CN109762833B - 一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶核酸序列及其应用，所述的易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因编码一个苯丙氨酸解氨酶，抗禾谷孢囊线虫性能高，对小麦抗禾谷孢囊线虫育种具有重要参考和应用价值。

Description

一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及苯丙氨酸解氨酶领域，具体的涉及一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶核酸序列及其应用。

背景技术

PAL(Phenylalanine Ammonia-Lyase，苯丙氨酸解氨酶)是苯丙烷代谢途径中的第一个酶，也是关键酶，它催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。反式肉桂酸再经下游不同代谢分支，分别转化为花青素、木质素、黄酮类物质、植物抗毒素等次生代谢产物，其中一些物质被报道在植物抗病中起作用。

植物中的PALs是由多基因家族编码的同源异构型蛋白，它们具有各自的表达特征且功能也不完全相同。1961年，Conn和Koukol首次在大麦幼苗中发现并分离纯化出了PAL，此后对PAL的研究逐渐展开，随着分离纯化方法技术的不断完善提高，已经成功的从其他植物中分离纯化出了PAL蛋白，如小麦，大豆，杨树等。

PAL的表达和生物活性会随着生物发育变化、外界环境刺激发生改变。盐胁迫会激活百脉根PAL基因的表达，并导致酚类物质的积累。在烟草中，在NaCl、甘露醇、低温等处理条件下，PAL表达显著上调。低温处理黄瓜幼苗，PAL酶活性提高，促进苯丙烷类化合物的合成和细胞内的抗氧化酶对低温引起的过氧化物的清除。此外，PAL在植物免疫反应中也起着重要的作用。番茄在受到土豆孢囊线虫侵染后，番茄抗性品种中PAL基因表达显著上调，而感病品种中无明显变化。小麦在感染赤霉菌后，PAL基因表达与PAL酶大幅度增加。辣椒叶片在受到Xcv(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)感染时，CaPAL1被诱导。 CaPAL1沉默的辣椒植株，在受到致命性或者非致命性的Xcv侵染时，沉默植物表现为易感病型。而在拟南芥中过表达CaPAL1基因，过表达植株表现出对Pseudomonas syringae pv. tomato和Hyaloperonospora arabidopsidis的抗性。大豆GmPAL2.1基因受大豆疫霉菌诱导显著上调，转GmPAL2.1基因的大豆植株抗Phytophthora sojae 的抗性显著提高。PAL酶活性在转基因大豆植株中显著提高，在GmPAL2.1沉默植株中活性较低，同时检测发现在过表达GmPAL2.1大豆植株中，黄豆苷元(daidzein)，木黄酮(genistein)和SA (salicylic acid)含量显著增加，而这些物质的增加与GmPAL2.1基因在参与大豆调控对 Phytophthorasojae的抗性中起积极的作用。虽然PAL的生物学功能不断被研究和报道，迄今为止，仍未报道PAL基因是否参与植物抗禾谷孢囊线虫反应。

易变山羊草(Aegilops variabilis)是小麦的近缘物种，具有抗旱、抗条锈病、抗虫等特性，与小麦进行远源杂交时可产生可育后代，是小麦遗传改良的优异资源。易变山羊草对禾谷孢囊线虫(H.avenae,cereal cyst nematode,CCN)、根结线虫(Meloidogyncnaasi)具有高的抗性。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用，进行基因沉默后，抗性鉴定发现降低PAL基因的表达会导致根部禾谷孢囊线虫数目显著增加；构建双元表达载体，将该基因在小麦中过表达，抗性鉴定结果表明PAL过表达小麦对禾谷孢囊线虫的抗性显著提高；且不影响植物营养生长的情况下，降低禾谷孢囊线虫导致的减产。

解决以上技术问题的本发明中的一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中易变山羊草苯丙氨酸解氨酶(AeVPAL)基因首次克隆，核酸序列有着独特性，序列具有苯丙氨酸裂解酶结构域，与其它易变山羊草抗虫基因不为同源或近似。

本发明中一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因的应用，为在小麦选育或抗禾谷孢囊线虫中的应用。

所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述AeVPAL全长编码序列扩增引物序列：

PAL-1：ATGGCCACTAATGGCAACGAC；PAL-2：TTAGCAGATAGGCAGGGGCTC；

AeVPAL VIGS片段扩增引物序列：

OHL087:CTAGCTAGCTAGACAACGTGGAAACCTCGGT；

OHL088:CTAGCTAGCTAGAGTAAACTGTGCCCAGCTC。

本发明中AeVPAL核酸序列全长2124bp，序列编码707个氨基酸，蛋白76.3kDa。

本发明基于近缘物种(大麦、小麦、节节麦)中PAL的编码序列设计引物，以易变山羊草1号材料的cDNA为模板，进行同源克隆，获得全长序列。设计基因沉默引物，将沉默片段连入VIGS(Virus-induced gene silencing)载体，进行基因沉默后，抗性鉴定发现降低PAL基因的表达会导致根部禾谷孢囊线虫数目显著增加；构建双元表达载体，将该基因在小麦中过表达，抗性鉴定结果表明AeVPAL过表达小麦对禾谷孢囊线虫的抗性显著提高。

本发明中易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因编码一个苯丙氨酸解氨酶，其抗禾谷孢囊线虫能力高，对小麦育种以及提高小麦抗禾谷孢囊线虫能力具有重要参考价值。

附图说明

图1 AeVPAL沉默植株根部侵染禾谷孢囊线虫染色情况及统计结果图

(其中图中：A为对照植株根部侵染的禾谷孢囊线虫情况图，B为AeVPAL沉默植株根部侵染的禾谷孢囊线虫情况图，C为AeVPAL沉默植株根部中AeVPAL的表达量显著低于对照植株图，D为AeVPAL沉默植株根部中侵染的CCN数目显著多于对照植株图)

图2 AeVPAL过表达小麦根部侵染禾谷孢囊线虫数目比较图

(其中图中：A为转基因小麦Line15、18和对照小麦基因组AeVPAL特异性引物扩增的电泳结果，B为转基因小麦Line15、18和对照小麦中AeVPAL表达量的比较图，C为转基因小麦Line15、18和对照小麦根部侵染禾谷孢囊线虫数目的统计比较图)

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：

其中，所用到的材料与试剂如下：

植物材料：易变山羊草1号(来源于中科院成都生物研究所实验室)，Fielder小麦(由山东省农科院作物所赠送)。

所用引物序列，见下表1。

表1

试剂：总RNA提取Trizol试剂盒购自TIANGEN公司；DNA Marker、pEASY-T1 cloningKit，pEASY-Blunt E1Expression Kit，QPCR mix均为全式金公司产品；KOD高保真酶、反转录kit均为TOYOBO公司产品。体外RNA合成试剂盒购于Promega公司。植物叶片直接 PCR试剂盒，为Foregene公司。酸性品红为国药产品。限制性内切酶购于NEB公司。

实施例1

易变山羊草PAL全长编码序列扩增及植物总RNA提取及反转录：

(1)将易变山羊草1号种子浸泡在水中，放置4℃冰箱2天后，再将种子均匀铺陈在持续湿润的滤纸上置于5cm直径的培养皿中，在24℃左右的室温和16h/8h的光照周期环境下发苗。

(2)剪取发种后20天的幼苗根，液氮中碾磨，按Trizol试剂方案提取总RNA。

(3)参照TOYOBO反转录试剂方法逆转录合成cDNA

易变山羊草PAL全长编码序列及沉默片段的扩增：

以反转录产物cDNA为模板，使用两对不同的引物分别扩增AeVPAL全长编码序列和AeVPAL基因沉默片段，AeVPAL全长序列的1799～1990区段被扩增用来沉默AeVPAL基因，以降低AeVPAL基因的表达水平。其中AeVPAL全长编码序列扩增引物序列：

PAL-1：ATGGCCACTAATGGCAACGAC；PAL-2：TTAGCAGATAGGCAGGGGCTC。

AeVPAL基因沉默片段扩增引物序列：

OHL087:CTAGCTAGCTAGACAACGTGGAAACCTCGGT；

OHL088:CTAGCTAGCTAGAGTAAACTGTGCCCAGCTC。

扩增反应体系如下：

PCR扩增程序条件为94℃ 2min；98℃ 10s，55-62℃ 30s，68℃ 1min/kb，38个循环；最后68℃延伸10min。

实施例2

AeVPAL VIGS载体构建及VIGS(病毒诱导的基因沉默)接种：

(1)BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ:GFP质粒置于-20℃冰箱中备用。

(BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ:GFP质粒来源于中科院遗传发育研究所。)

(2)目标片段和BSMV载体的酶切：

酶切目标片段(带有酶切位点的沉默片段):酶切位点为NheI点。

酶切BSMV-γ:GFP质粒：

操作步骤为：温度37℃，5小时酶切之后，跑胶回收产物。回收步骤为琼脂糖凝胶电泳试剂盒说明书中操作步骤。酶切为单酶切，以下相同。酶切将质粒切开，使其线性化用于后面连接。

回收步骤可如下：

产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，对照DNA Marker切下目的带，转入2mL干净的离心管中。按每100mg凝胶加入600μL胶回收Binding Buffer，与60℃水浴中放置15分钟，每2-3分钟摇动混匀一次。将融化的凝胶转入回收柱中，并将回收柱放入收集管中，室温下 10,000rpm离心1分钟。取下回收柱，倒掉收集管中的溶液，重新将回收柱放入收集管中，加入Wash solution 700μL，室温下10,000rpm离心1分钟后再重复洗涤一次。将回收柱放入另一个干净的1.5mL离心管中，加入30～50μL Elution Buffer于回收柱膜上，室温静置 2分钟，10,000rpm离心1分钟。

(3)目标片段(经NheI酶切回收后的沉默片段)和BSMV载体的连接：

将经NheI酶切回收后的沉默片段与经NheI酶切回收后的BSMV-γ:GFP载体(BSMV沉默载体)连接，反应体系如下：

操作步骤为温度16℃的金属浴中静置2～3小时后，将连接产物用做大肠杆菌转化，挑选出阳性克隆后进行质粒提取。

大肠杆菌转化步骤：将连接反应液5μL转入大肠杆菌感受态细胞200μL中，混匀，避免振荡，于冰上放置30分钟。于42℃水浴锅中使感受态细胞热休克90秒，冰浴5分钟，然后快速加入37℃预热的LB液体培养基1mL，离心管水平放置于37℃摇床上缓慢摇动45 分钟。室温下4,000rpm离心5分钟，留下约100μL上清，用无菌枪头使细胞重新悬浮，将细菌悬浮液涂于含Ampr(100μg/mL)的LB固体平板上。为了使菌液被充分吸收，将平皿放置约1分钟后盖上，倒置，37℃培养，12-16小时后能观察到菌落长出。

质粒提取：按照天根质粒提取试剂盒说明书进行提取。

(4)BSMV病毒质粒线性化酶切及回收：

BSMV-α或BSMV-γ(包含沉默片段，即AeVPAL沉默片段与BSMV-γ整合后的质粒) 8μL(500μg/mL)

Mlu I 1μL

10×buffer 3μL

ddH₂O 18μL

温度37℃，时间8小时酶切；

37℃，8小时酶切。

最后，线性化酶切后病毒载体的回收：

用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提1次，加入等体积的异丙醇，-20℃下放置1小时，4℃，12,000g离心10分钟，小心地倒掉上清，用70％的酒精洗涤沉淀1次，6,000 rpm，室温瞬时离心，放置至酒精挥发后，加入RNase free water 30-50μL溶解沉淀后，- 20℃保存。

(5)BSMV病毒总RNA的生产及接种:

使用Promega Ribomax RNA大量生产试剂盒，生产BSMV病毒(20μL体系)。

扩增温度37℃，扩增时间3h。

病毒浸染液的混合：按如下体系中各原料进行混合而成。

其中，2×GKP buffer配方如下：

50mM甘氨酸，30mM磷酸氢二钾，pH9.2，1％bentonite，1％celite。

选取生长状态基本一致的青稞两叶一心期幼苗，使用橡胶手套，将上述病毒浸染液接种于心叶的基部，每株幼苗接种8μL，接种时利用橡胶手套轻撮叶片基部，造成细微伤口以利于病毒入侵，接种结束后使用喷雾器对幼苗喷施少量无菌水以保持湿度，并用塑料薄膜将接种后的幼苗封闭3天。

病毒线性化的质粒α,β,γ-沉默片段电泳条带单一。

实施例3

易变山羊草1号PAL基因双元载体构建及对小麦的遗传转化:

(1)AeVPAL过表达载体构建:

将AeVPAL全长编码序列通过交换反应连入pLGY02载体，并转化农杆菌EA105，挑选阳性农杆菌用于后续转化。交换反应参考天根公司EasyGeno快速重组克隆试剂盒说明操作而成。pLGY02载体来源于山东省农科院作物所。

(2)遗传转化小麦:

农杆菌悬浮液的制备:在试验前一天摇菌，160r,28℃培养；小麦穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液；取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4μL乙酰丁香酮(0.1M)混匀。

侵染：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒后进行剥胚；加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基(山东省农科院作物所，MS培养基)上，23℃暗培养3天。

休息：共培养后放到休息培养基(MS培养基)上暗培养5天，25℃；

筛选1：将愈伤转移至筛选培养基1(MS培养基)上；用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周。

筛选2：将愈伤切割后转移到筛选培养基2(MS培养基)上；用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周。

再生1：愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基(MS培养基)上；

抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤(一条线)的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。封好培养皿，放到25℃培养箱中光照(16h)培养2周。

再生2：再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

(3)转化小麦植株鉴定与纯系筛选：

采用植物叶片直接PCR法对转基因小麦进行筛选和鉴定。经过单株收种和后代鉴定，共获得两个纯系，Line15、Line18转基因阳性纯系小麦。

植物叶片直接PCR法使用foregene公司的植物叶片直接PCR试剂盒。操作步骤：剪取 3-5mg叶片组织(直径5-7mm)到200μl或1.5ml离心管中。加入50μl Buffer P1,确保裂解液能够完全浸没叶片组织。盖好离心管盖,将其置于PCR仪或金属浴中,95℃裂解 10min。加入50μl Buffer P2,用微量移液器吹打或者涡旋混匀。所得裂解混合液可4℃保存(5天以内)或直接作为模板进行PCR反应。将裂解液模板、特异性引物和扩增反应混合液按说明书配制，并进行PCR扩增。将得到的PCR产物取10μl出来跑琼脂糖凝胶电泳，并拍照。

实施例4

CCN(小麦孢囊线虫)抗性鉴定：

将获得的纯系转基因小麦(Line15、Line18转基因阳性纯系小麦)与非转基因小麦(对照组)同时播种和培养，待幼苗长成2叶期，将幼苗分别移至无菌土中，1天后于根部进行定点接种300条CCN J2/每盆，接种后覆土于19℃温箱培养。接种线虫3天后，取各植株全体根部，洗净后用酸性品红染色，在光学显微镜下对染色的CCN数目进行统计及比较分析。

染色过程：

酸性品红贮液：取3.5g酸性品红溶于250ml冰醋酸，待溶解后蒸馏水定容至1L，这个取1ml加到30～50ml蒸馏水中再用。

酸性甘油液：20-30ml纯甘油中滴加2-3滴5M HCl。

在烧杯中加入50ml蒸馏水以及10ml 5.25％NaClO溶液(终浓度为1％)，将洗干净的小麦根分别放入烧杯内，NaClO溶液要完全浸没根组织，用玻璃棒轻轻搅拌根组织，5min后，取出根组织用流水轻轻冲洗1min，然后将根泡在蒸馏水内15min。

在另一个盛有30-50ml蒸馏水的烧杯中，加入1ml酸性品红贮液，微波炉中煮沸，将之前准备好的根组织分别放入已煮沸的品红溶液中，再放入微波炉后中高火煮30s，稍微冷却后，用流水轻轻漂洗根组织，放入装有酸性甘油液的烧杯中，将烧杯放入沸水中，煮30s使根褪色，煮后的根组织浸泡在甘油中待观察。

结果分析：

VIGS沉默AeVPAL基因导致根部侵染的CCN数目显著增加。

采用BSMV病毒载体(AeVPAL VIGS载体)对易变山羊草1号(Ae.variabilis No.1)植株根部的AeVPAL基因进行沉默，沉默操作步骤于第二叶基部用手套反复涂抹造成伤口，使病毒进入。

选择二叶一心期的易变山羊草1号幼苗，接种BSMV病毒两周后，选取叶片有BSMV侵染表型的植株，新长叶片出现条纹斑，以AeVEF基因(elongation factor-1)作为内参基因，利用荧光定量PCR检测易变山羊草1号AeVPAL-silenced植株(BSMV侵染表型后的植株)和对照植株(侵染了不带PAL沉默片段的病毒)根部组织AeVPAL的表达量。

荧光定量结果显示，相对于对照组植株，AeVPAL基因的表达在AeVPAL1-silenced植株根部显著降低，表达量降低了近60％。

对AeVPAL-silenced植株沉默植株根部定点接种CCN J2幼虫，接种3天后对植株根部进行酸性品红染色，并在光学显微镜下观察统计。

统计学分析显示，AeVPAL1-silenced沉默植株根部侵染的CCN数目显著多于对照植株根部的CCN数目；与对照相比，AeVPAL1-silenced沉默植株根部侵染的CCN数目增加了40％以上。以上结果说明AeVPAL基因沉默导致植株抗CCN的能力下降，AeVPAL在Ae.variabilis No.1抗CCN反应中起正向调控作用。如图1。

AeVPAL过表达转基因小麦根部侵染的CCN数目显著减少：

将AeVPAL基因转入到小麦品种Fielder，然后用特异性引物(OHL129和OHL604)对转基因后的植株进行检测和筛选。繁殖到T3代，已经筛选获得了2个AeVPAL转基因小麦纯系Line15和Line18。将Line15、Line18转基因阳性纯系小麦和对照植株(非转基因植株) 一并发苗和种植，待小麦长至2叶期，于植株根部定点接种CCN J2幼虫，接虫3天后取根酸性品红染色，显微镜拍照并统计小麦根部组织CCN线虫数目。

统计分析结果显示，转AeVPAL基因纯系小麦Line15和Line18的植株根部CCN线虫侵染数目显著低于对照组的植株。结果表明，AeVPAL转基因小麦对CCN的抗性显著高于对照小麦。如图2所示，AeVPAL转基因小麦对CCN的抗性高，取得非常好的效果，且稳定。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中科院成都生物研究所

<120> 一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2124

<212> DNA

<213> Aegilops variabilis

<400> 1

atggccacta atggcaacga cggtttgtgc gtggccaagc cgcggagtgc tgacccgctc 60

aactggggga aggcggcgga ggagctgtcg gggagccatc ttgacgccgt caagcggatg 120

gtggaggagt accgcaggcc ggtggtagtt atggagggcg ccagcttgac catcgcccag 180

gtcgcggcgg tggccgccgc cgacggggcc agggtggagc tcgacgagtc cgcccgcggc 240

cgcgtcaagg agagcagcga ttgggtcatg agcagcatgg cgaatgggac tgacagctac 300

ggcgtcacca ccggcttcgg cgccacctcc catcggagga ccaaggaggg gggcgcgctg 360

cagagggagc tcatccggtt ccttaacgcc ggtgcgttcg gcaccggcag cgacggccac 420

gtgctgcccg cggccaccac gcgtgcggcg atgctcgtcc gcgtcaacac cctgctccaa 480

gggtactctg gcatccgctt tgagatcctc gagaccatcg ccacgctgct caacgccaac 540

gtgacaccat gcctgccgct ccgaggcact atcaccgctt ccggtgatct tgtcccgctc 600

tcctacatcg ccggacttgt caccggccgc ccaaatgccg tcgctgttgc tcctgatggc 660

acaaaagtta atgctgccga ggcatttaag atcgccggta tccaacacgg cttcttcgag 720

ctacagccca aggaaggcct tgctatggtt aatggaacgg cggtgggctc cgggctcgcg 780

tccattgttc tctttgaagc gaacatcctt ggtgtccttg ctgaagtttt atcagccgta 840

ttctgcgaag tgatgaacgg caagccagag tacaccgacc acctaacaca taagttgaag 900

caccaccccg gacagatcga ggctgcggcc atcatggagc acatcctaga ggggagctcc 960

tacatgatgc ttgcgaagaa acttggtgag ctcgacccat tgatgaagcc aaagcaagac 1020

agatatgctc tccgcacgtc accgcaatgg cttggtcctc aaattgaggt catccgtgca 1080

gcgacgaagt cgatcgagcg cgagatcaac tctgtcaatg acaacccact cattgacgta 1140

tctcgtggaa aggcaatcca tggtggcaac tttcaaggca cacccattgg cgtgtccatg 1200

gacaacacga ggcttgccat tgctgcgata ggcaagctca tgtttgccca gttctcagag 1260

ctagtgaacg acttctacaa caatggcttg ccctctaacc tctctggtgg tcgcaaccca 1320

agcctggact atggcttcaa gggtgctgag atcgccatgg cgtcatattg ctcggagctt 1380

caattcttgg gcaaccctgt gaccaaccat gtccagagcg cggagcaaca caaccaagac 1440

gttaactccc ttggattaat ctcgtcccgg aagaccgctg aggccattga cattctgaag 1500

ctcatgtcct ctacattttt ggttgcgctg tgccaagcca tcgacctgcg ccaccttgag 1560

gagaatgtca agaacgccgt caagaattgt gtcacaagag tggctaggaa gaccctgatc 1620

acaaatgaca tgggtggcct ccacaatgca cgtttctgtg agaaggacct gctccaaaca 1680

atcgaccgcg aggcggtgtt tgcatacgca gacgaccctt gcagcgccaa ctatcctctc 1740

atgaagaaga tgcgcgcggt gttggttgag catgccctgg ccaacggcga ggctgagcac 1800

aacgtggaaa cctcggtgtt tgccaaggtt gccaaattcg agcaggagct ctgtgcaaca 1860

ctacctcagg aggttgaggc tgctagaggt gcagtggaga atggcaccgc tgaagaacca 1920

aaccgtatcg tagactgccg gtcataccct ctataccggt tcgtgcgcga ggagctgggc 1980

acagtttact tgaccggaga gaagactcgg tcacctggcg aggaggtgga caaggtgttc 2040

gttgccatga accagggtaa gcacatcgat gctctgctgg agtgcctcca ggagtggaac 2100

ggcgagcccc tgcctatctg ctaa 2124

<210> 2

<211> 707

<212> PRT

<213> Aegilops variabilis

<400> 2

Met Ala Thr Asn Gly Asn Asp Gly Leu Cys Val Ala Lys Pro Arg Ser

1 5 10 15

Ala Asp Pro Leu Asn Trp Gly Lys Ala Ala Glu Glu Leu Ser Gly Ser

20 25 30

His Leu Asp Ala Val Lys Arg Met Val Glu Glu Tyr Arg Arg Pro Val

35 40 45

Val Val Met Glu Gly Ala Ser Leu Thr Ile Ala Gln Val Ala Ala Val

50 55 60

Ala Ala Ala Asp Gly Ala Arg Val Glu Leu Asp Glu Ser Ala Arg Gly

65 70 75 80

Arg Val Lys Glu Ser Ser Asp Trp Val Met Ser Ser Met Ala Asn Gly

85 90 95

Thr Asp Ser Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg

100 105 110

Arg Thr Lys Glu Gly Gly Ala Leu Gln Arg Glu Leu Ile Arg Phe Leu

115 120 125

Asn Ala Gly Ala Phe Gly Thr Gly Ser Asp Gly His Val Leu Pro Ala

130 135 140

Ala Thr Thr Arg Ala Ala Met Leu Val Arg Val Asn Thr Leu Leu Gln

145 150 155 160

Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe Glu Ile Leu Glu Thr Ile Ala Thr Leu

165 170 175

Leu Asn Ala Asn Val Thr Pro Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr

180 185 190

Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Val Thr

195 200 205

Gly Arg Pro Asn Ala Val Ala Val Ala Pro Asp Gly Thr Lys Val Asn

210 215 220

Ala Ala Glu Ala Phe Lys Ile Ala Gly Ile Gln His Gly Phe Phe Glu

225 230 235 240

Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Val Asn Gly Thr Ala Val Gly

245 250 255

Ser Gly Leu Ala Ser Ile Val Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Gly Val

260 265 270

Leu Ala Glu Val Leu Ser Ala Val Phe Cys Glu Val Met Asn Gly Lys

275 280 285

Pro Glu Tyr Thr Asp His Leu Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly

290 295 300

Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile Met Glu His Ile Leu Glu Gly Ser Ser

305 310 315 320

Tyr Met Met Leu Ala Lys Lys Leu Gly Glu Leu Asp Pro Leu Met Lys

325 330 335

Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly

340 345 350

Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg Ala Ala Thr Lys Ser Ile Glu Arg Glu

355 360 365

Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Gly Lys

370 375 380

Ala Ile His Gly Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met

385 390 395 400

Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala

405 410 415

Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser

420 425 430

Asn Leu Ser Gly Gly Arg Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly

435 440 445

Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Gly

450 455 460

Asn Pro Val Thr Asn His Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp

465 470 475 480

Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ala Glu Ala Ile

485 490 495

Asp Ile Leu Lys Leu Met Ser Ser Thr Phe Leu Val Ala Leu Cys Gln

500 505 510

Ala Ile Asp Leu Arg His Leu Glu Glu Asn Val Lys Asn Ala Val Lys

515 520 525

Asn Cys Val Thr Arg Val Ala Arg Lys Thr Leu Ile Thr Asn Asp Met

530 535 540

Gly Gly Leu His Asn Ala Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Gln Thr

545 550 555 560

Ile Asp Arg Glu Ala Val Phe Ala Tyr Ala Asp Asp Pro Cys Ser Ala

565 570 575

Asn Tyr Pro Leu Met Lys Lys Met Arg Ala Val Leu Val Glu His Ala

580 585 590

Leu Ala Asn Gly Glu Ala Glu His Asn Val Glu Thr Ser Val Phe Ala

595 600 605

Lys Val Ala Lys Phe Glu Gln Glu Leu Cys Ala Thr Leu Pro Gln Glu

610 615 620

Val Glu Ala Ala Arg Gly Ala Val Glu Asn Gly Thr Ala Glu Glu Pro

625 630 635 640

Asn Arg Ile Val Asp Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Arg Phe Val Arg

645 650 655

Glu Glu Leu Gly Thr Val Tyr Leu Thr Gly Glu Lys Thr Arg Ser Pro

660 665 670

Gly Glu Glu Val Asp Lys Val Phe Val Ala Met Asn Gln Gly Lys His

675 680 685

Ile Asp Ala Leu Leu Glu Cys Leu Gln Glu Trp Asn Gly Glu Pro Leu

690 695 700

Pro Ile Cys

705

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> PAL-1

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> PAL-2

<400> 4

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> OHL087

<400> 5

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> OHL088

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> OHL135

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> OHL136

<400> 8

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> OHL099

<400> 9

tctagaggat ccccgatggc cactaatggc aacgac 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> OHL100

<400> 10

ttcgagctct ctagattagc agataggcag gggctc 36

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> OHL129

<400> 11

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> OHL604

<400> 12

actttatgct tccggctcgt atg 23

Claims (2)

1.一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述苯丙氨酸解氨酶全长编码序列扩增引物序列：

PAL-1：ATGGCCACTAATGGCAACGAC；PAL-2：TTAGCAGATAGGCAGGGGCTC；

PAL VIGS片段扩增引物序列：

OHL087:CTAGCTAGCTAGACAACGTGGAAACCTCGGT；

OHL088:CTAGCTAGCTAGAGTAAACTGTGCCCAGCTC；

所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因的应用，其特征在于：所述基因在选育抗禾谷孢囊线虫小麦中的应用。

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