以一定的速度直线驱动，相对于面状光L2的照射面R扫描孔3内的试样S。
成像步骤中，使通过面状光L2的照射在试样S产生的荧光J1和散射光J2成像。成像步骤中，利用相对于照射面R倾斜的观察轴P2，相对于光检测器的受光面成像荧光J1和散射光J2。成像步骤中，也可以根据来自计算机14的控制信号驱动切换部Y，进行成像光路上的第一滤光片20A和第二滤光片20B的切换(切换步骤)。第一滤光片20A进入到成像光路上时，仅荧光J1利用成像部17成像。另一方面，第二滤光片20B进入到成像光路上时，仅散射光J2利用成像部17成像。
拍摄步骤中，拍摄由成像部17成像的荧光J1的光像的至少一部分和散射光J2的光像的至少一部分。拍摄步骤中，关于Y轴方向分别生成多个基于荧光J1的光像的至少一部分的第一图像数据G1和基于散射光J2的光像的至少一部分的第二图像数据G2，分别输出至计算机14。
图像处理步骤中，生成荧光图像F1和散射光图像F2。图像处理步骤中，首先，将拍摄步骤中得到的多个第一图像数据G1和多个第二图像数据G2在Z方向上压缩。接着，对于第一图像数据G1和第二图像数据G2各者，将在Z轴方向被压缩的多个图像数据在Y轴方向上合成，累计各图像数据中的荧光亮度或散射光亮度。由此，生成与试样S对应的荧光的XY像即荧光图像F1和与试样S的轮廓形状对应的散射光的XY像即散射光图像F2。
解析步骤中，解析解析区域N5中的荧光的强度。解析步骤中，首先，将散射光图像F2中出现的散射光像N2的轮廓形状作为试样S的存在区域N4提取出来。接着，将试样S的存在区域N4作为解析区域N5向荧光图像F1分配，设定荧光图像F1中的解析区域N5。然后，基于荧光图像F1解析设定的解析区域N5中的荧光的强度。
试样观察装置1中，基于来自试样S的荧光J1生成荧光图像F1，基于来自试样S的散射光J2生成散射光图像F2。根据散射光图像F2能够确定试样S的轮廓形状。因此，通过将基于散射光图像F2确定的试样S的轮廓形状应用于荧光图像F1，能够在荧光图像F1中以充分的精度确定试样S的存在区域N4。荧光图像F1中，通过求得确定的试样S的存在区域N4的荧光强度，能够高精度实施试样S的分析。
另外，试样观察装置1中，在成像部17设置有在成像光路上切换使荧光J1透射的第一滤光片20A和使散射光J2透射的第二滤光片20B的切换部Y。由此，能够通过简单的结构实现荧光J1与散射光J2的分割。
另外，试样观察装置1中，来自光源15的光L1利用面状光形成部16调整成面状光L2。由此，拍摄部13中，能够将第一图像数据G1和第二图像数据G2作为二维数据取得。另外，试样观察装置1中，成像部17具有相对于面状光L2的照射面R倾斜的观察轴P2。由此，不需要视野选择动作，能够同时进行试样S的扫描和拍摄。因此，能够实现直到得到荧光图像F1和散射光图像F2的处理量的提高。
本发明不限于上述实施方式。例如成像步骤中，也可以利用光分割元件分割通过面状光L2的照射在试样S产生的荧光J1和散射光J2(光分割步骤)。此时，如图10所示，成像部17也可以包括准直透镜18、成像透镜19A、19B、分束器(光分割元件)41、反射镜42、第一滤光片20A、第二滤光片20B。该图的例子中，拍摄部13包括第一光检测器43A和第二光检测器43B。作为分束器41，例如能够使用分色镜。
分束器41和第一滤光片20A配置于准直透镜18与成像透镜19A之间的成像光路上。荧光J1利用准直透镜18进行平行光化，透过分束器41和第一滤光片20A。透过了第一滤光片20A的荧光J1利用成像透镜19A成像于第一光检测器43A的受光面。第一光检测器43A拍摄荧光J1的光像的至少一部分，将第一图像数据G1输出至计算机14。
第二滤光片20B和反射镜42配置于准直透镜18与成像透镜19B之间的成像光路上。散射光J2利用准直透镜18进行平行光化，在分束器41反射之后，透过第二滤光片20B。透过了第二滤光片20B的散射光J2利用反射镜42反射，利用成像透镜19B成像于第二光检测器43B的受光面。第二光检测器43B拍摄散射光J2的光像的至少一部分，将第二图像数据G2输出至计算机14。这种结构中，也能够通过简单的结构实现荧光J1与散射光J2的分割。
另外，成像部也可以包括图11所示的光分割装置51。该光分割装置51在壳体52内包括准直透镜53、成像透镜54、分束器(光分割元件)55、反射镜56、第一滤光片20A、第二滤光片20B、成像透镜移动机构57。在壳体52的光的入射端设置有视野光阑58。视野光阑58的与观察轴P2垂直的方向的宽度可变。作为分束器55，例如能够使用分色镜。
分束器55和第一滤光片20A配置于准直透镜53与成像透镜54之间的成像光路上。穿过视野光阑58而入射于壳体52内的荧光J1利用准直透镜53进行平行光化，透过分束器55和第一滤光片20A而导光至成像透镜54。另外，第二滤光片20B和反射镜56配置于准直透镜53与成像透镜54之间的成像光路上。穿过视野光阑58而入射于壳体52内的散射光J2利用准直透镜53进行平行光化，在分束器55反射后，透过第二滤光片20B。透过了第二滤光片20B的散射光J2在反射镜56反射而导光至成像透镜54。
在此，成像透镜54成为利用成像透镜移动机构57相对于荧光J1的光轴偏离规定距离的状态。另外，拍摄部13的光检测器59具有包含第一拍摄区域(图10中的光检测器59的下半部分区域)59A和第二拍摄区域(图10中的光检测器59的上半部分区域)59B的受光面。由此，由成像透镜54成像的荧光J1成像于拍摄部13中的光检测器59的第一拍摄区域59A，与之不同，由成像透镜54成像的散射光J2成像于拍摄部13中的光检测器59的第二拍摄区域59B。光检测器59在第一拍摄区域59A中拍摄荧光J1的光像的至少一部分，在第二拍摄区域59B中拍摄散射光J2的光像的至少一部分。这种结构中，也能够通过简单的结构实现荧光J1与散射光J2的分割。
另外，例如上述实施方式中，组合了输出面状光L2的照射部11和采用行扫描方式的拍摄部13，但只要能够一次测量试样容器2中的孔3的深度方向的截面，则也可以采用其它的方式。例如也能够采用美国专利第8582203号所记载的Oblique Plane Microscopy的光学***。
在试样S由不同种类的多个荧光物质染色的情况下，也可以从照射部11输出激发各荧光物质的多个面状光L2，拍摄部13可以分别拍摄从各个荧光物质发出的多个荧光的像。此时，解析部33基于散射光图像F2确定试样S的存在区域N4之后，相对于从多个荧光的像得到的各荧光图像F1，分别设定基于试样S的存在区域N4的解析区域N5。由此，能够高精度地解析从染色于试样S的各荧光物质发出的荧光强度等。此外，即使在试样S被不同种类的多个荧光物质染色的情况下，在多个荧光物质被相同波长激发的情况下，也可以从照射部11输出单一的面状光L2。另外，在试样S被不同种类的多个荧光物质染色的情况下，在多个荧光物质发出相同波长的荧光的情况下，可以通过多次的拍摄，而拍摄从各荧光物质发出的荧光。
另外，试样S的存在区域N4和解析区域N5并非必须一致。例如如图12所示，也可以在出现于荧光图像F1的荧光像N1的内侧(试样S的存在区域N4的内侧)局部地设定解析区域N5。
附图标记说明
1……试样观察装置，2……试样容器，3……孔，11……照射部，12……扫描部，13……拍摄部，17……成像部，20A……第一滤光片，20B……第二滤光片，32……图像处理部，33……解析部，41……分束器(光分割元件)，43A……第一光检测器，43B……第二光检测器，51……光分割装置(成像部)，55……分束器(光分割元件)，59……光检测器，59A……第一拍摄区域，59B……第二拍摄区域，L2……面状光，J1……荧光，J2……散射光，G1……第一图像数据，G2……第二图像数据，F1……荧光图像，F2……散射光图像，N4……试样的存在区域，N5……解析区域，S……试样，R……照射面，P2……观察轴，Y……切换部。

Claims (6)

1.一种试样观察装置，其使用荧光来观察保持于试样容器的试样，该试样观察装置的特征在于，包括：
向所述试样照射面状光的照射部；
相对于所述面状光的照射面在一个方向上扫描所述试样的扫描部；
将通过所述面状光的照射而在所述试样产生的荧光和散射光分别成像的成像部；
拍摄部，其拍摄由所述成像部成像的所述荧光的光像的至少一部分而输出第一图像数据，且拍摄由所述成像部成像的所述散射光的光像的至少一部分而输出第二图像数据；
图像处理部，其基于对于所述一个方向得到的多个所述第一图像数据生成荧光图像，并基于对于所述一个方向得到的多个所述第二图像数据生成散射光图像；和
解析部，其基于所述散射光图像确定所述荧光图像中的所述试样的存在区域，基于所述试样的存在区域设定所述荧光图像中的解析区域，解析所述解析区域中的荧光的强度。
2.根据权利要求1所述的试样观察装置，其特征在于：
所述成像部具有切换部，该切换部在成像光路上切换使所述荧光透过的第一滤光片和使所述散射光透过的第二滤光片。
3.根据权利要求1所述的试样观察装置，其特征在于：
所述成像部具有分割所述荧光与所述散射光的光分割元件，
所述拍摄部具有：拍摄由所述光分割元件分割后的所述荧光的至少一部分的第一光检测器；和拍摄由所述光分割元件分割后的所述散射光的至少一部分的第二光检测器。
4.根据权利要求1所述的试样观察装置，其特征在于：
所述成像部具有分割所述荧光与所述散射光的光分割元件，
所述拍摄部包括光检测器，该光检测器具有包含拍摄由所述光分割元件分割后的所述荧光的至少一部分的第一拍摄区域和拍摄由所述光分割元件分割后的所述散射光的至少一部分的第二拍摄区域的受光面。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的试样观察装置，其特征在于：
所述成像部具有相对于所述照射面倾斜的观察轴。
6.一种试样观察方法，其使用荧光来观察保持于试样容器的试样，该试样观察方法的特征在于，包括：
向所述试样照射面状光的照射步骤；
相对于所述面状光的照射面在一个方向上扫描所述试样的扫描步骤；
将通过所述面状光的照射而在所述试样产生的荧光和散射光分别成像的成像步骤；
拍摄由所述成像步骤成像的所述荧光的光像的至少一部分而输出第一图像数据，且拍摄由所述成像步骤成像的所述散射光的光像的至少一部分而输出第二图像数据的拍摄步骤；
基于对于所述一个方向得到的多个所述第一图像数据生成荧光图像，并基于对于所述一个方向得到的多个所述第二图像数据生成散射光图像的图像处理步骤；和
基于所述散射光图像确定所述荧光图像中的所述试样的存在区域，基于所述试样的存在区域设定所述荧光图像的解析区域，解析所述解析区域中的荧光的强度的解析步骤。
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