CN110869748B - 试样观察装置和试样观察方法 - Google Patents

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Abstract

试样观察装置(1)包括：拍摄因透过膜过滤器(6)的面状光(L2)的照射而产生的观察光(L3)，输出荧光图像数据(G)的拍摄部(13)；在荧光图像数据(G)中确定与第一试样保持空间(V1)对应的第一区域(K1)和与第二试样保持空间(V2)对应的第二区域(K2)，生成与第一区域(K1)对应的第一部分图像数据(E1)和与第二区域(K2)对应的第二部分图像数据(E2)的部分图像生成部；基于这些部分图像数据生成第一观察图像数据(J1)和第二部分图像数据(E2)的观察图像生成部(33)；和基于第一观察图像数据(J1)和第二观察图像数据(J2)进行试样(S)的解析的解析部(34)。

Description

试样观察装置和试样观察方法
技术领域
本发明涉及试样观察装置和试样观察方法。
背景技术
现有技术中，已知有使用膜过滤器评价癌细胞等试样的移动能力的方法(例如参照非专利文献1～3)。移动能力的评价中有例如细胞侵袭能力评价(Cell InvasionAssay)。侵袭能力评价主要评价癌细胞一边破坏细胞外基质一边移动的能力。侵袭能力评价中，评价细胞通过涂敷有细胞外基质的膜过滤器的能力。
癌细胞具有向营养更丰富的区域移动的性质。因此，试样容器中，将由膜过滤器隔开的两个空间的一者用营养匮乏的溶液填满，并且将另一者利用营养丰富的溶液填满，由此，能够使细胞经由膜过滤器的微细孔从一个空间侧向另一个空间移动。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nina Kramer et al.,“In vitro cell migration and invasionassays”MutationResearch 752(2013)10-24
非专利文献2：Keren I.Hulkower and Renee L.Herber“Cell Migration andInvasionAssays as Tools for Drug Discovery”Pharmaceutics 2011,3,107-124；doi：10.3390/pharmaceutics3010107
非专利文献3：Vladimir Mastyugin et al.,“A Quantitative High-ThroughputEndothelialCell Migration Assay”Journal of Biomolecular Screening9(8)；2004
发明内容
发明所要解决的课题
现有技术中，将经由膜过滤器从一个空间移动至另一个空间的试样利用荧光等标识，并利用读板器观察，进行与对照体(药剂未处理的状态)的比较。但是，上述现有的方法中，难以观察通过膜过滤器从一个空间移动到了另一个空间的试样和没有移动的试样双方。
若仅是观察通过膜过滤器移动了的试样，则由于观察时间变长的情况或药剂的作用，难以区分细胞增殖或细胞死的现象与细胞的侵袭能力。因此，认为不能充分确保侵袭能力的评价的精度。为了实现侵袭能力的评价的精度提高，优选求取通过膜过滤器移动了的试样和没有移动的试样各自的生存性。
本发明是为了解决所述课题而研发的，其目的在于，提供能够观察通过膜过滤器移动了的试样和没有移动的试样两者的试样观察装置和试样观察方法。
用于解决课题的方案
本发明的一个方面提供一种试样观察装置，其观察在具有被膜过滤器分隔开的第一试样保持空间和第二试样保持空间的试样容器中保持的试样，该试样观察装置包括：照射光学***，其将包含透过膜过滤器的波长的面状光作为激发光向试样照射；扫描部，其相对于面状光的照射面扫描试样；拍摄部，其拍摄包含因面状光的照射而产生的荧光的观察光，输出基于该拍摄结果的荧光图像数据；部分图像生成部，其在荧光图像数据中确定与第一试样保持空间对应的第一区域和与第二试样保持空间对应的第二区域，生成与第一区域对应的第一部分图像数据和与第二区域对应的第二部分图像数据；观察图像生成部，其基于第一部分图像数据生成第一观察图像数据，且基于第二部分图像数据生成第二观察图像数据；和解析部，其基于第一观察图像数据和第二观察图像数据进行试样的解析。
该试样观察装置中，将包含透过膜过滤器的波长的面状光作为激发光向试样照射。由此，能够取得基于包含来自由膜过滤器分隔开的第一试样保持空间和第二试样保持空间两者的荧光的观察光的拍摄结果的荧光图像数据。另外，该试样观察装置中，根据取得的荧光图像数据确定与第一试样保持空间对应的第一区域和与第二试样保持空间对应的第二区域，生成基于各个区域的部分图像数据的观察图像数据。由此，能够观察穿过膜过滤器移动了的试样和没有移动的试样双方。
另外，也可以是，拍摄部还拍摄因面状光的照射而产生的激发光的散射光，输出基于该拍摄结果的散射光图像数据，部分图像生成部基于散射光图像数据确定荧光图像数据中的第一区域和第二区域。此时，根据散射光图像数据，能够在荧光图像数据中确定与膜过滤器对应的区域。因此，能够容易地确定荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，照射光学***将包含透过膜过滤器的波长的第一面状光和包含不透过膜过滤器的波长的第二面状光作为激发光向试样照射，拍摄部拍摄包含因第一面状光的照射而产生的第一荧光的观察光和包含因第二面状光的照射而产生的第二荧光的观察光，输出基于各者的拍摄结果的第一荧光图像数据和第二荧光图像数据，部分图像生成部基于第二荧光图像数据，确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。此时，第一荧光图像数据中包含来自夹着膜过滤器的双方的试样保持空间的荧光像，与之不同，第二荧光图像数据中仅包含来自夹着膜过滤器的一个试样保持空间的荧光像。因此，通过对照第一荧光图像数据与第二荧光图像数据，能够容易地确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，试样被由透过膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质和由不透过膜过滤器的波长的光激发的第二荧光物质染色。此时，基于第一荧光图像数据中包含的试样的荧光像和第二荧光图像数据中包含的试样的荧光像，能够容易地判别与第一试样保持空间对应的区域和与第二试样保持空间对应的区域。因此，通过第一荧光图像数据与第二荧光图像数据的对照，能够容易地确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，试样被由透过膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质染色，在第一试样保持空间和第二试样保持空间中注入有包含第二荧光物质的溶液，该第二荧光物质被不透过膜过滤器的波长的光激发。此时，基于溶液的荧光像，能够容易地判别与第一试样保持空间对应的区域和与第二试样保持空间对应的区域。因此，通过第一荧光图像数据与第二荧光图像数据的对照，能够容易地确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，解析部基于第一观察图像数据和第二观察图像数据，分别计数位于第一试样保持空间的试样的数量和位于第二试样保持空间的试样的数量。由此，能够迅速地执行试样的评价。
另外，也可以是，试样观察装置还包括成像光学***，该成像光学***具有相对于照射面倾斜的观察轴，将观察光成像于拍摄部。此时，不需要视野选择动作，能够同时进行试样的扫描和拍摄。因此，能够实现直到得到观察图像数据的处理量的提高。
本发明的一个方面提供一种试样观察方法，其观察在具有被膜过滤器分隔开的第一试样保持空间和第二试样保持空间的试样容器中保持的试样，该试样观察方法包括：将包含透过膜过滤器的波长的面状光作为激发光向试样照射的照射步骤；相对于面状光的照射面扫描试样的扫描步骤；拍摄包含因面状光的照射而产生的荧光的观察光，输出基于该拍摄结果的荧光图像数据的拍摄步骤；部分图像生成步骤，其在荧光图像数据中确定与第一试样保持空间对应的第一区域和与第二试样保持空间对应的第二区域，生成与第一区域对应的第一部分图像数据和与第二区域对应的第二部分图像数据；基于第一部分图像数据生成第一观察图像数据，且基于第二部分图像数据生成第二观察图像数据的观察图像生成步骤；和基于第一观察图像数据和第二观察图像数据进行试样的解析的解析步骤。
该试样观察方法中，将包含透过膜过滤器的波长的面状光作为激发光照射于试样。由此，能够取得基于包含来自被膜过滤器分隔开的第一试样保持空间和第二试样保持空间双方的荧光的观察光的拍摄结果的荧光图像数据。另外，该试样观察方法中，根据取得的荧光图像数据确定与第一试样保持空间对应的第一区域和与第二试样保持空间对应的第二区域，生成基于各个区域的部分图像数据的观察图像数据。由此，能够观察穿过膜过滤器移动了的试样和没有移动的试样双方。
另外，也可以是，拍摄步骤中，还拍摄因面状光的照射而产生的激发光的散射光，输出基于该拍摄结果的散射光图像数据，部分图像生成步骤中，基于散射光图像数据确定荧光图像数据中的第一区域和第二区域。此时，根据散射光图像数据，能够在荧光图像数据中确定与膜过滤器对应的区域。因此，能够容易地确定荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，照射步骤中，将包含透过膜过滤器的波长的第一面状光和包含不透过膜过滤器的波长的第二面状光作为激发光向试样照射，在拍摄步骤中，拍摄包含因第一面状光的照射而产生的第一荧光的观察光和包含因第二面状光的照射而产生的第二荧光的观察光，输出基于各者的拍摄结果的第一荧光图像数据和第二荧光图像数据，在部分图像生成步骤中，基于第二荧光图像数据，确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。此时，第一荧光图像数据中包含来自夹着膜过滤器的双方的试样保持空间的荧光像，与之不同，第二荧光图像数据中仅包含来自夹着膜过滤器的一个试样保持空间的荧光像。因此，通过对照第一荧光图像数据与第二荧光图像数据，能够容易地确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，试样观察方法还具有准备步骤，其用被透过膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质和被不透过膜过滤器的波长的光激发的第二荧光物质将试样染色。此时，基于第一荧光图像数据中包含的试样的荧光像和第二荧光图像数据中包含的试样的荧光像，能够容易地判别与第一试样保持空间对应的区域和与第二试样保持空间对应的区域。因此，通过第一荧光图像数据与第二荧光图像数据的对照，能够容易地确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，试样观察方法还具有准备步骤，其用被透过膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质将试样染色，且将包含被不透过膜过滤器的波长的光激发的第二荧光物质的溶液注入于第一试样保持空间和第二试样保持空间。此时，基于溶液的荧光像，能够容易地判别与第一试样保持空间对应的区域和与第二试样保持空间对应的区域。因此，通过第一荧光图像数据与第二荧光图像数据的对照，能够容易地确定第一荧光图像数据中的第一区域和第二区域。
另外，也可以是，解析步骤中，基于第一观察图像数据和第二观察图像数据，分别计数位于第一试样保持空间的试样的数量和位于第二试样保持空间的试样的数量。由此，能够迅速地执行试样的评价。
另外，也可以是，拍摄步骤中，利用相对于照射面倾斜的观察轴将观察光成像。此时，不需要视野选择动作，能够同时进行试样的扫描和拍摄。因此，能够实现直到得到观察图像数据的吞吐量的提高。
发明效果
该试样观察装置和试样观察方法能够观察穿过膜过滤器移动了的试样和没有移动的试样双方。
附图说明
图1是表示试样观察装置的一个实施方式的框图。
图2是表示图1所示的试样观察装置中的照射光学***、试样容器和成像光学***的结构例的概略图。
图3是表示拍摄部的结构例的图。
图4是表示构成试样观察装置的计算机的功能性的构成要素的一例的框图。
图5(a)是荧光图像数据的一例，(b)是散射光图像数据的一例，(c)是表示第一区域和第二区域的特定的状况的图。
图6(a)是第一部分图像数据的一例，(b)是表示第二部分图像数据的一例的图。
图7(a)是第一观察图像数据的一例，(b)是表示第二观察图像数据的一例的图。
图8是表示使用了图1所示的试样观察装置的试样观察方法的一例的流程图。
图9是表示试样观察装置的另一方式的框图。
图10是表示图9所示的试样观察装置中的照射光学***、试样容器和成像光学***的结构例的概略图。
图11(a)是第一荧光图像数据的一例，(b)是第二荧光图像数据的一例，(c)是表示第一区域和第二区域的特定的状况的图。
图12(a)是第一荧光图像数据的另一例，(b)是第二荧光图像数据的另一例，(c)是表示第一区域和第二区域的特定的状况的图。
具体实施方式
以下，参照附图详细地说明本发明一个方面的试样观察装置和试样观察方法的优选的实施方式。
图1是表示试样观察装置的一个实施方式的框图。该试样观察装置1是使在试样S的内部产生的荧光和/或散射光在成像面成像而取得试样S的观察图像数据，基于该观察图像数据进行试样S的解析和评价的装置。
作为这种试样观察装置1，有取得并显示保持于载片的试样S的图像的切片扫描仪，或取得保持于微板的试样S的图像数据并解析图像数据的读板器等。作为成为观察对象的试样S，例如能够举出人或动物的细胞、组织等。试样S由被后述的面状光L2激发的荧光物质染色。作为荧光物质，例如能够举出钙黄绿素AM(激发波长490nm/荧光波长525nm)、钙黄绿素蓝(激发波长360nm/荧光波长450nm)等。在使用这些荧光物质时，能够有选择地将活的细胞染色。
如图2所示，试样S保持于试样容器2。试样容器2例如为微板。试样容器2具有：配置试样S的多个孔(well)3排列成一直线状(或矩阵状)的板状的主体部4；和在主体部4的一面侧以堵塞孔3的一端侧的方式设置的板状的透明部件5。
在孔3内配置有膜过滤器6。膜过滤器6是设置有供试样S通过的多个微细孔7的膜。膜过滤器6的材质例如为聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。膜过滤器6的厚度通常非常薄，例如为7μm～25μm程度。另外，微细孔7的内径(直径)例如为8μm～10μm程度。膜过滤器6以将孔3隔开成与透明部件5相反的一侧的第一试样保持空间V1和透明部件5侧的第二试样保持空间V2的方式，利用支承部件8保持在孔3的大致中央位置。
在作为观察对象的试样S为癌细胞时，以试样S位于第一试样保持空间V1侧的方式，在涂敷有细胞外基质的膜过滤器6的一个面保持试样S。保持于膜过滤器6的一个面的试样S的一部分随着时间的经过进入膜过滤器6的微细孔7，穿过微细孔7而向膜过滤器6的另一面(即第二试样保持空间V2)移动。因此，在膜过滤器6的一个面保持试样S起经过规定时间之后，通过观察存在于膜过滤器6的一个面的试样S和存在于另一面的试样S，能够评价癌细胞的侵袭能力。
如图1所示，试样观察装置1包括照射光学***11、扫描部12、拍摄部13、计算机14。照射光学***11将包含透过膜过滤器6的波长的面状光L2作为激发光照射于试样S。如图2所示，照射光学***11包括光源15和面状光形成部16。光源15输出作为面状光L2的形成源的光L1。作为光源15，例如能够举出激光二极管、固体激光光源等激光光源等。另外，光源15也可以是发光二极管、超辐射发光二极管、灯类光源。从光源15输出的光L1被面状光形成部16导光。
面状光形成部16将从光源15输出的光L1调整成面状光L2，将调整后的面状光L2沿着光轴P1照射至试样S。本实施方式中，面状光形成部16的光轴成为面状光L2的光轴P1。面状光形成部16例如包含柱面透镜、圆锥透镜、或空间光调制器等光形状调整元件，相对于光源15光学性地结合。面状光形成部16也可以包含物镜、光快门(光闸)等。
在利用聚碳酸酯构成膜过滤器6时，膜过滤器6对于400nm以下的波长的光呈现非透射性。因此，光L1和面状光L2的波长例如优选为450nm～750nm。在试样S的厚度方向上进行观察时，考虑到分辨率，面状光L2优选为厚度2mm以下的薄的面状光。另外，在试样S的厚度非常小的情况下，即，在观察Z方向分辨率以下的厚度的试样S时，面状光L2的厚度不影响分辨率。此时也可以使用厚度超过2mm的面状光L2。
由照射光学***11形成的面状光L2向保持于试样容器2的试样S照射。如上所述，面状光L2包含透过膜过滤器6的波长。因此，面状光L2相对于试样S的照射面R从第一试样保持空间V1通过膜过滤器6到达第二试样保持空间V2。由于面状光L2的照射，在面状光L2的照射面R产生观察光L3。观察光L3中分别包含例如被面状光L2在试样S激发的荧光和不通过膜过滤器6而在膜过滤器6的表面散射的面状光L2的散射光。
扫描部12是相对于面状光L2的照射面R扫描试样S的机构。扫描部12包括例如使保持试样S的试样容器2移动的移动台。移动台根据来自计算机14的控制信号，在预先设定的方向上扫描试样容器2。本实施方式中，移动台在与面状光L2的光轴P1正交的平面内的一个方向上扫描试样容器2。以下的说明中，如图2所示，将面状光L2的光轴P1方向称为Z轴，将移动台进行的试样容器2的扫描方向称为Y轴，将在与面状光L2的光轴P1正交的平面内与Y轴正交的方向称为X轴。面状光L2相对于试样S的照射面R成为XZ平面内的面。
本实施方式中，如图2所示，设置有将通过面状光L2的照射而在照射面R产生的观察光L3成像的成像光学***17。如图2所示，成像光学***17包含例如物镜18。成像光学***17也可以除了物镜18之外，还包含成像透镜。成像光学***17的光轴成为观察光L3的观察轴P2。该观察轴P2相对于面状光L2的照射面R保持倾斜角度θ地倾斜。倾斜角度θ和向试样S去的面状光L2的光轴P1与观察轴P2构成的角一致。倾斜角度θ为例如10°～80°。从提高观察图像的分辨率的观点来看，倾斜角度θ优选为20°～70°。另外，从观察图像的分辨率的提高和视野的稳定性的观点来看，倾斜角度θ更优选为30°～65°。
如图1所示，拍摄部13包括拍摄观察光L3且输出基于拍摄结果的荧光图像数据的拍摄装置。本实施方式中，拍摄部13具有：拍摄因面状光L2的照射而产生的荧光的第一拍摄装置(第一光检测器)13A；和拍摄在膜过滤器6的表面产生的面状光L2的散射光的第二拍摄装置(第二光检测器)13B。
作为第一拍摄装置13A和第二拍摄装置13B，例如能够举出CMOS图像传感器、CCD图像传感器等区域图像传感器。这些区域图像传感器配置于成像光学***17的成像面，利用例如全局快门(global shutter)或卷帘快门(rolling shutter)拍摄光像，将二维图像的数据输出至计算机14。第一拍摄装置13A中也可以设置有截断散射光的滤光片，第二拍摄装置13B中也可以设置有截断荧光的滤光片。
也可以在第一拍摄装置13A和第二拍摄装置13B应用行扫描方式，局部拍摄照射面R的荧光像和散射光像。例如可以如图3(a)所示，在区域图像传感器21的拍摄面设置子阵列。此时，能够仅读出包含于子阵列的像素列21a，因此，能够局部拍摄观察光L3的光像。另外，如图3(b)所示，也可以将区域图像传感器21的所有的像素列作为读出区域，通过之后的图像处理提取二维图像的一部分。
另外，如图3(c)所示，也可以代替区域图像传感器21，使用线传感器22，将拍摄面本身限定为一个像素列而进行局部拍摄。如图3(d)所示，也可以将仅使观察光L3的一部分透过的狭缝23配置于区域图像传感器21的前面，取得与狭缝23对应的像素列21a的图像数据。在使用狭缝23的情况下，也可以使用光电倍增管等点传感器代替区域图像传感器。
计算机14在物理上包括RAM、ROM等存储器和CPU等处理器(运算电路)、通信接口、硬盘等储存部、显示器等显示部。作为上述的计算机14，例如能够举出个人电脑、微型计算机、云服务器、智能器件(智能手机、平板终端等)等。计算机14通过由计算机***的CPU执行存储于存储器的程序，作为控制光源15、扫描部12和拍摄部13的动作的控制器发挥作用。
作为控制器的计算机14接受用户的测定开始的操作的输入，使光源15、扫描部12和拍摄部13同步地驱动。由此，试样容器2相对于照射面R在Y方向上扫描，并且照射面R中的多个XZ图像由拍摄部13拍摄。计算机14在扫描部12进行的试样容器2的移动中，可以控制光源15，使光源15连续地输出光L1，也可以配合拍摄部13的拍摄而控制光源15进行的光L1的输出的开/关(ON/OFF)。另外，在照射光学***11包括光快门的情况下，计算机14也可以通过该光快门的控制来使面状光L2的照射开/关。
另外，作为功能性的构成要素，如图4所示，计算机14包括：拍摄结果接收部31、部分图像生成部32、观察图像生成部33、解析部34。拍摄结果接收部31是从拍摄部13接收拍摄数据的部分。即，拍摄结果接收部31从第一拍摄装置13A接收基于包含于观察光L3的荧光像的荧光图像数据，从第二拍摄装置13B接收基于包含于观察光L3的散射光像的散射光图像数据。拍摄结果接收部31将接收到的荧光图像数据和散射光图像数据输出至部分图像生成部32。
图5(a)是表示荧光图像数据的一例的图。该荧光图像数据G对应于在面状光L2的照射面R产生的荧光的XZ像。荧光通过试样S中包含的荧光物质被面状光L2激发而产生。因此，如该图所示，荧光图像数据G中，能够分别出现与位于膜过滤器6的一个面的试样S对应的荧光像M1和与位于膜过滤器6的另一个面的试样S的荧光像M2。膜过滤器6不产生荧光，因此与膜过滤器6对应的区域中不出现荧光像。
图5(b)是表示散射光图像数据的一例的图。该散射光图像数据F与在面状光L2的照射面R产生的散射光的XZ像对应。散射光通过面状光L2在膜过滤器6散射而产生。因此，如该图所示，散射光图像数据F中，能够分别出现与位于膜过滤器6的一个面的试样S对应的散射光像N1、与位于膜过滤器6的另一个面的试样S对应的散射光像N2、与膜过滤器6对应的散射光像N3。
部分图像生成部32生成基于荧光图像数据的部分图像数据。部分图像生成部32从拍摄部13接收到荧光图像数据G和散射光图像数据F时，首先，基于散射光图像数据F中的散射光像N3确定与膜过滤器6对应的区域Q(参照图5(b))。与膜过滤器6对应的区域Q可以根据规定的图像处理来确定，也可以基于膜过滤器6的厚度确定。
接着，如图5(c)所示，部分图像生成部32将与膜过滤器6对应的区域Q应用于荧光图像数据G，在荧光图像数据G中确定与第一试样保持空间V1对应的第一区域K1和与第二试样保持空间V2对应的第二区域K2。确定第一区域K1和第二区域K2之后，部分图像生成部32从荧光图像数据G提取与第一区域K1相当的部分，如图6(a)所示，生成与第一区域K1对应的第一部分图像数据E1。同样，部分图像生成部32从荧光图像数据G提取与第二区域K2相当的部分，如图6(b)所示，生成与第二区域K2对应的第二部分图像数据E2。部分图像生成部32将生成的第一部分图像数据E1和第二部分图像数据E2输出至观察图像生成部33。
观察图像生成部33基于部分图像数据生成观察图像数据。观察图像生成部33将从部分图像生成部32接收的第一部分图像数据E1和第二部分图像数据E2在Z轴方向上压缩。在Z轴方向被压缩的部分图像数据表示关于X轴方向的荧光亮度。如上所述，试样观察装置1中，试样容器2相对于照射面R在Y轴方向上扫描，并且照射面R中的多个XZ图像被拍摄部13拍摄。因此，观察图像生成部33中，在Z轴方向上被压缩的部分图像数据对于Y轴方向生成多个。
观察图像生成部33对于第一部分图像数据E1，将在Z轴方向被压缩的部分图像数据在Y轴方向上合成，累计各部分图像数据中的荧光亮度。由此，如图7(a)所示，生成与第一区域K1对应的第一观察图像数据J1。同样，观察图像生成部33对于第二部分图像数据E2，将在Z轴方向被压缩的部分图像数据在Y轴方向上合成，累计各部分图像数据中的荧光亮度。由此，如图7(b)所示，生成与第二区域K2对应的第二观察图像数据J2。观察图像生成部33将生成的第一观察图像数据J1和第二观察图像数据J2输出至解析部34。
解析部34基于第一观察图像数据J1和第二观察图像数据J2进行试样S的解析。第一观察图像数据J1中出现的荧光像D1表示不通过膜过滤器6而留于第一试样保持空间V1的试样S。另外，第二观察图像数据中出现的荧光像D2表示通过了膜过滤器6而移动至第二试样保持空间V2的试样S。解析部34通过计数第一观察图像数据J1中出现的荧光像D1，来计数位于第一试样保持空间V1的试样S的数量。另外，解析部34通过计数第二观察图像数据J2中出现的荧光像D2，来计数位于第二试样保持空间V2的试样S的数量。解析部34也可以基于荧光像D1、D2的荧光强度，解析位于第一试样保持空间V1的试样S和位于第二试样保持空间V2的试样S各者的荧光强度。
接着，对使用了上述试样观察装置1的试样观察方法进行说明。图8是表示使用了图1所示的试样观察装置1的试样观察方法的一例的流程图。
如图8所示，该试样观察方法包括准备步骤(步骤S01)、照射步骤(步骤S02)、扫描步骤(步骤S03)、拍摄步骤(步骤S04)、部分图像生成步骤(步骤S05)、观察图像生成步骤(步骤S06)、解析步骤(步骤S07)。
准备步骤中，进行试样S向试样容器2的保持。在此，用被透过膜过滤器6的波长的光激发的荧光物质将试样S染色。接着，以试样S位于第一试样保持空间V1侧的方式，在涂敷有细胞外基质的膜过滤器6的一个面保持试样S。保持试样S经过一定时间后，将试样容器2放置于扫描部12。
照射步骤中，向试样S照射面状光L2。当用户向试样观察装置1输入测定开始的操作时，基于来自计算机14的控制信号驱动光源15，从光源15输出光L1。从光源15输出的光L1被面状光形成部16调整成面状光L2，照射至保持于试样容器2的试样S。
扫描步骤中，相对于面状光L2的照射面R扫描试样S。当用户输入测定开始的操作时，基于来自计算机14的控制信号，与光源15的驱动同步地驱动扫描部12。由此，试样容器2在Y轴方向上以一定的速度直线性地驱动，相对于面状光L2的照射面R扫描孔3内的试样S。
拍摄步骤中，拍摄通过面状光L2的照射而产生的观察光L3。更具体而言，拍摄步骤中，利用具有相对于照射面R倾斜的观察轴P2的成像光学***17，将通过面状光L2的照射而在试样S产生的观察光L3对拍摄部13的成像面进行成像。拍摄步骤中，利用第一拍摄装置13A取得多个与利用成像光学***17成像的荧光图像的光像的一部分对应的部分的图像，且利用第二拍摄装置13B取得多个与散射光图像的光像的一部分对应的部分的图像。
部分图像生成步骤中，生成与第一区域K1对应的第一部分图像数据E1、与第二区域K2对应的第二部分图像数据E2。部分图像生成步骤中，首先，基于散射光图像数据F确定与膜过滤器6对应的区域Q(参照图5(b))。接着，将与膜过滤器6对应的区域Q应用于荧光图像数据G，荧光图像数据G中，确定与第一试样保持空间V1对应的第一区域K1和与第二试样保持空间V2对应的第二区域K2(参照图5(c))。
确定第一区域K1和第二区域K2之后，从荧光图像数据G提取与第一区域K1相当的部分，生成与第一区域K1对应的第一部分图像数据E1(参照图6(a))。同样，从荧光图像数据G提取与第二区域K2相当的部分，生成与第二区域K2对应的第二部分图像数据E2(参照图6(b))。
观察图像生成步骤中，基于第一部分图像数据E1生成第一观察图像数据J1，基于第二部分图像数据E2生成第二观察图像数据J2。更具体而言，观察图像生成步骤中，对于第一部分图像数据E1，将在Z轴方向被压缩的多个部分图像数据在Y轴方向上合成，生成与第一区域K1对应的第一观察图像数据J1(参照图7(a))。同样，对于第二部分图像数据E2，将在Z轴方向被压缩的多个部分图像数据在Y轴方向上合成，生成与第二区域K2对应的第二观察图像数据J2(参照图7(b))。
解析步骤中，基于第一观察图像数据J1和第二观察图像数据J2进行试样S的解析。解析步骤中，计数例如第一观察图像数据J1中出现的荧光像D1，计数位于第一试样保持空间V1的试样S的数量。另外，通过计数第二观察图像数据J2中出现的荧光像D2，计数位于第二试样保持空间V2的试样S的数量。解析位于第一试样保持空间V1的试样S和位于第二试样保持空间V2的试样S各者的荧光强度。
如以上说明的，试样观察装置1中，将包含透过膜过滤器6的波长的面状光L2作为激发光照射于试样。由此，能够取得基于包含来自由膜过滤器6隔开的第一试样保持空间V1和第二试样保持空间V2两者的荧光的观察光L3的拍摄结果的荧光图像数据G。另外，试样观察装置1中，根据取得的荧光图像数据G确定与第一试样保持空间V1对应的第一区域K1和与第二试样保持空间V2对应的第二区域K2，生成基于各个区域的部分图像数据的观察图像数据。由此，能够观察穿过膜过滤器6移动的试样S和没有移动的试样S双方。
另外，试样观察装置1中，利用拍摄荧光的第一拍摄装置13A和拍摄散射光的第二拍摄装置13B构成拍摄部13。部分图像生成部32基于散射光图像数据确定荧光图像数据中的第一区域K1和第二区域K2。由此，使用散射光图像数据F，能够确定荧光图像数据G中与膜过滤器6对应的区域Q。因此，能够容易地确定荧光图像数据G中的第一区域K1和第二区域K2。
另外，试样观察装置1中，解析部34基于第一观察图像数据J1和第二观察图像数据J2，分别计数位于第一试样保持空间V1的试样S的数量和位于第二试样保持空间V2的试样S的数量。由此，能够迅速地执行试样S的评价。
另外，试样观察装置1中，设置有具有相对于照射面R3倾斜的观察轴P2，将观察光L3成像于拍摄部13的成像光学***17。此时，不需要视野选择动作，能够同时进行试样S的扫描和拍摄。因此，能够实现直到得到观察图像数据的处理量的提高。
图9是表示试样观察装置的另一方式的框图。如该图所示，另一方式的试样观察装置41在利用第一照射光学***11A和第二照射光学***11B构成照射光学***11的方面，与上述试样观察装置1不同。
使用该试样观察装置41进行试样S的观察时，利用被透过膜过滤器6的波长的光激发的第一荧光物质和被不透过膜过滤器6的波长的光激发的第二荧光物质将试样S染色。作为第一荧光物质，例如能够举出钙黄绿素AM(激发波长490nm/荧光波长525nm)。另外，作为第二荧光物质，例如能够举出钙黄绿素蓝(激发波长360nm/荧光波长450nm)。
如图10所示，第一照射光学***11A包含第一光源15A和第一面状光形成部16A。第一光源15A输出透过膜过滤器6，且包含激发第一荧光物质的波长的第一光L1a。第一面状光形成部16A将从第一光源15A输出的第一光L1a调整成第一面状光L2a，且将第一面状光L2a沿着光轴P1照射至试样S。第一面状光L2a透过膜过滤器6，因此，第一面状光L2a的照射面Ra从第一试样保持空间V1包含膜过滤器6地到达第二试样保持空间V2。
第二照射光学***11B包含第二光源15B和第二面状光形成部16B。第二光源15B输出不透过膜过滤器6，且包含激发第二荧光物质的波长的第二光L1b。第二面状光形成部16B将从第二光源15B输出的第二光L1b调整成第二面状光L2b，将第二面状光L2b利用例如反射镜42和分色镜43以与光轴P1同轴的状态照射至试样S。第二面状光L2b不透过膜过滤器6，因此，第二面状光L2b的照射面Rb仅存在于第二试样保持空间V2。
本实施方式中，观察光L3中包含被第一面状光L2a在试样S激发的第一荧光、被第二面状光L2b在试样S激发的第二荧光。第一荧光利用具有相对于照射面Ra倾斜的观察轴P2的成像光学***17A成像于第一拍摄装置13A的拍摄面，第二荧光利用例如分色镜44和反射镜45与第一荧光分离，利用具有相对于照射面Rb倾斜的观察轴P2的成像光学***17B成像于第二拍摄装置13B的成像面。
第一拍摄装置13A拍摄通过第一面状光L2a的照射而产生的第一荧光的光像，将第一荧光图像数据输出至计算机14。另外，第二拍摄装置13B拍摄通过第二面状光L2b的照射而产生的第二荧光的光像，将第二荧光图像数据输出至计算机14。第一拍摄装置13A中也可以设置有截断第二荧光的滤光片，第二拍摄装置13B中也可以设置有截断第一荧光的滤光片。
图11(a)是表示第一荧光图像数据的一例的图。第一面状光L2a的照射面Ra从第一试样保持空间V1包含膜过滤器6地到达第二试样保持空间V2。因此，第一荧光图像数据G1中，能够分别出现与位于膜过滤器6的一个面的试样S对应的荧光像M1和与位于膜过滤器6的另一个面的试样S对应的荧光像M2。另外，图11(b)是表示第二荧光图像数据的一例的图。第二面状光L2b的照射面Rb仅存在于第二试样保持空间V2。因此，第二荧光图像数据G2中，能够仅出现与位于膜过滤器6的另一个面的试样S对应的荧光像M3。
此时，部分图像生成部32基于膜过滤器6的厚度提取与膜过滤器6对应的区域Q1，并且基于荧光像M3的出现范围从第二荧光图像数据G2提取与第二试样保持空间V2对应的区域Q2。然后，如图11(c)所示，部分图像生成部32将与膜过滤器6对应的区域Q1和与第二试样保持空间V2对应的区域Q2应用于第一荧光图像数据G1，在第一荧光图像数据G1中确定与第一试样保持空间V1对应的第一区域K1和与第二试样保持空间V2对应的第二区域K2。
这种试样观察装置41中，也实现与上述试样观察装置1同样的作用效果，能够观察穿过膜过滤器6移动了的试样S和没有移动的试样S双方。另外，试样观察装置1中，基于第一荧光图像数据G1中包含的试样S的荧光像M1、M2和第二荧光图像数据G2中包含的试样的荧光像M3，能够容易地判别与第一试样保持空间V1对应的区域和与第二试样保持空间V2对应的区域。因此，通过第一荧光图像数据G1与第二荧光图像数据G2的对照，能够容易地确定第一荧光图像数据G1中的第一区域K1和第二区域K2。
另外，假设根据试样S的种类的不同，难以用两个荧光物质同时将试样S染色的情况。此时，也可以用被透过膜过滤器6的波长的光激发的第一荧光物质将试样S染色，并且将包含被不透过膜过滤器6的波长的光激发的第二荧光物质的溶液注入第一试样保持空间V1和第二试样保持空间V2。
此时，如图12(a)所示，第一荧光图像数据G1中能够分别出现与位于膜过滤器6的一个面的试样S对应的荧光像M1和与位于膜过滤器6的另一个面的试样S对应的荧光像M2。另外，如图12(b)所示，第二荧光图像数据G2中，与试样S对应的荧光像不出现，仅与第二试样保持空间V2内的溶液对应的荧光像M4能够出现。
此时，部分图像生成部32基于膜过滤器6的厚度提取与膜过滤器6对应的区域Q1，并且基于荧光像M4的出现范围从第二荧光图像数据G2提取与第二试样保持空间V2对应的区域Q2。然后，如图12(c)所示，部分图像生成部32将与膜过滤器6对应的区域Q1和与第二试样保持空间V2对应的区域Q2应用于第一荧光图像数据G1，在第一荧光图像数据G1中确定与第一试样保持空间V1对应的第一区域K1和与第二试样保持空间V2对应的第二区域K2。
此时，也能够实现与上述试样观察装置1同样的作用效果，能够观察穿过膜过滤器6移动了的试样S和没有移动的试样S双方。另外，基于溶液的荧光像M4，能够容易地判别与第一试样保持空间V1对应的区域和与第二试样保持空间V2对应的区域。因此，通过第一荧光图像数据G1与第二荧光图像数据G2的对照，能够进一步容易地确定第一荧光图像数据G1中的第一区域K1和第二区域K2。
本发明不限于上述实施方式。例如上述实施方式中，组合输出面状光的照射光学***11和采用行扫描方式的拍摄部13，但如果能够一次测量试样容器2中的孔3的深度方向的截面，则也可以采用其它的方式。例如也可以采用美国专利第8582203号所记载的Oblique PlaneMicroscopy的光学***。
附图标记说明
1、41……试样观察装置，2……试样容器，6……膜过滤器，11、11A、11B……照射光学***，12……扫描部，13……拍摄部，17、17A、17B……成像光学***，32……部分图像生成部，33……观察图像生成部，34……解析部，E1……第一部分图像数据，E2……第二部分图像数据，F……散射光图像数据，G……荧光图像数据，G1……第一荧光图像数据，G2……第二荧光图像数据，J1……第一观察图像数据，J2……第二观察图像数据，K1……第一区域，K2……第二区域，L2……面状光，L2a……第一面状光，L2b……第二面状光，L3……观察光，R、Ra、Rb……照射面，S……试样，V1……第一试样保持空间，V2……第二试样保持空间。

Claims (16)

1.一种试样观察装置，其观察在具有被膜过滤器分隔开的第一试样保持空间和第二试样保持空间的试样容器中保持的试样，该试样观察装置的特征在于，包括：
照射光学***，其将包含能透过所述膜过滤器的波长的面状光作为激发光沿着Z轴方向向所述试样照射；
扫描部，其相对于成为所述面状光的照射面的XZ面沿Y轴方向扫描所述试样；
拍摄部，其同时拍摄包含因所述面状光的照射而在跨所述第一试样保持空间和所述第二试样保持空间的照射面产生的荧光的观察光，输出基于该拍摄结果的、所述XZ面的荧光图像数据；
部分图像生成部，其在所述XZ面的所述荧光图像数据中确定与所述第一试样保持空间对应的第一区域和与所述第二试样保持空间对应的第二区域，生成与所述第一区域对应的第一部分图像数据和与所述第二区域对应的第二部分图像数据；
观察图像生成部，其基于所述第一部分图像数据生成第一观察图像数据，且基于所述第二部分图像数据生成第二观察图像数据；和
解析部，其基于所述第一观察图像数据和所述第二观察图像数据进行所述试样的解析。
2.根据权利要求1所述的试样观察装置，其特征在于：
所述拍摄部还拍摄因所述面状光的照射而产生的所述激发光的散射光，输出基于该拍摄结果的散射光图像数据，
所述部分图像生成部基于所述散射光图像数据确定所述荧光图像数据中的所述第一区域和所述第二区域。
3.根据权利要求1所述的试样观察装置，其特征在于：
所述照射光学***将包含能透过所述膜过滤器的波长的第一面状光和包含不能透过所述膜过滤器的波长的第二面状光作为所述激发光向所述试样照射，
所述拍摄部拍摄包含因所述第一面状光的照射而产生的第一荧光的观察光和包含因所述第二面状光的照射而产生的第二荧光的观察光，输出基于各者的拍摄结果的第一荧光图像数据和第二荧光图像数据，
所述部分图像生成部基于所述第二荧光图像数据，确定所述第一荧光图像数据中的所述第一区域和所述第二区域。
4.根据权利要求3所述的试样观察装置，其特征在于：
所述试样被由能透过所述膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质和由不能透过所述膜过滤器的波长的光激发的第二荧光物质染色。
5.根据权利要求3所述的试样观察装置，其特征在于：
所述试样被由能透过所述膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质染色，
在所述第一试样保持空间和所述第二试样保持空间中注入有包含第二荧光物质的溶液，该第二荧光物质能够被不透过所述膜过滤器的波长的光激发。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的试样观察装置，其特征在于：
所述解析部基于所述第一观察图像数据和所述第二观察图像数据，分别计数位于所述第一试样保持空间的所述试样的数量和位于所述第二试样保持空间的所述试样的数量。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的试样观察装置，其特征在于：
还包括成像光学***，该成像光学***具有相对于所述照射面倾斜的观察轴，将所述观察光成像于所述拍摄部。
8.根据权利要求6所述的试样观察装置，其特征在于：
还包括成像光学***，该成像光学***具有相对于所述照射面倾斜的观察轴，将所述观察光成像于所述拍摄部。
9.一种试样观察方法，其观察在具有被膜过滤器分隔开的第一试样保持空间和第二试样保持空间的试样容器中保持的试样，该试样观察方法的特征在于，包括：
将包含能透过所述膜过滤器的波长的面状光作为激发光沿着Z轴方向向所述试样照射的照射步骤；
相对于成为所述面状光的照射面的XZ面沿着Y轴方向扫描所述试样的扫描步骤；
同时拍摄包含因所述面状光的照射而在跨所述第一试样保持空间和所述第二试样保持空间的照射面产生的荧光的观察光，输出基于该拍摄结果的、所述XZ面的荧光图像数据的拍摄步骤；
部分图像生成步骤，其在所述XZ面的所述荧光图像数据中确定与所述第一试样保持空间对应的第一区域和与所述第二试样保持空间对应的第二区域，生成与所述第一区域对应的第一部分图像数据和与所述第二区域对应的第二部分图像数据；
基于所述第一部分图像数据生成第一观察图像数据，且基于所述第二部分图像数据生成第二观察图像数据的观察图像生成步骤；和
基于所述第一观察图像数据和所述第二观察图像数据进行所述试样的解析的解析步骤。
10.根据权利要求9所述的试样观察方法，其特征在于：
所述拍摄步骤中，还拍摄因所述面状光的照射而产生的所述激发光的散射光，输出基于该拍摄结果的散射光图像数据，
所述部分图像生成步骤中，基于所述散射光图像数据确定所述荧光图像数据中的所述第一区域和所述第二区域。
11.根据权利要求9所述的试样观察方法，其特征在于：
所述照射步骤中，将包含能透过所述膜过滤器的波长的第一面状光和包含不能透过所述膜过滤器的波长的第二面状光作为所述激发光向所述试样照射，
在所述拍摄步骤中，拍摄包含因所述第一面状光的照射而产生的第一荧光的观察光和包含因所述第二面状光的照射而产生的第二荧光的观察光，输出基于各者的拍摄结果的第一荧光图像数据和第二荧光图像数据，
在所述部分图像生成步骤中，基于所述第二荧光图像数据，确定所述第一荧光图像数据中的所述第一区域和所述第二区域。
12.根据权利要求11所述的试样观察方法，其特征在于：
还具有准备步骤，其用能够被透过所述膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质和能够被不透过所述膜过滤器的波长的光激发的第二荧光物质将所述试样染色。
13.根据权利要求11所述的试样观察方法，其特征在于：
还具有准备步骤，其用能够被透过所述膜过滤器的波长的光激发的第一荧光物质将所述试样染色，且将包含能够被不透过所述膜过滤器的波长的光激发的第二荧光物质的溶液注入于所述第一试样保持空间和所述第二试样保持空间。
14.根据权利要求9～13中任一项所述的试样观察方法，其特征在于：
所述解析步骤中，基于所述第一观察图像数据和所述第二观察图像数据，分别计数位于所述第一试样保持空间的所述试样的数量和位于所述第二试样保持空间的所述试样的数量。
15.根据权利要求9～13中任一项所述的试样观察方法，其特征在于：
所述拍摄步骤中，利用相对于所述照射面倾斜的观察轴将所述观察光成像。
16.根据权利要求14所述的试样观察方法，其特征在于：
所述拍摄步骤中，利用相对于所述照射面倾斜的观察轴将所述观察光成像。
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