CN111334492A - 西瓜几丁质酶及其编码基因和应用 - Google Patents

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张海英
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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及西瓜几丁质酶及其编码基因和应用。西瓜几丁质酶蛋白质具有序列表中序列1所示的序列组成，其编码基因具有序列表中序列2所示的序列组成。本发明还涉及西瓜几丁质酶蛋白质和西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜枯萎病抗性中的应用。本发明还提供了一种西瓜抗枯萎病株系的获得方法。本发明提供的西瓜几丁质酶及其编码基因与枯萎病抗性密切相关，表达量越高，对枯萎病的抗性越强；因此，通过在西瓜植株中过表达西瓜几丁质酶，可以获得稳定的抗枯萎病的西瓜株系，为抗枯萎病西瓜育种提供了一种快捷、高效的途径。

Description

西瓜几丁质酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种西瓜几丁质酶及其编码基因和应用。
背景技术
几丁质为N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚化合物，是构成真菌细胞壁骨架的主要成分，而植物细胞的细胞壁中不含几丁质。几丁质酶是以几丁质为底物并将其水解为N-乙酰寡糖和葡萄糖的酶系。几丁质酶广泛存在于高等植物中，在植物的各组织部位中均有几丁质酶的分布，只是在正常条件下这些几丁质酶的含量较少活性很低。
西瓜(Citullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai)是世界上重要的园艺作物，我国的西瓜栽培面积、总产量与人均消费量均居世界首位。由于大棚种植长期连作引起连作障碍导致土壤理化性质发生变化，病原菌增加，极易引发病害，特别是枯萎病的大规模爆发已成为制约西瓜生产的重要因素。
西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveurn，FON)专性寄生引发的土传真菌病害，其病原菌生理小种有4个，生理小种1(FON1)是中国致病力最强、存在范围最广的生理小种。前期遗传研究表明，西瓜抗枯萎病基因由单个显性基因Fon-1控制。
多年来，人们采用传统常规选育等方法解决西瓜品种抗枯萎病问题，但往往耗资大、工作量大和选择效率不高。因此，如何解决常规育种中的这些问题，快速获得稳定的西瓜枯萎病抗性株系，是实践中急需的重要技术问题。
发明内容
经过发明人的大量综合试验发现，西瓜几丁质酶(也可称为ClCHI1蛋白)基因ClCHI1在西瓜的枯萎病抗病中起重要作用。在此基础上本发明的发明人克隆了西瓜几丁质酶基因ClCHI1，构建了ClCHI1的转基因敲除和过表达载体转化西瓜获得转基因西瓜材料，明确了ClCHI1在枯萎病抗性中的作用。基于此，本发明提供了一种西瓜几丁质酶及其编码基因ClCHI1和应用。
本发明第一方面提供了一种西瓜几丁质酶蛋白质，为如下任意一种：
1)序列表中序列1所示的蛋白质；
2)在1)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
3)在1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加得到的具有西瓜几丁质酶活性的蛋白质；
4)与1)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有西瓜几丁质酶活性的蛋白质。
本发明第二方面提供了西瓜几丁质酶的编码核酸序列，为如下任意一种：
1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子，也即西瓜几丁质酶基因ClCHI1；
2)与1)具有90％以上同一性且编码西瓜几丁质酶的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)任意一种限定的核苷酸序列杂交且编码西瓜几丁质酶的DNA分子。
本发明第三方面提供了根据本发明第一方面提供的西瓜几丁质酶蛋白质或根据本发明第二方面提供的西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜枯萎病抗性中的应用。
根据本发明的第三方面，优选地，所述应用包括将西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达的操作。
根据本发明的第三方面，优选地，所述将西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达的操作包括构建包括西瓜几丁质酶的编码核酸序列的重组载体，并将所述重组载体转化西瓜植株的操作。
根据本发明的第三方面，优选地，所述重组载体为Super1300-GFP-ClCHI1重组质粒。
根据本发明的第三方面，优选地，将所述重组载体转化西瓜植株的操作包括将所述重组载体导入农杆菌菌株GV3101，再利用导入了重组载体的农杆菌菌株GV3101将所述西瓜几丁质酶的编码核酸序列导入西瓜植株，进而使得所述西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达。
本发明第四方面提供了一种西瓜抗枯萎病株系的获得方法，所述方法包括将根据本发明的第二方面的西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达，然后筛选在西瓜植株中稳定过表达西瓜几丁质酶的株系，将所述稳定过表达西瓜几丁质酶的株系连续自交，从而获得稳定的抗枯萎病的西瓜株系。
根据本发明的第四方面，优选地，将所述稳定过表达西瓜几丁质酶的株系连续自交至少三代，从而获得稳定的抗枯萎病的西瓜株系。
本发明提供的西瓜几丁质酶及其编码基因与枯萎病抗性密切相关，表达量越高，对枯萎病的抗性越强。因此，通过在西瓜植株中过表达西瓜几丁质酶，可以获得稳定的抗枯萎病的西瓜株系，为抗枯萎病西瓜育种提供了一种快捷、高效的途径。
附图说明
图1为实施例1中西瓜各组织部位ClCHI1基因的相对表达量的示意图。
图2为实施例3中野生型YX、以及ClCHI1过表达的转基因纯合株系OE1和OE2中的ClCHI1基因的相对表达量比较示意图。
图3为实施例4中ClCHI1基因敲除西瓜株系(CRISPR-1和CRISPR-2)、ClCHI1基因过表达转基因西瓜株系(OE1和OE2)、抗枯萎病的JX2和感枯萎病的YX对枯萎病的田间抗病性鉴定示意图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商家购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
pBSE401质粒记载在如下文献中：A CRISPR/Cas9 toolkit for mμLtiplexgenome editing in plants.Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,WangXC,Chen QJ.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327.10.1186/s12870-014-0327-y。
BM培养基：将0.44g MS培养基、3g蔗糖和0.8g琼脂溶于100mL去离子水，调节pH值为5.8，高温高压灭菌15min。MS培养基为PhytoTech公司的产品。
共培养培养基：含1.5mg/L 6-BA的BM培养基。
选择培养基1：含100mg/L Timentin和1.5mg/L Basta的共培养培养基。
选择培养基2：含100mg/L Timentin和2.0mg/L Basta的共培养培养基。
芽伸长培养基：含0.1mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、100mg/L Timentin和1.5mg/LBasta的BM培养基。
生根培养基：含1mg/L IBA的BM培养基。
实施例1
本实施例用来说明西瓜几丁质酶蛋白及其编码基因的发现、克隆及定位。
一、西瓜几丁质酶蛋白及其编码基因的发现
通过前期对FON1基因的精细定位和功能研究，利用西瓜数据库检索并比较其它物种的相关基因序列，从西瓜品种97103中获得一个新蛋白，将其命名为西瓜几丁质酶，其序列如序列表中的序列1所示(由291个氨基酸残基组成)。将编码西瓜几丁质酶的基因命名为ClCHI1基因，其cDNA的开放阅读框如序列表中的序列2所示(由876个核苷酸组成)。
为了分析ClCHI1基因与其他物种的同源基因序列的差异，首先用MμLtalinwebsite(http://mμLtalin.toμLouse.inra.fr/mμLtalin/)中的a hierarchicalclustering approach同源比对西瓜几丁质酶的氨基酸序列与其他物种同源基因的氨基酸序列。多序列比对结果如下：这些同源基因的氨基酸序列N末端都含有一个长约40个氨基酸的富含Cys的信号肽序列(主要功能是结合几丁质)，然后通过绞链区连接一个高度保守的酶活催化功能区。
二、ClCHI1基因的克隆
使用华越洋试剂盒抽提西瓜叶片RNA(试剂盒购自华越洋生物(北京)科技有限公司，抽提按照提供的说明书操作)，用M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(购自Promega公司，按照试剂盒说明书操作)，所得的第一链cDNA用于扩增ClCHI1基因全长。
根据西瓜基因组(http://cucurbitgenomics.org/,V1)数据库得到的ClCHI1基因序列，设计两条特异性引物，用于PCR反应扩增ClCHI1基因序列，所述两条引物如下：
上游引物：5’-ATGGCTTCCCACAAAATAAC-3’；
下游引物：5’-TCAGATGCTGCCTTTAATGG-3’。
20μL的PCR反应体系为：10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO41.4μL、模板cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、ddH2O 12.4μL。
PCR扩增程序为：阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃、15s，56℃、30s，68℃、3min，共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。
取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带(即876bp的序列2，位于琼脂糖凝胶上的900bp附近)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书。
回收完的片段末端需要加A，加A的10μL反应体系为：10×Buffer 1μL、dATP 1μL、Taq酶0.5μL、回收片段7.5μL，72℃反应半小时。将加A后的回收片段与PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)连接，操作按照TaKaRa公司的说明书进行。连接的反应体系为：加A后的片段4.5μL、PMD18-T 0.5μL、Solution I 5μL，总体积为10μL；于16℃连接过夜。
取5μL的连接产物，采用热击法(参照J.萨姆布鲁克，等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序验证(测序工作由北京擎科新业生物技术有限公司完成)，测序结果表明，该序列全长876bp，正是编码序列1的291个氨基酸的完整的ORF阅读框。
三、ClCHI1基因的组织特异性表达
通过荧光实时定量PCR对西瓜品种97103中ClCHI1基因的组织特异性表达情况进行分析。
用于检测组织特异性表达的PCR模板为西瓜各部位的总RNA反转录得到的cDNA。cDNA的获得方式如上所述。
荧光实时定量PCR所用的引物对如下：
上游引物：5’-GGAGTCAGTGGACGACGTTT-3’；
下游引物：5’-GTCGCTGTAGCCACTGTCAA-3’。
以西瓜Actin基因作为对照。用于鉴定西瓜Actin基因的引物对为：
上游引物：5’-CCTACAACTCAATTATGAAGTGTG-3；
下游引物：5’-GAAATCCACATCTGCTGGAAGGTG-3’。
PCR程序为：94℃变性30s；94℃变性5s、60℃退火35s、40个循环。
荧光实时定量PCR所用的仪器为ABI 7500Fast(Applied Biosystem)，ClCHI1基因的相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。西瓜各组织部位ClCHI1基因的相对表达量见图1。从图1可见，ClCHI1基因在西瓜不同组织中均有一定的表达量，而在根中的表达量明显较高。
由于枯萎病的病菌FON主要侵染植株的根部，影响根部的生长发育，从而造成植株的枯萎，因此，ClCHI1基因在西瓜根中的表达量明显较高，说明该基因可能与西瓜抗枯萎病有较为重要的关系。
实施例2
本实施例用来说明CRISPR敲除ClCHI1植株的获得。
一、CRISPR-ClCHI1敲除载体的构建
1、以终浓度为10ng/μL的pCBC-DT1T2为模板进行四引物PCR扩增。
四引物的序列组成如下。
DT1-BsF-ClCHI1的序列组成：
5’-ATATATGGTCTCGATTG ATTGGACACTGCGGCGCGGGTT-3’；
DT1-F0-ClCHI1的序列组成：
5’-TG ATTGGACACTGCGGCGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
DT2-R0-ClCHI1的序列组成：
5’-AACCGGCTTTGGCAAGATTTGACAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；
DT2-BsR-ClCHI1的序列组成：
5’-ATTATTGGTCTCGAAAC CGGCTTTGGCAAGATTTGA CAA-3’。
20μL PCR反应体系为：pCBC-DT1T2模板、10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO4 1.4μL、cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、四引物分别为0.3μL、ddH2O 11.8μL。
四引物中，DT1-BsF-ClCHI1和DT1-F0-ClCHI1的浓度均为100μmol/L；DT2-R0-ClCHI1和DT2-BsR-ClCHI1的浓度均为5μmol/L。
PCR扩增程序为：
阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃，15s；56℃，30s；68℃，3min；共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。
取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳完毕后在紫外灯下切下目的条带(626bp)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书。
2、利用步骤1纯化回收的PCR产物，建立如下酶切-连接体系：
Figure BDA0002392816660000081
3、取5μL步骤2的酶切-连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。然后用Kan板筛选转化的大肠杆菌感受态细胞，将长出的阳性大肠杆菌克隆用PBSE401载体的引物对U626-IDF和U629-IDR，进行PCR扩增。其中，U626-IDF和U629-IDR的引物序列如下：
U626-IDF:5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；
U629-IDR:5’-AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC-3’。
PCR扩增的反应体系(13μL)为：
1.3μL含15mM MgCl2的10×EasyTaq PCR Buffer；0.8μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.4U PCR Taq DNA聚合酶；0.5μL 10mM的U626-IDF，0.5μL 10mM的U629-IDR；模板DNA；ddH2O补足到13μL。
其中，模板DNA为1.0μL的OD值为0.8(OD值至少为0.8，一般为0.8-1.0)的阳性大肠杆菌菌液；Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
PCR扩增的反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃20s，共34个循环；阶段3：72℃延伸4min；阶段4：4℃保存。
其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。
将PCR产物送北京擎科生物科技有限公司用引物U626-IDF和U629-IDF测序，若测序正确后即可进行后续操作。
其中，U626-IDF的引物序列如上所述，U629-IDF的引物序列如下：
U629-IDF:5’-TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC-3’。
4、将步骤3获得的测序正确的阳性大肠杆菌提质粒(该质粒即为CRISPR-ClCHI1敲除载体)，并用质粒转化农杆菌GV3101。然后用Kan板筛选并按照步骤3的方法进行PCR鉴定(本步骤中的模板DNA为1.0μL的OD值为0.8(OD值至少为0.8，一般为0.8-1.0)的阳性农杆菌GV3101菌液)，经鉴定能扩增出目的片段的克隆即为阳性农杆菌GV3101克隆，将阳性农杆菌GV3101克隆用于后续的西瓜转化。
二、CRISPR-ClCHI1敲除转基因西瓜的遗传转化过程
1、取饱满的JX2西瓜种子，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，先用10％(m/v，质量百分比浓度)的次氯酸钠水溶液消毒15min，然后用无菌水洗涤3次，轻轻置于盛有BM培养基(经高压灭菌)的培养皿，28℃暗培养3天，使得西瓜种子萌动。
2、取步骤1获得的健康萌动的种仁，自子叶近轴端，切成1.5mm×1.5mm的外植体，将外植体放入盛有10mL的MS液体培养基的培养皿(规格为9cm)中。然后向培养皿中加入OD600在0.8-1.0的经鉴定为阳性的农杆菌GV3101克隆的菌液50μL，混匀，浸泡10min后，滤干菌液，将外植体转入共培养培养基中，28℃黑暗条件下共培养4天，获得共培养后的外植体。
3、将步骤2获得的共培养后的外植体于选择培养基1上，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)2-4周，每周继代1次(即更换一次选择培养基1)。然后将外植体转移至选择培养基2，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)2-4周，每周继代1次，即得到含有绿色幼芽的植物组织。
4、将步骤3获得的含有绿色幼芽的植物组织上的绿色幼芽转移至芽伸长培养基，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)4周，每周继代1次，得到抗性幼苗。
5、将步骤4获得的抗性幼苗转移至生根培养基，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)7天，得到再生植株，即T0代转基因植株。
三、T0代转基因植株的鉴定：
1、采用Bar免疫检测试纸条鉴定T0代转基因植株。具体地，取步骤二获得的T0代转基因植株的叶片0.1g，放入2mL离心管中，加蒸馏水研磨，得到样品液。
2、将Bar免疫检测试纸(北京奥创金标生物技术有限公司的产品)垂直***步骤1的2mL离心管的样品液中，试纸端淹没入样品液的深度约为0.5cm，1min后取出放平阅读检测结果。
3、检测线及对照线一般可在1-2min内出现，检测标准为：在检测条上仅出现一条***质控线，则为阴性结果；在检测条上出现两条***条带(其中一条为***检测线，另一条为***质控线)时，则为阳性结果，也即该样品对应的植株为T0代阳性转基因植株。
经鉴定，共获得54棵T0代阳性转基因植株。
四、突变类型的分子检测及纯合敲除ClCHI1植株的获得
1、分别以T0代阳性转基因植株叶片的基因组DNA为模板，以ClCHI1-IDF和ClCHI1-IDR为引物进行PCR扩增。
ClCHI1-IDF和ClCHI1-IDR的引物序列组成如下：
ClCHI1-IDF：5’-ATGGCTTCCCACAAAATAAC-3’；
ClCHI1-IDR：5’-GATGCTGCCTTTAATGGCG-3’。
20μL的PCR反应体系为：模板(T0代阳性转基因植株叶片的基因组DNA)、10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO4 1.4μL、cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、ClCHI1-IDF引物0.3μL、ClCHI1-IDR引物0.3μL、ddH2O12.4μL。
PCR扩增的程序为：阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃、15s，56℃、30s，68℃、3min，共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。
将获得的PCR扩增产物测序。测序结果表明，54棵T0代阳性转基因植株中，37株的基因型与野生型(即未转基因西瓜JX2株系植株)的基因型完全一致、靶点区并未发生编辑，17株靶点区域的全部或部分+G均为杂合突变，杂合突变株中ClCHI1基因的突变形式为在序列表中序列2(即ClCHI1基因)自5’末端起第530位核苷酸残基之后***一个G。
2、将步骤1的17株含有ClCHI1基因杂合敲除的转基因植株自交，收种获得T1代种子，采用上述步骤1中的方法鉴定T1代植株是否转基因和含有ClCHI1突变。鉴定结果表明，T1代植株中，含有ClCHI1突变的纯合植株约占25％。
3、将来自不同株系的上述含有ClCHI1突变的T1代纯合植株分别自交，收种获得ClCHI1基因敲除的、来自不同株系的T2代转基因种子。将来自两个不同株系的T2代转基因种子播种，获得ClCHI1基因敲除的两个纯合株系CRISPR-1和CRISPR-2，用于后续抗病鉴定实验。
实施例3
本实施例用来说明转基因过表达ClCHI1植株的获得。
一、重组质粒Super1300-GFP-ClCHI1的构建
1、提取抗枯萎病西瓜品种“JX2”叶片的总RNA并反转录为cDNA。
2、根据植物二元转化载体super1300(该载体由中国农业大学生物技术学院巩志忠教授实验室惠赠)的多克隆位点和ClCHI1基因的编码区序列，设计出扩增ClCHI1基因整个的编码区的正向和反向引物，所用的正、反向引物5’端分别加有相应酶切位点(酶切位点序列加下划线表示，所用的酶为Xba1和Kpn1)，并在酶切位点识别序列外侧加保护碱基，以利于酶切反应的顺利进行。所述相应引物对的DNA序列如下：
正向引物F1：5’-CTCTAGAATGGCTTCCCACAAAATAAC-3’。
其中，下划线部分的TCTAGA为Xba1的酶切位点序列。
反向引物R1：5’-GGGTACCGATGCTGCCTTTAATGGCG-3’。
其中，下划线部分的GGTACC为Kpn1的酶切位点序列。
以步骤1得到的cDNA为模板，用上述正向引物F1和反向引物R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(即ClCHI1基因)。
20μL的PCR反应体系为：10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO41.4μL、模板cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、正向引物F1和反向引物R1分别为0.3μL、ddH2O 12.4μL。
PCR扩增程序为：阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃、15s，56℃、30s，68℃、3min，共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。
3、用限制性内切酶XbaI和Kpn1双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。再用限制性内切酶XbaI和Kpn1双酶切Super1300-GFP载体，回收载体骨架。然后将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒Super1300-GFP-ClCHI1。
二、转基因植株的获得
1、将重组质粒Super1300-GFP-ClCHI1导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、按实施例2的西瓜遗传转化步骤，在多个株系的感病西瓜品种YX中过表达ClCHI1，重复自交并收获多个株系的T3代转基因过表达种子。将来自两个不同株系的T3代ClCHI1基因过表达的转基因种子播种，获得ClCHI1基因过表达的两个纯合株系OE1和OE2，用于后续抗病鉴定试验。
3、采用荧光实时定量PCR(方法同实施例1的“三、ClCHI1基因的组织特异性表达”)对ClCHI1过表达转基因纯合株系OE1和OE2中ClCHI1基因的表达量进行分析(即进行分子鉴定)。
用于检测ClCHI1基因的表达量的PCR模板为过表达转基因纯合株系OE1、OE2中根系的总RNA反转录得到的cDNA。cDNA的获得方式如实施例1所述。
荧光实时定量PCR所用的引物对如下：
上游引物：5’-GGAGTCAGTGGACGACGTTT-3’；
下游引物：5’-GTCGCTGTAGCCACTGTCAA-3’。
以西瓜Actin基因作为对照。用于鉴定西瓜Actin基因的引物对为：
上游引物：5’-CCTACAACTCAATTATGAAGTGTG-3；
下游引物：5’-GAAATCCACATCTGCTGGAAGGTG-3’。
PCR程序为：94℃变性30s；94℃变性5s、60℃退火35s、40个循环。
荧光实时定量PCR所用的仪器为ABI 7500Fast(Applied Biosystem)，ClCHI1基因的相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。
从图2所示的野生型YX、ClCHI1过表达的转基因纯合株系OE1和OE2中的ClCHI1基因的相对表达量比较示意图可以看出，ClCHI1过表达的转基因纯合株系OE1和OE2中均有高表达量的ClCHI1基因，ClCHI1基因的表达量分别是野生型的4倍和5倍。
实施例4：
本实施例用来说明不同转基因株系对枯萎病的抗病反应。
1、对西瓜过表达转基因纯合株系的抗病性分析
将实施例3中获得的ClCHI1过表达的转基因纯合株系OE1、OE2，和感枯萎病受体材料YX分别催芽。以经高温灭菌后的蛭石为基质，播种后用蛭石覆盖，并盖上保温保湿的薄膜，白天育苗温度控制在24-28℃，夜间18℃度左右。参照耿丽华等报道的西瓜枯萎病人工接种鉴定方法，供试西瓜材料子叶展平时，将育苗盘内的苗轻轻取出，并用清水洗净根系。采用浸根法，将接种苗的根系浸泡于FON1枯萎病菌孢子悬浮液中15min，避免子叶沾上菌液，在此期间，摇动孢子悬浮液3-5次以防孢子沉降。而空白对照植株在灭菌水中浸根15min。接种后幼苗定植于提前水灌浇透的基质内，经高压湿热灭菌的混合基质配比(草炭：土为2:1)。接种后3d需用遮阳网进行遮阳缓苗，剔除萎蔫的苗子，7d后寄主开始发病，调查发病情况。人工接种鉴定期间要求白天温度控制在28-30℃，晚上温度不低于21℃。
西瓜枯萎病苗期病情鉴定参照Martyn等的分级标准。0级：无症状；1级：中午子叶边缘轻度萎蔫；2级：2片子叶或真叶萎蔫，且不能恢复；3级：子叶和60％以上真叶萎蔫，阻碍生长；4级：整株萎蔫，心叶成活；5级：茎部萎缩变褐，整株枯萎死亡。其中，0-2级为抗病类型，3-5级为感病类型。
结果显示两个过表达转基因株系OE1、OE2的抗病性均强于对照YX，并有极显著性差异(参见图3所示)。
2、对西瓜CRISPR敲除转基因纯合株系的抗病性分析
将实施例2中获得的ClCHI1敲除转基因纯合株系CRISPR-1、CRISPR-2，和抗病受体JX2分别催芽。按照本实施例步骤1的方法接种FON1枯萎病菌孢子，结果显示CRISPR-1、CRISPR-2这两个CRISPR敲除转基因株系抗病性均极显著低于对照JX2(参见图3所示)。
根据上述实施例1-4的叙述可以发现，抗枯萎病的JX2敲除ClCHI1基因后，其对枯萎病的抗性显著下降；而将西瓜ClCHI1基因转入感枯萎病的YX中之后，其对枯萎病的抗性显著提高。这说明，西瓜ClCHI1基因与枯萎病抗性密切相关，表达量越高，对枯萎病的抗性越强，并且由于枯萎病菌的主要侵染部位是根，根中ClCHI1基因的表达量显著高于其他部位的表达量。
本发明应用的展望
随着分子生物学的不断发展，利用生物技术手段，培育抗枯萎病西瓜品种正成为可能。当前西瓜的基因克隆工作虽然已经取得了一定的成果，但西瓜的基因克隆工作远远落后于水稻、玉米、小麦等粮食作物，尤其是对西瓜抗枯萎病的研究特别是在分子水平上的研究还不是很多。CRISPR作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定，CRISPR基因敲除可以在植株的不同部位成功敲除内源基因，为研究不同生长时期的基因功能提供了切实可行的手段。本发明在前期遗传定位和图位克隆的基础上，克隆了西瓜ClCHI1基因，验证了CRISPR技术在西瓜上的敲除效率，探究了ClCHI1基因的生物学功能，发明人目前的工作主要是寻找西瓜几丁质酶的下游蛋白，从分子水平上研究枯萎病接种条件下基因的表达与调控，完善胁抗病信号的传递与基因表达调控网络，更深入的研究植物对病原菌侵染的响应机制，为有效提高植物抗病性奠定良好的分子基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 北京市农林科学院
<120> 西瓜几丁质酶及其编码基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> 西瓜(Citrullus lanatus)
<400> 1
Met Ala Ser His Lys Ile Thr Thr Thr Leu Ser Ile Ile Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ser Ile Phe Arg Ser Ser Asp Ala Ala Gly Ile Ala Ile Tyr Trp
20 25 30
Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly Ser Leu Ala Ser Thr Cys Ala Thr Gly
35 40 45
Asn Tyr Lys Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Ser Phe Gly Asn Gly
50 55 60
Gln Thr Pro Val Leu Asn Leu Ala Gly His Cys Asn Pro Asp Asn Asn
65 70 75 80
Gly Cys Ala Phe Leu Ser Asp Glu Ile Asn Ser Cys Lys Ser Leu Gly
85 90 95
Ile Lys Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Ser Leu
100 105 110
Ser Ser Ala Glu Asp Ala Arg Asp Val Ala Asn Phe Leu Trp Asn Asn
115 120 125
Phe Leu Gly Gly Gln Ser Ser Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu
130 135 140
Asp Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Ser Gly Gln Trp Trp Asp
145 150 155 160
Glu Leu Ala Arg Gln Leu Lys Gly Phe Gly Gln Val Leu Leu Ser Ala
165 170 175
Ala Pro Gln Cys Pro Ile Pro Asp Ala His Leu Asp Ala Ala Ile Lys
180 185 190
Thr Gly Leu Phe Asp Phe Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro Pro
195 200 205
Cys Met Phe Ala Asp Asn Ala Asp Asn Leu Leu Asn Ser Trp Ser Gln
210 215 220
Trp Thr Thr Phe Pro Ala Ala Ser Leu Phe Met Gly Leu Pro Ala Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Ile Pro Ala Asp Val Leu Ile
245 250 255
Ser Gln Val Leu Pro Thr Ile Lys Thr Ser Ser Asn Tyr Gly Gly Val
260 265 270
Met Leu Trp Ser Lys Ala Phe Asp Ser Gly Tyr Ser Asp Ala Ile Lys
275 280 285
Gly Ser Ile
290
<210> 2
<211> 876
<212> DNA
<213> 西瓜(Citrullus lanatus)
<400> 2
atggcttccc acaaaataac tacaactctt tctatcatct ttctcctctc ctccatattt 60
agatcttcgg atgcggccgg aatcgccatc tactggggcc aaaacggcaa cgaaggctct 120
cttgcctcca cctgtgccac cggaaactac aagttcgtca acatagcatt tctctcctcc 180
ttcggcaatg gtcaaacccc ggtcctcaac cttgccggtc actgcaaccc tgacaacaac 240
ggttgcgctt ttttgagcga cgaaataaat tcttgcaaaa gtctaggcat caaagtcctc 300
ctctctatcg gcggcggcgc agggagctat tcactctcct ccgccgaaga tgcaagagac 360
gtcgcaaact tcctttggaa caacttcctc ggcgggcagt cgagttcgag gccactcggc 420
gacgccgttt tggacggcat tgatttcgat atcgaatctg gctcagggca gtggtgggac 480
gaactagctc ggcagctgaa gggcttcggt caagtccttc tctccgccgc gccgcagtgt 540
ccaatccccg acgcacacct agacgcggcc attaaaacgg gtttgtttga tttcgtttgg 600
gttcaattct acaacaaccc gccatgcatg tttgcagata acgccgacaa tctcctgaat 660
tcttggagtc agtggacgac gtttccggct gccagtctct tcatggggct gccggcggcc 720
cctgaggccg cgccgagcgg cggctttatt ccggcggatg tgcttatttc tcaagttctt 780
ccgaccatta aaacttcttc caactatgga ggagttatgt tatggagcaa ggcgtttgac 840
agtggctaca gcgacgccat taaaggcagc atctga 876

Claims (9)

1.西瓜几丁质酶蛋白质，为如下任意一种：
1)序列表中序列1所示的蛋白质；
2)在1)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
3)在1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加得到的具有西瓜几丁质酶活性的蛋白质；
4)与1)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有西瓜几丁质酶活性的蛋白质。
2.西瓜几丁质酶的编码核酸序列，为如下任意一种：
1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子，也即西瓜几丁质酶基因ClCHI1；
2)与1)具有90％以上同一性且编码西瓜几丁质酶的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)任意一种限定的核苷酸序列杂交且编码西瓜几丁质酶的DNA分子。
3.权利要求1所述的西瓜几丁质酶蛋白质或权利要求2所述的西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜枯萎病抗性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括将西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达的操作。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述将西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达的操作包括构建包括西瓜几丁质酶的编码核酸序列的重组载体，并将所述重组载体转化西瓜植株的操作。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组载体为Super1300-GFP-ClCHI1重组质粒。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将所述重组载体转化西瓜植株的操作包括将所述重组载体导入农杆菌菌株GV3101，再利用导入了重组载体的农杆菌菌株GV3101将所述西瓜几丁质酶的编码核酸序列导入西瓜植株，进而使得所述西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达。
8.一种西瓜抗枯萎病株系的获得方法，其特征在于，所述方法包括将西瓜几丁质酶编码核酸序列在西瓜植株中进行过表达，然后筛选在西瓜植株中稳定过表达西瓜几丁质酶的株系，将所述稳定过表达西瓜几丁质酶的株系连续自交，从而获得稳定的抗枯萎病的西瓜株系。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述稳定过表达西瓜几丁质酶的株系连续自交至少三代，从而获得稳定的抗枯萎病的西瓜株系。
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