CN112646818A

CN112646818A - 大豆基因GmTCM1及其获得方法与应用

Info

Publication number: CN112646818A
Application number: CN202011641417.8A
Authority: CN
Inventors: 赵雪; 韩英鹏; 常宏; 井妍; 赵克臻; 战宇航; 李文滨
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112646818B

Abstract

大豆基因GmTCM1及其获得方法与应用，属于大豆遗传育种技术领域。为了提高大豆异黄酮含量，并获得高异黄酮的转基因大豆植株，本发明从高异黄酮含量大豆品种中豆27中克隆出大豆基因GmTCM1，对该基因的生物学信息分析和基因功能的初步分析表明GmTCM1基因能够提高大豆异黄酮的含量，并参与对干旱和盐等非生物胁迫以及核盘菌、疫霉菌和灰斑菌等生物胁迫的抗性反应，此外，得到的转基因材料通过之后的继代繁殖及鉴定，可以成为稳定的抗病遗传材料。本发明对于加速高异黄酮抗病抗逆型大豆新品种的育种进程以及提高育种效率具有重要的理论意义和实践价值。

Description

大豆基因GmTCM1及其获得方法与应用

技术领域

本发明属于大豆遗传育种技术领域，具体涉及大豆基因GmTCM1及其获得方法与应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国乃至世界上重要的粮食、经济作物。同时，大豆是天然异黄酮的主要来源。异黄酮作为大豆重要的次生代谢产物，不仅对大豆的生长发育具有重要的作用，大豆异黄酮也作为保健食品和药用用途，有益于人类健康。因此，大豆异黄酮含量成为大豆重要的育种目标性状。

叶梅荣(2008)对油菜幼苗进行了研究，发现低浓度大豆异黄酮可以减轻干旱胁迫下幼苗的损伤，程浩(2008)研究发现，异黄酮含量越高，材料的花叶病毒的发病率越低。Van Etten HD(1961)发现大豆植物在感染植物病原真菌菌核病菌后异黄酮水平显着增加。Hershman(1945)等发现大豆胞囊线虫侵染2-3天后的抗、感病大豆品种的异黄酮的浓度均比健康植株的异黄酮的浓度高。但在已报道的涉及大豆异黄酮的研究中，研究确定了异黄酮的抗性功能，但未明确得到稳定的过表达阳性植株。

由于传统育种方法周期长，变异范围小等局限性，难于获得高异黄酮含量的大豆新品种。因此利用分子手段筛选及鉴定控制大豆异黄酮含量的基因并应用于育种中，对加速高异黄酮含量和逆境抗性品种的选育具有重要意义。

发明内容

1、为了提高大豆异黄酮含量，并获得高异黄酮的转基因大豆植株。本发明提供了大豆基因GmTCM1，所述大豆基因GmTCM1的核酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQID No.2所示。

进一步的限定，所述大豆基因GmTCM1是从高异黄酮含量大豆品种中豆27中克隆出来的。

本发明还提供了所述大豆基因GmTCM1的获得方法，所述获得方法步骤如下：

步骤一、从品种为中豆27的大豆叶片中提取总RNA并反转录合成cDNA第一链；

步骤二、以登录号为Glyma.20G114200的基因全长序列作为基因GmTCM1的参考序列设计一对克隆引物，并利用限制性内切酶BstEII修饰上游引物，得到上游引物 GmTCM1-S，利用限制性内切酶BglII修饰下游引物，得到下游引物GmTCM1-A；

步骤三、以步骤一得到的cDNA为模板，利用步骤二获得的上、下游引物进行PCR 扩增，并利用胶回收对PCR产物进行纯化；

步骤四、将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单斑并进行PCR及测序验证，最终获得GmTCM1基因。

进一步地限定，所述上游引物GmTCM1-S的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物GmTCM1-A的序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地限定，所述基因GmTCM1的参考序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了所述大豆基因GmTCM1在抗生物胁迫和非生物胁迫中的应用。

进一步地限定，生物胁迫是指大豆真菌病害。

进一步地限定，非生物胁迫是指干旱和盐胁迫。

进一步地限定，所述真菌病害是指由核盘菌、疫霉菌和灰斑菌引起的大豆病害中的一种或两种以上。

进一步地限定，所述应用是通过过量表达GmTCM1基因得到转基因大豆植株，再将得到的转基因大豆植株通过之后的继代繁殖及鉴定，获得稳定的高异黄酮抗病抗逆遗传材料。

有益效果

本发明在前期利用精细定位，筛选出了GmTCM1基因，通过生物信息学分析、候选基因途径的关联分析、生物胁迫与非生物胁迫处理及籽粒发育过程的动态表达模式分析、亚细胞定位及遗传转化等手段，对GmTCM1基因的功能进行了初步鉴定。

本研究通过发根农杆菌和根癌农杆菌介导的大豆遗传转化法将目的基因GmTCM1转入大豆毛状根和整个大豆植株中，鉴定结果表明，作为C4H基因家族成员，GmTCM1基因能够响应病原菌微生物的侵染，转基因阳性植株异黄酮含量高于野生型植株，推测其在大豆中的过表达可能引起C4H酶活的提高，进而促进异黄酮合成，继而发挥异黄酮植保素作用，从而提高大豆对真菌病害的抗性；此外，在拟南芥中的研究表明，GmTCM1可以一定程度地提高植物的耐盐性和耐旱性。

本发明的实验结果说明了GmTCM1基因能够参与到抗干旱和抗盐的非生物胁迫抗性反应和抗核盘菌、疫霉菌和灰斑菌的生物胁迫抗性反应中，得到的转基因材料通过之后的继代繁殖及鉴定，可以成为稳定的高异黄酮和抗病抗逆遗传材料。本发明对加速高异黄酮抗病抗逆型大豆新品种的育种进程以及提高育种效率具有重要的理论意义和实践价值。

附图说明

图1.pCAMBIA3301-GmTCM1重组质粒的酶切鉴定结果；

图2.GmTCM1基因与其大豆同源基因氨基酸序列比对；

图3.TCM蛋白***发生树；

图4.R5-R8时期GmTCM1基因在大豆籽粒中的表达情况，其中A为R5-R8时期 GmTCM1基因在中豆27和九农20籽粒中的表达情况；B为R5-R8时期GmTCM1基因在品系1和品系2的籽粒中的表达情况；

图5.不同胁迫处理条件下大豆叶片中GmTCM1的表达量，其中，A为NaCl处理下GmTCM1基因的表达；B为PEG处理下GmTCM1基因的表达；C为茉莉酸处理下GmTCM1 基因的表达；D为水杨酸处理下GmTCM1基因的表达；

图6.转GmTCM1基因大豆植株的特异性引物PCR检测；

图7.转GmTCM1基因大豆植株的Bar引物PCR检测；

图8.T1代过表达植株的qRT-PCR检测；

图9.T1代转基因大豆植株Western blotting检测；

图10.T2代转GmTCM1基因植株接种大豆核盘菌后叶片的变化，其中，a为T2代转GmTCM1基因植株接种大豆核盘菌后叶片的变化；

图11.T2代转GmTCM1基因植株接种大豆灰斑菌后叶片的变化；

图12.转基因毛状根的抗大豆疫霉根腐病鉴定；

图13.T2代转GmTCM1基因植株接种大豆疫霉菌后叶片的变化；

图14.过表达GmTCM1基因拟南芥的特异性引物PCR检测；

图15.过表达GmTCM1基因拟南芥的Bar引物PCR检测；

图16.盐胁迫下拟南芥植株的表型分析；

图17.干旱胁迫下拟南芥植株的表型分析；

图18.盐胁迫下拟南芥植株的根长；

图19.干旱胁迫下拟南芥植株的根长。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。此外，核盘菌：公众可以在任意大豆田的发病植株茎内采集获得；

大豆疫霉菌、灰斑病菌、尖镰孢菌：公众可以从东北农业大学获得；大豆品种高异黄酮含量大豆品种中豆27，低异黄酮含量大豆品种九农20：公众可以从东北农业大学获得。

pCAMBIA3301表达载体：购买自优宝生物，产品编号：VT1386，网址：http:// www.youbio.cn/。

公众可以从东北农业大学获得。发根农杆菌、根癌农杆菌、大肠杆菌感受态：公众可以从东北农业大学获得。

实施例1、GmTCM1基因的获得和植物表达载体构建

步骤一、以品种为中豆27的大豆叶片为材料提取总RNA并反转录合成cDNA第一链。

反转录步骤如下：将2μL RNA、1μL oligo(dT)(50μM)和1μL Super Pure dNTP(10mM)混合后，加DPEC水至10μL，将管在65℃下孵育5min，然后在冰上冷却；将4μL 5xPrimeScript II缓冲液、0.5μL RNase-Free Dnase和1μL PrimeScript II RTase混合后，加DPEC水至20μL，将混合物在42℃下孵育1h，95℃下再温育5min，然后在冰上冷却待用。

步骤二、在Phytozome v11.0数据库查找登录号为Glyma.20G114200(GmTCM1)基因的全长序列，如SEQ ID No.4所示。根据Glyma.20G114200(GmTCM1)基因的序列设计一对克隆引物GmTCM1-S/A，并用利用BstEII和BglII位点序列分别修饰上下游引物的5’端：GmTCM1-S序列：5’-GGAAGATCTTCCATTAAATTAAATCCTAGCTACG-3’： GmTCM1-A序列：5’-GGGTTACCTAAGTGCTTGTTTTGTTATGACCTA-3’。

步骤三、步骤一所得cDNA第一链为模板，利用步骤二获得的上游引物GmTCM1-S 和下游引物GmTCM1-A进行PCR扩增，并利用胶回收对PCR产物进行纯化，PCR体系如下：

PCR反应程序：94℃2min；35个循环：94℃10s，63℃30s，72℃1min；72℃10 min，4℃保存，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并且进行纯化。

步骤四、使用Promega公司的pGEM-T克隆试剂盒，将纯化后的PCR产物连接 pGEM-T载体，体系如下：胶回收产物5μL；pGEM-T Easy(50ng/μL)1μL；10×T₄ DNA LigationBuffer 1μL；T₄ DNA Ligase(3U/μL)1μL；ddH₂O 2μL，16℃过夜连接。

连接产物转化DH5α感受态细胞，转化过程如下：在冰上解冻DH5α感受态细胞后，将目的DNA打入离心管底部与100μL感受态细胞混合均匀，冰浴30min。在42℃孵育 45s，然后立即转移到冰上，加入700μL LB液体培养基。在37℃下220rpm振荡孵育1h。 5,000rpm离心1min，弃上清液。将沉淀重悬于100μL LB液体培养基中，然后用无菌涂布棒涂布在含有卡那霉素(Kana(50mg/ml))抗性的LB固体培养基，37℃孵育过夜。挑取单克隆进行PCR及测序验证。结果如图1所示，最终得到目的片段大小为1706bp 的GmTCM1基因，序列如SEQ ID NO.1所示。

利用BstEII和BglII分别双酶切pCAMBIA3301质粒与pGEM-T-GmTCM1载体，酶切反应体系参照New EnliandBioLabs(https://www.neb.com/)提供的双酶切推荐体系和条件，利用T4 DNA连接酶将pCAMBIA3301质粒的酶切片段与GmTCM1基因序列片段进行连接反应，得到pCAMBIA3301-GmTCM1载体。

GmTCM1基因的分析

1.GmTCM1基因的生物信息学分析

对GmTCM1同源基因编码氨基酸序列进行同源比对分析，结果表明GmTCM1(Glyma.20G114200)与Glyma.02G236500、Glyma.10G275600和Glyma.14G205200蛋白质同源性分别为58％、81％和59％。其中，GmTCM1与Glyma.10G275600的蛋白质同源性最高。对候选基因GmTCM1的序列进行同源性比对分析，并通过MEGA5.2软件构建同源进化树。结果表明，GmTCM1与来自菜豆和苜蓿的同源基因相似性较高，推测在功能上可能具有相似性。GmTCM1与大豆Glyma.10G275600具有很高的同源性、与 Glyma.02G236500和Glyma.14G205200基因分属于不同分支，亲缘关系较远。推测 GmTCM1与Glyma.02G236500和Glyma.14G205200基因在进化过程中发生了功能的较大分化；分析不同物种的氨基酸序列，GmTCM1与来自菜豆和苜蓿的同源基因相似性较高，推测在功能上可能具有相似性。在Plantcare软件中输入GmTCM1基因ATG上游1000bp 的序列进行启动子元件的预测，发现该基因上游存多种与胁迫相关的顺式作用元件， TCA-element在响应生物及非生物胁迫中起到重要作用，MYB、I-box、ARE为应激、胁迫相应相关元件，同时MYB转录因子调控异黄酮的积累，因此推测该基因可能参与异黄酮的合成、感受生物及非生物逆境胁迫并参与抗逆或抗病过程。部分实验结果见图2、图 3和表1。

表1 GmTCM1启动子元件分析

2.GmTCM1基因的表达模式分析

以下1)、2)、3)均使用以下引物对：GmTCM1基因荧光定量引物对：qGmTCM1-F: 5'TTTGTACCCTTGCTCCG 3'：qGmTCM11-R:5'TTCACTGATTTCTCCCT 3'；大豆内参基因荧光定量引物对：GmActin4-F：5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3'， GmActin4-R：5’-'GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3'。采用2^-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。

1)大豆籽粒发育过程中GmTCM1基因的表达动态

本研究采用qRT-PCR的方法，以高异黄酮品种中豆27、品系1和低异黄酮品种九农20、品系2为对象，研究大豆籽粒发育过程中GmTCM1基因的表达动态。结果表明， GmTCM1基因在大豆生殖生长后期的高水平表达可能参与异黄酮在籽粒中的积累过程。自R6期至R8期，GmTCM1在高异黄酮材料中的表达量一直高于低异黄酮材料中的表达量，说明GmTCM1基因参与异黄酮积累的过程。

2)非生物胁迫及信号因子处理下GmTCM1基因的表达模式分析

前述GmTCM1基因启动子区存在感知逆境胁迫的顺式作用元件，因此本研究分析了不同非生物逆境胁迫下GmTCM1基因在大豆叶片中的表达模式。结果表明，盐胁迫、干旱胁迫、茉莉酸、水杨酸处理均能诱导大豆中GmTCM1基因的上调表达。

3)三种病原微生物胁迫下GmTCM1基因的表达模式分析

分析3种病原微生物胁迫下GmTCM1基因在两品种大豆叶片中的表达模式。结果表明，叶片在核盘菌、疫霉菌、灰斑病处理下均能诱导大豆中GmTCM1基因的表达，GmTCM1 基因在核盘菌处理后的大豆叶片中表达水平快速增加，在处理12h时达到极值；在疫霉菌胁迫下，GmTCM1基因在根系中表达量呈现先升高后降低的趋势，在处理12h时达到极值，随后下降；在灰斑病菌胁迫下，GmTCM1基因的表达模式与上述两种病害类似。说明该基因的表达对多种大豆的病原真菌均产生响应，在大豆不同组织中均可被病原物诱导。部分结果见图4和图5。

实施例2、GmTCM1在抗生物胁迫方面的应用

1.发根农杆菌介导转化毛状根

将表达载体pCAMBIA3301-GmTCM1的质粒转入到发根农杆菌感受态细胞，并以感病大豆品种东农50为受体进行转化，具体方法如下：

1)受体大豆培养

将土与蛭石按照1:1的比例混合装入小钵中，在种植前用水浇透。将外表光滑无虫啃咬的大豆品种东农50种子均匀种植在小钵内，在温度条件适宜的培养室内暗培养4d。

2)制备发根农杆菌侵染液

培养发根农杆菌的前一天，将携带pCAMBIA3301-GmTCM1质粒的转化菌通过振荡方法进行活化，将活化好的菌液进行离心，离心后在离心管中加入加入5mL灭菌水使沉淀混合均匀。

3)侵染

取合适苗龄的植株进行侵染，在靠近子叶节的胚轴处注射菌体。用针头小心刺穿，将菌液涂抹在植株的伤口处；将伤口处未侵染的菌液用灭过菌的滤纸进行擦拭，擦拭后用一层薄薄的蛭石在伤口处进行覆盖，放置在温度为25℃的培养箱内进行16h的光照与8h 的暗处理。

4)诱导不定根的生成

用清水洗掉根上附着的蛭石，将培养两周左右的大豆主根部分剪掉，放入广口瓶中加入灭菌水进行不定根的诱导。

2.根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节

将重组质粒pCAMBIA3301-GmTCM1转入农杆菌EHA105中，并以感病大豆品种东农50为受体进行大豆子叶节转化，具体方法如下：

1)种子灭菌：将饱满、无菌斑的大豆品种东农50放在培养皿中，加入96mLNaClO 与6mL浓盐酸放入通风良好的通风橱内进行灭菌。

2)种子萌发：在无菌操作台中中，将灭过菌的大豆种子种于MS0萌发培养基中。

3)转化受体的制备：待种子刚刚具有萌发的迹象时用手术刀去掉种皮，将子叶切成两半并刮掉腋芽，在子叶节处轻划4-5道直径约2-4mm伤口。

4)侵染与共培养：将过表达菌体在液体培养基中活化至OD600＝0.6-0.8，5000rpm，离心10min后，用YEP等体积的液体CCM培养基对菌块进行重悬。将子叶节外植体浸入侵染液中置于200rpm,30min的摇床中进行侵染。用灭菌蒸馏水将侵染后的外植体进行清洗，在LCCM共培养培养基中暗培养大约2-3天，根据外植体返青的情况进行下一步。

5)丛生芽的诱导及筛选：将暗培养后的子叶节外植体装入无菌的培养瓶中，用灭菌蒸馏水清洗3遍，用无菌纸将子叶节表面的液体吸干，以与培养基表面45度角斜插在恢复培养基中进行芽诱导。在诱导7-10天后，将丛生芽转移至含有5mg/L PPT的筛选培养基中，筛选7-10天。

6)丛生芽的伸长与生根：取经筛选后的丛生芽，去掉大芽并用解剖刀刮掉丛生芽的黑头，再将其***到伸长培养基中。待伸长20-30天左右，将长出2组三出叶的大豆苗从丛生芽处切下，转移至生根培养基中，待15天左右，将苗转移至土壤中。

3.GmTCM1基因过表达毛状根和植株的创制与抗病鉴定

利用发根农杆菌介导的大豆子叶节转化法，将GmTCM1基因过表达载体转入感病品种东农50根系。共转化100个大豆子叶节，获得80株健康的发根苗。用改进的SDS法提取转GmTCM1基因发根苗的根部的DNA为模板，通过PCR扩增技术鉴定转基因毛状根，目的片段大小为695bp，共得到20个转GmTCM1基因阳性根的发根苗。通过根癌农杆菌介导的大豆遗传转化法，将GmTCM1基因过表达载体转入大豆品种东农50品种中，经PPT筛选，最终得到抗性植株3株。收获鉴定为PPT抗性的T0代植株种子，进行播种，待T1代植株第一组三出复叶完全展开时取植株叶片提取DNA，并用Bar基因引物(引物3)和GmTCM1(引物4)基因特异性引物进行PCR检测，qRT-PCR检测以及Western blotting检测，获得3株阳性的T1代转基因植株。部分结果见图6、图7、图8和图9。

收取T1代中鉴定为转基因植株的大豆并播种，于T2代植株对生真叶完全展开时进行真菌病类原物接种实验，结果发现：接种核盘菌：对照植株叶片病斑扩展变大，几乎分布半个叶片，病斑呈不规则状，中心为深褐色，四周浅褐色，外部有黄色晕圈，呈腐烂状，转GmTCM1基因植株的大豆叶片外部有浅黄色晕圈，病斑变为深褐色，外部浅黄色晕圈变为深黄，病斑扩展变化不大。说明转GmTCM1基因提高了感病品种东农50对核盘菌抗性。灰斑菌离体接种实验:对照植株叶片接菌部位产生深褐色蛙眼状斑纹，病斑中央呈灰色，之后病斑逐渐扩大，病斑中央产生菌丝；转GmTCM1基因的过表达植株叶片接菌部位产生暗绿色蛙眼状病斑，病斑四周呈褐色，之后病斑扩展不明显，初步证明转GmTCM1 基因对大豆灰斑病产生了一定的抗病性。转基因毛状根与野生型大豆根系接种大豆疫霉菌后根部均发生萎蔫状态，野生型大豆根部萎蔫状态与转基因毛状根相比严重且发黑；转基因毛状根接种尖镰孢菌后根部萎蔫与发黑程度与野生型大豆根部相比情况较轻。转 GmTCM1基因的毛状根比空载体的毛状根抗病的效果明显，说明GmTCM1基因可提高大豆根系对大豆疫霉根腐病、大豆尖镰孢根腐病的抗性。疫霉菌在叶片发病不及根系明显，但转基因叶片和野生型在接种后均发病，野生型叶片变黄，叶片接菌部位产生褐色水渍状斑纹，病斑中心为黄褐色，后期叶片黄色加深，病斑扩大；转GmTCM1基因植株的叶片接菌部位产生暗绿色水渍状病斑局部变褐色，叶片不变黄，病斑扩展速度慢。说明转 GmTCM1基因提高了感病品种东农50的抗病性。部分结果见图10、图11、图12和图13。

实施例4、GmTCM1在抗非生物胁迫方面的应用

1)GmTCM1基因转化拟南芥及转化后的筛选

将GmTCM1基因转化到野生型拟南芥中，收获种子，将转基因拟南芥种子播种在含有5mg/L的草铵膦的MS培养基上进行筛选，获得正常生长的具有PPT抗性的拟南芥植株5株，移栽到营养土中，放入22℃恒温培养箱中进行培养。

2)转基因拟南芥的PCR检测

选取转GmTCM1基因的过表达植株的拟南芥莲座叶进行提取DNA，用引物3与引物 4进行PCR鉴定，其中检测得到大小为695bp和400bp的目的片段，在5株PPT阳性植株中鉴定到呈阳性的拟南芥植株2株，将阳性植株单株收种，每代进行PCR检测，直至得到纯合的T3代转基因植株。部分结果见图14和图15。

3)转基因拟南芥在非生物胁迫下表型分析

选取纯合的T3代转基因拟南芥株系及野生型种子播种在含有0mmol/L、125mmol/LNaCl以及125mmol/LPEG的MS培养基中。在125mmol/LNaCl和125mmol/LPEG培养基中野生型植株种子萌发的抑制较转基因拟南芥植株相比严重，转基因的株系萌发率明显高于野生型株系。此外，在根长实验中，发现胁迫下的转基因拟南芥的根长受NaCl和PEG 的影响相对较小。初步说明该基因参与拟南芥对盐和干旱胁迫的抗性反应。部分结果见图 16、图17、图18和图19。

SEQ ID NO.1

名称：GmTCM1的核酸序列

ATGGGTCTTCAAATCAAGGAACCGCTCCTTTTCACTCTTGTAACAATATCACTTATT TCAATTACAAAACTCTTGCATTCTTATTTTTCTATACCTTTCTCTCCATCCAATCTTT CCATTGCTATTGCCACCCTCATTTTTGTTCTAATCTCATACAAATTTTCCTCATCCTC TATAAAACACTCTTCCACTACTCTGCCCCCAGGTCCTCTATCTGTTCCAATATTTGG TAACTGGCTACAAGTTGACAATGACCTTAACCACCGTCTTCTAGCATCAATGTCTCA AACCTATGGTCCCGTGTTCCTACTCAAACTAGGTTCCAAAAACTTGGTCGTGGTCTC TGACCCCGAGCTTGCCACCCAAGTGCTCCACGCACAAGGCGTAGAATTTGGCTCTC GCCCACGGAACGTTGTGTTTGATATCTTCACGGGGAATGGCCAAGACATGGTTTTC ACCGTCTACGGCGACCACTGGCGCAAAATGCGAAGAATAATGACACTGCCATTCTT CACCAACAAGGTTGTCCACAATTACAACAACATGTGGGAGGAGGAGATGGACTTG GTGGTGCGTGACCTCAACGTGAATGAGAGGGTGAGGAGCGAAGGGATAGTTATCA GAAGGCGGCTTCAGCTGATGCTGTACAATATCATGTATAGGATGATGTTTGATGCC AAGTTTGAGTCTCAAGAAGACCCTTTGTTCATTCAGGCCACCAGGTTTAACTCCGA GAGAAGCCGTTTGGCGCAGAGTTTTGAATACAATTACGGGGATTTTATACCCTTGC TCCGGCCATTCTTGAGAGGGTACCTCAACAAGTGCAAGGACTTGCAGTCTAGGAGG TTGGCATTTTTCAACACCCACTACGTTGAGAAAAGAAGACAAATAATGGCTGCCAA TGGGGAGAAGCACAAGATCAGCTGTGCAATGGATCACATCATAGATGCTCAGATG AAGGGAGAAATCAGCGAAGAGAATGTGATCTACATAGTAGAAAACATCAACGTTG CAGCAATTGAGACAACACTATGGTCCATAGAGTGGGCAGTAGCAGAGTTGGTGAA CCATCCAACCGTCCAAAGCAAGATTCGTGATGAGATATCAAAAGTGCTAAAAGGG GAGCCAGTTACAGAATCCAACCTACACGAGCTACCATACTTACAAGCCACGGTGAAAGAGACACTGAGACTTCACACC

CCAATTCCTCTTCTGGTGCCCCACATGAACCTGGAAGAAGCAAAGCTAGGAGGGCA CACTGTTCCAAAAGAGTCAAAGGTGGTGGTGAATGCTTGGTGGCTTGCCAACAACC CTTCATGGTGGAAGAACCCAGAGGAGTTCAGGCCAGAAAGGTTCTTGGAAGAGGA ATGTGCAACAGATGCAGTTGCAGGAGGAAAAGTTGACTTTAGGTTCGTGCCATTTG GTGTGGGAAGGAGGAGTTGCCCTGGGATCATACTTGCATTGCCAATACTGGGGCTT GTGATTGCAAAGTTGGTGAAAAGTTTTCAGATGAGTGCTCCAGCGGGGACAAAGAT TGATGTGAGTGAAAAAGGAGGGCAATTCAGCTTGCACATTGCCAACCACTCCACTG TGTTGTTCCATCCAATTAAGACACTATGA

SEQ ID NO.2

名称：GmTCM1的氨基酸序列

MGLQIKEPLLFTLVTISLISITKLLHSYFSIPFSPSNLSIAIATLIFVLISYKFSSSSIKHSSTTL PPGPLSVPIFGNWLQVDNDLNHRLLASMSQTYGPVFLLKLGSKNLVVVSDPELATQVL HAQGVEFGSRPRNVVFDIFTGNGQDMVFTVYGDHWRKMRRIMTLPFFTNKVVHNYN NMWEEEMDLVVRDLNVNERVRSEGIVIRRRLQLMLYNIMYRMMFDAKFESQEDPLFI QATRFNSERSRLAQSFEYNYGDFIPLLRPFLRGYLNKCKDLQSRRLAFFNTHYVEKRRQ IMAANGEKHKISCAMDHIIDAQMKGEISEENVIYIVENINVAAIETTLWSIEWAVAELVN HPTVQSKIRDEISKVLKGEPVTESNLHELPYLQATVKETLRLHTPIPLLVPHMNLEEAKL GGHTVPKESKVVVNAWWLANNPSWWKNPEEFRPERFLEEECATDAVAGGKVDFRFV PFGVGRRSCPGIILALPILGLVIAKLVKSFQMSAPAGTKIDVSEKGGQFSLHIANHSTVLF HPIKTL

SEQ ID NO.3

名称：上游引物GmTCM1-S的序列

GGAAGATCTTCCATTAAATTAAATCCTAGCTACG

SEQ ID NO.4

名称：下游引物GmTCM1-A的序列

GGGTTACCTAAGTGCTTGTTTTGTTATGACCTA

SEQ ID NO.5

名称：基因GmTCM1的参考序列

ATGGGTCTTCAAATCAAGGAACCGCTCCTTTTCACTCTTGTAACAATATCACTTATTT CAATTACAAAACTCTTGCATTCTTATTTTTCTATACCTTTCT

CTCCATCCAATCTTTCCATTGCTATTGCCACCCTCATTTTTGTTCTAATCTCATACAAAT TTTCCTCATCCTCTATAAAACACTCTTCCACTACTCTGCC

CCCAGGTCCTCTATCTGTTCCAATATTTGGTAACTGGCTACAAGTTGGCAATGACCTT AACCACCGTCTTCTAGCATCAATGTCTCAAACCTATGGTCCC

GTGTTCCTACTCAAACTAGGTTCCAAAAACTTGGTCGTGGTCTCTGACCCCGAGCTT GCCACCCAAGTGCTCCACGCACAAGGCGTAGAATTTGGCTCTCGCCCACGGAACGT TGTGTTTGATATCTTCACGGGGAATGGCCAAGACATGGTTTTCACCGTCTACGGCGA CCACTGGCGCAAAATGCGAAGAATAATGACACTGCCATTCTTCACCAACAAGGTTGT CCACAATTACAGCAACATGTGGGAGGAGGAGATGGACTTGGTGGTGCGTGACCTCA ACGTGAATGAGAGGGTGAGGAGCGAAGGGATAGTTATCAGAAGGCGGCTTCAGCTG ATGCTGTACAATATCATGTATAGGATGATGTTTGATGCCAAGTTTGAGTCTCAAGAAG ACCCTTTGTTCATTCAGGCCACCAGGTTTAACTCCGAGAGAAGCCGTTTGGCGCAG AGTTTTGAATACAATTACGGGGATTTTATACCCTTGCTCCGGCCATTCTTGAGAGGGT ACCTCAACAAGTGCAAGGACTTGCAGTCTAGGAGGTTGGCATTTTTCAACACCCAC TACGTTGAGAAAAGAAGACAAATAATGGCTGCCAATGGGGAGAAGCACAAGATCA GCTGTGCAATGGATCACATCATAGATGCTCAGATGAAGGGAGAAATCAGCGAAGAG AATGTGATCTACATAGTAGAAAACATCAACGTTGCAGCAATTGAGACAACACTATGG TCCATAGAGTGGGCAGTAGCAGAGTTGGTGAACCATCCAACCGTCCAAAGCAAGAT TCGTGATGAGATATCAAAAGTGCTAAAAGGGGAGCCAGTTACAGAATCCAACCTAC ACGAGCTACCATACTTACAAGCCACGGTGAAAGAGACACTGAGACTTCACACCCCA ATTCCTCTTCTGGTGCCCCACATGAACCTGGAAGAAGCAAAGCTAGGAGGGCACAC TGTTCCAAAAGAGTCAAAGGTGGTGGTGAATGCTTGGTGGCTTGCCAACAACCCTT CATGGTGGAAGAACCCAGAGGAGTTCAGGCCAGAAAGGTTCTTGGAAGAGGAATG TGCAACAGATGCAGTTGCAGGAGGAAAAGTTGACTTTAGGTTCGTGCCATTTGGTG TGGGAAGGAGGAGTTGCCCTGGGATCATACTTGCATTGCCAATACTGGGGCTTGTGA TTGCAAAGTTGGTGAAAAGTTTTCAGATGAGTGCTCCAGCGGGGACAAAGATTGAT GTGAGTGAAAAAGGAGGGCAATTCAGCTTGCACATTGCCAACCACTCCACTGTGTT GTTCCATCCAATTAAGACACTATGA

SEQ ID NO.6

名称：GmTCM1基因荧光定量PCR上游引物qGmTCM1-F

5'-TTTGTACCCTTGCTCCG-3'

SEQ ID NO.7

名称：GmTCM1基因荧光定量PCR下游引物qGmTCM1-R

5'-TTCACTGATTTCTCCCT-3'

SEQ ID NO.8

名称：大豆内参基因荧光定量PCR上游引物GmActin4-F

5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3'

SEQ ID NO.9

名称：大豆内参基因荧光定量PCR下游引物GmActin4-R

5’-'GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3' 。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 大豆基因GmTCM1及其获得方法与应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> GmTCM1的核酸序列

<400> 1

atgggtcttc aaatcaagga accgctcctt ttcactcttg taacaatatc acttatttca 60

attacaaaac tcttgcattc ttatttttct atacctttct ctccatccaa tctttccatt 120

gctattgcca ccctcatttt tgttctaatc tcatacaaat tttcctcatc ctctataaaa 180

cactcttcca ctactctgcc cccaggtcct ctatctgttc caatatttgg taactggcta 240

caagttgaca atgaccttaa ccaccgtctt ctagcatcaa tgtctcaaac ctatggtccc 300

gtgttcctac tcaaactagg ttccaaaaac ttggtcgtgg tctctgaccc cgagcttgcc 360

acccaagtgc tccacgcaca aggcgtagaa tttggctctc gcccacggaa cgttgtgttt 420

gatatcttca cggggaatgg ccaagacatg gttttcaccg tctacggcga ccactggcgc 480

aaaatgcgaa gaataatgac actgccattc ttcaccaaca aggttgtcca caattacaac 540

aacatgtggg aggaggagat ggacttggtg gtgcgtgacc tcaacgtgaa tgagagggtg 600

aggagcgaag ggatagttat cagaaggcgg cttcagctga tgctgtacaa tatcatgtat 660

aggatgatgt ttgatgccaa gtttgagtct caagaagacc ctttgttcat tcaggccacc 720

aggtttaact ccgagagaag ccgtttggcg cagagttttg aatacaatta cggggatttt 780

atacccttgc tccggccatt cttgagaggg tacctcaaca agtgcaagga cttgcagtct 840

aggaggttgg catttttcaa cacccactac gttgagaaaa gaagacaaat aatggctgcc 900

aatggggaga agcacaagat cagctgtgca atggatcaca tcatagatgc tcagatgaag 960

ggagaaatca gcgaagagaa tgtgatctac atagtagaaa acatcaacgt tgcagcaatt 1020

gagacaacac tatggtccat agagtgggca gtagcagagt tggtgaacca tccaaccgtc 1080

caaagcaaga ttcgtgatga gatatcaaaa gtgctaaaag gggagccagt tacagaatcc 1140

aacctacacg agctaccata cttacaagcc acggtgaaag agacactgag acttcacacc 1200

ccaattcctc ttctggtgcc ccacatgaac ctggaagaag caaagctagg agggcacact 1260

gttccaaaag agtcaaaggt ggtggtgaat gcttggtggc ttgccaacaa cccttcatgg 1320

tggaagaacc cagaggagtt caggccagaa aggttcttgg aagaggaatg tgcaacagat 1380

gcagttgcag gaggaaaagt tgactttagg ttcgtgccat ttggtgtggg aaggaggagt 1440

tgccctggga tcatacttgc attgccaata ctggggcttg tgattgcaaa gttggtgaaa 1500

agttttcaga tgagtgctcc agcggggaca aagattgatg tgagtgaaaa aggagggcaa 1560

ttcagcttgc acattgccaa ccactccact gtgttgttcc atccaattaa gacactatga 1620

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> GmTCM1的氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Leu Gln Ile Lys Glu Pro Leu Leu Phe Thr Leu Val Thr Ile

1 5 10 15

Ser Leu Ile Ser Ile Thr Lys Leu Leu His Ser Tyr Phe Ser Ile Pro

20 25 30

Phe Ser Pro Ser Asn Leu Ser Ile Ala Ile Ala Thr Leu Ile Phe Val

35 40 45

Leu Ile Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Ser Ser Ile Lys His Ser Ser Thr

50 55 60

Thr Leu Pro Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Ile Phe Gly Asn Trp Leu

65 70 75 80

Gln Val Asp Asn Asp Leu Asn His Arg Leu Leu Ala Ser Met Ser Gln

85 90 95

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Leu Leu Lys Leu Gly Ser Lys Asn Leu Val

100 105 110

Val Val Ser Asp Pro Glu Leu Ala Thr Gln Val Leu His Ala Gln Gly

115 120 125

Val Glu Phe Gly Ser Arg Pro Arg Asn Val Val Phe Asp Ile Phe Thr

130 135 140

Gly Asn Gly Gln Asp Met Val Phe Thr Val Tyr Gly Asp His Trp Arg

145 150 155 160

Lys Met Arg Arg Ile Met Thr Leu Pro Phe Phe Thr Asn Lys Val Val

165 170 175

His Asn Tyr Asn Asn Met Trp Glu Glu Glu Met Asp Leu Val Val Arg

180 185 190

Asp Leu Asn Val Asn Glu Arg Val Arg Ser Glu Gly Ile Val Ile Arg

195 200 205

Arg Arg Leu Gln Leu Met Leu Tyr Asn Ile Met Tyr Arg Met Met Phe

210 215 220

Asp Ala Lys Phe Glu Ser Gln Glu Asp Pro Leu Phe Ile Gln Ala Thr

225 230 235 240

Arg Phe Asn Ser Glu Arg Ser Arg Leu Ala Gln Ser Phe Glu Tyr Asn

245 250 255

Tyr Gly Asp Phe Ile Pro Leu Leu Arg Pro Phe Leu Arg Gly Tyr Leu

260 265 270

Asn Lys Cys Lys Asp Leu Gln Ser Arg Arg Leu Ala Phe Phe Asn Thr

275 280 285

His Tyr Val Glu Lys Arg Arg Gln Ile Met Ala Ala Asn Gly Glu Lys

290 295 300

His Lys Ile Ser Cys Ala Met Asp His Ile Ile Asp Ala Gln Met Lys

305 310 315 320

Gly Glu Ile Ser Glu Glu Asn Val Ile Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn

325 330 335

Val Ala Ala Ile Glu Thr Thr Leu Trp Ser Ile Glu Trp Ala Val Ala

340 345 350

Glu Leu Val Asn His Pro Thr Val Gln Ser Lys Ile Arg Asp Glu Ile

355 360 365

Ser Lys Val Leu Lys Gly Glu Pro Val Thr Glu Ser Asn Leu His Glu

370 375 380

Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Thr Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Thr

385 390 395 400

Pro Ile Pro Leu Leu Val Pro His Met Asn Leu Glu Glu Ala Lys Leu

405 410 415

Gly Gly His Thr Val Pro Lys Glu Ser Lys Val Val Val Asn Ala Trp

420 425 430

Trp Leu Ala Asn Asn Pro Ser Trp Trp Lys Asn Pro Glu Glu Phe Arg

435 440 445

Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Glu Cys Ala Thr Asp Ala Val Ala Gly

450 455 460

Gly Lys Val Asp Phe Arg Phe Val Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser

465 470 475 480

Cys Pro Gly Ile Ile Leu Ala Leu Pro Ile Leu Gly Leu Val Ile Ala

485 490 495

Lys Leu Val Lys Ser Phe Gln Met Ser Ala Pro Ala Gly Thr Lys Ile

500 505 510

Asp Val Ser Glu Lys Gly Gly Gln Phe Ser Leu His Ile Ala Asn His

515 520 525

Ser Thr Val Leu Phe His Pro Ile Lys Thr Leu

530 535

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 上游引物GmTCM1-S的序列

<400> 3

ggaagatctt ccattaaatt aaatcctagc tacg 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 下游引物GmTCM1-A的序列

<400> 4

gggttaccta agtgcttgtt ttgttatgac cta 33

<210> 5

<211> 1620

<212> DNA

<213> 基因GmTCM1的参考序列

<400> 5

atgggtcttc aaatcaagga accgctcctt ttcactcttg taacaatatc acttatttca 60

attacaaaac tcttgcattc ttatttttct atacctttct ctccatccaa tctttccatt 120

gctattgcca ccctcatttt tgttctaatc tcatacaaat tttcctcatc ctctataaaa 180

cactcttcca ctactctgcc cccaggtcct ctatctgttc caatatttgg taactggcta 240

caagttggca atgaccttaa ccaccgtctt ctagcatcaa tgtctcaaac ctatggtccc 300

gtgttcctac tcaaactagg ttccaaaaac ttggtcgtgg tctctgaccc cgagcttgcc 360

acccaagtgc tccacgcaca aggcgtagaa tttggctctc gcccacggaa cgttgtgttt 420

gatatcttca cggggaatgg ccaagacatg gttttcaccg tctacggcga ccactggcgc 480

aaaatgcgaa gaataatgac actgccattc ttcaccaaca aggttgtcca caattacagc 540

aacatgtggg aggaggagat ggacttggtg gtgcgtgacc tcaacgtgaa tgagagggtg 600

aggagcgaag ggatagttat cagaaggcgg cttcagctga tgctgtacaa tatcatgtat 660

aggatgatgt ttgatgccaa gtttgagtct caagaagacc ctttgttcat tcaggccacc 720

aggtttaact ccgagagaag ccgtttggcg cagagttttg aatacaatta cggggatttt 780

atacccttgc tccggccatt cttgagaggg tacctcaaca agtgcaagga cttgcagtct 840

aggaggttgg catttttcaa cacccactac gttgagaaaa gaagacaaat aatggctgcc 900

aatggggaga agcacaagat cagctgtgca atggatcaca tcatagatgc tcagatgaag 960

ggagaaatca gcgaagagaa tgtgatctac atagtagaaa acatcaacgt tgcagcaatt 1020

gagacaacac tatggtccat agagtgggca gtagcagagt tggtgaacca tccaaccgtc 1080

caaagcaaga ttcgtgatga gatatcaaaa gtgctaaaag gggagccagt tacagaatcc 1140

aacctacacg agctaccata cttacaagcc acggtgaaag agacactgag acttcacacc 1200

ccaattcctc ttctggtgcc ccacatgaac ctggaagaag caaagctagg agggcacact 1260

gttccaaaag agtcaaaggt ggtggtgaat gcttggtggc ttgccaacaa cccttcatgg 1320

tggaagaacc cagaggagtt caggccagaa aggttcttgg aagaggaatg tgcaacagat 1380

gcagttgcag gaggaaaagt tgactttagg ttcgtgccat ttggtgtggg aaggaggagt 1440

tgccctggga tcatacttgc attgccaata ctggggcttg tgattgcaaa gttggtgaaa 1500

agttttcaga tgagtgctcc agcggggaca aagattgatg tgagtgaaaa aggagggcaa 1560

ttcagcttgc acattgccaa ccactccact gtgttgttcc atccaattaa gacactatga 1620

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> GmTCM1基因荧光定量PCR上游引物qGmTCM1-F

<400> 6

tttgtaccct tgctccg 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> GmTCM1基因荧光定量PCR下游引物qGmTCM1-R

<400> 7

ttcactgatt tctccct 17

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 大豆内参基因荧光定量PCR上游引物GmActin4-F

<400> 8

gtgtcagcca tactgtcccc attt 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 大豆内参基因荧光定量PCR下游引物GmActin4-R

<400> 9

gtttcaagct cttgctcgta atca 24

Claims

1.一种大豆基因GmTCM1，其特征在于，所述大豆基因GmTCM1的核酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的大豆基因GmTCM1，其特征在于，所述大豆基因GmTCM1是从高异黄酮含量的大豆品种中豆27中克隆出来的。

3.权利要求1所述大豆基因GmTCM1的获得方法，其特征在于，所述获得方法步骤如下：

步骤二、以登录号为Glyma.20G114200的基因全长序列作为基因GmTCM1的参考序列设计一对克隆引物，并利用限制性内切酶BstEII修饰上游引物，得到上游引物GmTCM1-S，利用限制性内切酶BglII修饰下游引物，得到下游引物GmTCM1-A；

步骤三、以步骤一得到的cDNA为模板，利用步骤二获得的上、下游引物进行PCR扩增，并利用胶回收对PCR产物进行纯化；

4.根据权利要求3所述获得方法，其特征在于，所述上游引物GmTCM1-S的序列如SEQ IDNO.3所示，所述下游引物GmTCM1-A的序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求3所述的获得方法，其特征在于，所述基因GmTCM1的参考序列如SEQ IDNo.5所示。

6.权利要求1所述大豆基因GmTCM1在抗生物胁迫和非生物胁迫中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物胁迫是指大豆真菌病害。

8.根据权力要求6所述的应用，其特征在于，所述非生物胁迫是指干旱和盐胁迫。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述真菌病害是指由核盘菌、疫霉菌和灰斑菌引起的大豆病害中的一种或两种以上。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是通过过量表达GmTCM1基因得到转基因大豆植株，再将得到的转基因大豆植株通过之后的继代繁殖及鉴定，获得稳定的高异黄酮抗病抗逆遗传材料。