CN110850100B - 一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测血清抗Annexin A2‑IgG抗体的试剂盒，本发明的检测试剂盒采用一种原发性肾病综合征相关生物标志物的抗Annexin A2‑IgG抗体所对应的靶抗原Annexin A2，以人抗标签肽的IgG作为定量检测的标准品，并利用生物素标记检测抗体和酶标标记链霉亲和素放大***，从而提高了血清抗Annexin A2‑IgG抗体检测的准确性和敏感性，为以抗Annexin A2‑IgG抗体来进行原发性肾病综合症诊断和治疗提供了一种较好的检测方法。

Description

一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒。是一种快速简便高灵敏地定性或定量分析人血清中抗Annexin A2-IgG水平的检测试剂盒。
技术背景
近年来儿童肾脏疾病种类越来越多，其中以原发性肾病综合症发病率最高，严重危害了儿童身心健康。原发性肾病综合症由多种原因引起肾脏功能损伤同时出现“三高一低”的症状，即大量蛋白尿、高度浮肿、高血脂症和低蛋白血症一组综合征。原发性肾病综合征的病因及发病机制目前尚不明确，主要有以下因素：一、滤过屏障损伤，免疫球蛋白和(或) 补体成分肾内沉积，局部免疾病理损伤滤过膜正屏障尿中丢失大-中分子量的多种蛋白，形成低选择性蛋白尿。二、静电屏障破坏，使大量带阴离子电荷的中分子血浆蛋白滤出，形成高选择性蛋白尿。肾小球滤过屏障包括电荷屏障和机械屏障两大部分，电荷屏障位于毛细血管内皮细胞内侧，是由一组带有负电荷的生物大分子组成，可防止带负电荷的分子如白蛋白被滤过；机械屏障由内向外依次为毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜、上皮细胞足突间的裂孔膜，这三层结构及其上的裂孔是机械屏障的结构基础，以防止中大分子被滤过。其中肾小球足细胞滤过孔径为25-40nm，是滤过膜中最后一道屏障，又是滤过膜中最小的滤过孔。足细胞是合成富含带阴电荷组成屏障的硫酸类肝素的主要细胞来源细胞，并将硫酸类肝素分布于基底膜(GBM)及其两侧。足细胞本身也覆盖着带阴电荷的唾液酸糖蛋白，共同维持着滤过膜的电荷屏障功能。但足细胞特殊的解剖位置，使得其体内研究较为困难；又由于正常成年机体的肾脏足细胞是一种终末分化细胞，体外培养的原代细胞不能增殖。所以过去的足细胞体外研究工作开展得很少。直到90年代中期用转基因的方法建立了条件培养的永生代小鼠足细胞系，才使得对足细胞的结构共讷讷的认识和其在肾小球疾病中的作用及机理的研究取得了突破性的进展。
发明内容
本申请的目的是提供一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒，主要包括抗原蛋白Annexin A2、固相载体、阳性质控品、标准品、酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的抗人IgG、底物显色剂、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、洗涤液、终止液，信号检测方法包括光显色法、化学发光法。
所述抗原蛋白Annexin A2包含cDNA序列GenBank(CM-000677.2)SEQ ID:1如下：(chromosome15,101bp from base 60347151-60347252: -TGATTTTATTTTATTTTATTTCATTTAAATTTAACTTAAATAGCGACACTTGGATAGGGGCA ACCATACTGTACAGCTCAGTCCCAGAGCTTTCTTCCTACA-)。
所述抗原蛋白Annexin A2固定于固相载体上，优选的固相载体包括：硝酸纤维素膜、酶标微孔板。
所述标准品和阳性质控品，标准品和阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗Annexin A2抗体作为阳性质控品和标准品。
所述检测试剂盒还包括底物显色剂、抗原稀释液、血清/抗体稀释液、洗涤液和终止液。所述显色剂为TMB、吖啶酯、AMPPD、4-MUP；抗原稀释液为1x PBS PH7.4、NaCL163mM、1％TritonX-100；所述样品稀释缓冲液为0.01M PBS PH7.4+10％新生牛血清；所述抗人IgG稀释液为含有1M D-glucose、2％甘油的0.01M PBSPH7.4；所述抗体稀释液为取1M D-glucose (19.82g)、2％甘油(2ml)加入含0.35％Tween2的0.01M PBS至100ml；所述洗涤液为：1x PBS PH7.4、NaCL163mM、1％TritonX-100、甘油10％；所述终止液为：2M硫酸。
所述的抗原蛋白Annexin A2上带有标签肽，所述的标签肽包括：GST标签、c-Myc标签、His标签、Flag标签或生物素标签。
根据本发明，抗原Annexin A2对应的血清自身抗体的相对滴度定量采用统一的标签肽和抗标签肽抗体之间的特异性免疫反应及标准曲线的回归来进行计算。
根据本发明，所述抗原蛋白Annexin A2可表达于大肠杆菌、哺乳动物细胞中。
根据本发明，所述抗原蛋白Annexin A2经Ni柱亲和层析、分子筛、离子交换柱、疏水柱纯化。
根据本发明，所用的信号检测方法包括光显色法、化学发光法。
根据本发明，所述血清为哺乳动物(人类)血清。
本发明采用基因重组方法成功表达并纯化出重组蛋白Annexin A2，以此作为试剂盒中抗原蛋白，采用抗原包被固相载体的方法，研发出一套适合于检测原发性肾病综合征患者血清抗Annexin A2-IgG的试剂盒。是一种定性或定量分析人血清中抗Annexin A2-IgG的检测试剂盒。
所述的抗原蛋白Annexin A2固定方法为直接包被法：1.抗原通过非共价键或物理吸附方式结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；2.磁珠带有能与蛋白质结合的功能基团，抗原通过化学偶联方式结合在磁珠上。
本发明通过前期大量临床和分子机制研究，发现肾病综合征患者血清IgG水平较高，并证实足细胞上的膜结合蛋白A2是原发性肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。因此检测血清中是否有抗Annexin A2-IgG及对其定量有利于肾病综合征早期诊断、指导临床治疗及预后判断。具体实施如下足细胞MPC5的总蛋白同时跑两块SDS-PAGE胶，一块进行考马斯亮蓝染色(A)，一块SDS-PAGE凝胶电泳后，转到硝酸纤维素膜上，加原发性肾病综合征病人血清中纯化出来的IgG抗体(经小鼠足细胞免疫荧光检测含有针对足细胞的IgG型自身抗体)进行WB检测。取WB阳性条带对应的考马斯亮蓝染色条带质谱分析，鉴定为Annexin A2蛋白(C)，商品化的重组Annexin A2蛋白能特异与含有Annexin A2抗体的原发性肾病综合征病人的血清反应，商品化的Annexin A2抗体也能特异与足细胞MPC5的总蛋白SDS-PAGE凝胶电泳后分离到的Annexin A2蛋白条带反应(D)。B：(1：肾病综合征病人血清中纯化出来的IgG抗体1000倍稀释；2：肾病综合征病人血清中纯化出来的IgG抗体1： 2000稀释；3：健康人血清中纯化出来的IgG抗体1：1000稀释；4：健康人血清中纯化出来的IgG抗体1：2000稀释；5-6：β-actin。)D：(1：足细胞的总蛋白SDS-PAGE电泳后分离到的Annexin A2蛋白条带；2：重组的Annexin A2蛋白；Positive serum：含有Annexin A2抗体的原发性肾病综合征病人的血清；Negative serum：健康人的血清。)。E：AnnexinA2蛋白的三维结构图。实验结果见图1A、B、C、D、E。
具体创新点可归纳如下：
(1)本发明采用重组人抗His标签的免疫球蛋白作为标准品，可特异性的识别带有His标签的抗原，从而提高了试剂盒检测的准确性和特异性。
(2)反应条件的优化本发明采用正交试验设计,根据抗原AnnexinA2包被浓度(30μg、 50μg、120μg、20μg四个包被浓度)、各反应时间(30min、60min)和温度(25℃、37℃)、酶标二抗最佳稀释度(1：50、1:100、1:200、1:500、1:1000五个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清。选择阳性血清的最高OD值 (P)和阴性血清的最低OD值(N)的比值(P/N)。重复测定的平均P/N值，经统计处理确定最佳包被条件及二抗的最佳稀释度进行正交优化条件，显著提高了标准阳性血清的阳性检出率。正交设计我们得到了抗原最佳包被浓度为120μg、最佳反应时间30min及最佳酶标二抗稀释度为1：200。
(3)本发明试剂盒涉及到定性和定量分析人血清中抗Annexin A2-IgG抗体其中固相膜免疫定性法操作简便，NC膜吸附能力极强近100％，微量抗原能够完全吸附，试剂用量也较少比传统ELISA节约近10倍；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性，有利于健康人群体检筛选。而生物素亲和素***酶联免疫吸附定量法将抗原抗体特异性结合反应与生物素亲和素放大***结合大大提高了检测灵敏度，为原发性肾病综合征诊断、治疗、缩短住院时间及减少疾病复发提供重要依据。
(4)目前国内外关于肾脏疾病患者有关Annexin A2、抗Annexin A2-IgG仅限于分子机制研究，并没有定量检测其在患者血清中水平，而本项目检测原发性肾病综合征患者血清抗Annexin A2-IgG的试剂盒填补了国内外空白。
附图说明
图1是足细胞上的膜结合蛋白A2是原发性肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。
图2是pET-28a(+)-Annexin A2重组质粒图谱。
图3是人抗Annexin A2-IgG抗体的提取及定量的流程图。
图4是固相膜免疫检测抗Annexin A2-IgG示意图。
图5是有两个洗脱峰，第一峰为生物素标记抗体峰，第二峰为生物素多聚体峰。
图6是试剂盒检测抗Annexin A2-IgG标准曲线绘制。
图7是原发性肾病综合征病人抗Annexin A2-IgG阳性率。
图8是各类肾病病人中抗Annexin A2-IgG的检出率，其中PNS：原发性肾病综合征，HSPN：紫癜性肾炎，SH：单纯性血尿，IgAN：IgA肾病，LN：狼疮性肾炎，NC：健康儿童。
图9是原发性肾病综合征病人抗Annexin A2-IgG阳性与激素耐药的关系。其中SRNS：激素耐药肾病综合征，SSNS：激素敏感肾病综合征。
图10是抗Annexin A2-IgG阳性的原发性肾病综合征病人病人住院时间和尿蛋白含量。
图11是使用免疫抑制剂进行治疗以后原发性肾病综合征患者体内的抗AnnexinA2-IgG、24小时尿蛋白水平、血清白蛋白水平变化；其中A：原发性肾病综合征患者24小时尿蛋白水平和血清白蛋白的升变化；B：免疫印迹法检测原发性肾病综合征患者血清中抗Annexin A2-IgG的水平。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于阐述本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例说明：实验原理是采用抗原吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，再加入标记二抗进行抗原抗体反应后，最后利用光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析人血清中抗Annexin A2-IgG抗体的目的。
1.1重组抗原蛋白Annexin A2表达及纯化：从GenBank(CM000677.2)中获得人源Annexin A2基因的cDNA序列并设计引物，用PCR的方法扩增编码Annexin A2基因部分序列并和载体连接。然后克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达Annexin A2蛋白。本发明表达的抗原蛋白上含有标签肽，可以选择GST标签、Flag标签、c-Myc标签、His标签等。
1.2固相载体：本发明所选固相载体包括：硝酸纤维素膜、聚苯乙烯微孔板。
1.3抗原蛋白固定方法：本发明抗原包被固相载体方法有直接包被法：一、抗原通过非共价键或物理吸附方式结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；二、磁珠带有能与蛋白质结合的功能基团，抗原通过化学偶联方式结合在磁珠上。
1.4阳性质控品和标准品：本发明所选阳性质控品和标准品为重组人抗标签肽IgG或从病人血清中提取并进行定量的IgG。
1.5标记抗体和底物显色剂：本发明所选的标记抗体可以是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记抗人IgG、吖啶酯标记抗人IgG、生物素标记抗人IgG；显色剂可以为四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)、4-MUP、AMPPD。
1.6信号检测：利用酶标仪、化学发光分析仪等方法来检测光信号，通过绘制标准曲线来定量分析人血清中抗Annexin A2–IgG。
2.本发明所用常规试剂及溶液的成分和配制。
2.1.聚苯乙烯微孔板、硝酸纤维素膜(NC)、磁珠(市场购买)。
2.2.PBS PH7.4:KCL 2.7mM、NaCL137mM、Na2HPO4 8.1mM、KH2PO4 1.5mM；32.20X洗涤液：KCL 54mM、NaCL2.74mM、Na2HPO4 162mM、KH2PO4 30mM,0.22μm滤膜负压过滤。
2.3.封闭液5％BSA溶液：称取5g牛血清白蛋白溶解于100mL的0.01M PBS中。
2.4.抗原稀释液：1x PBS PH7.4、NaCL163mM、1％TritonX-100。
2.5.血清/抗体稀释液：取1M D-glucose(19.82g)、2％甘油(2ml)加入含0.35％Tween2 的0.01M PBS至100ml，0.22μm滤膜负压过滤。
2.6.洗涤液：1x PBS PH7.4、NaCL163mM、1％TritonX-100、甘油10％。
2.7.TMB显色剂：50mM咪唑缓冲液PH5、7.5mM PEG3350、2.94过氧化氢尿素、 1.6mMTMB。
2.8.终止液：2M硫酸。
2.9.SDS-PAGE(10％)配制。
a.5％浓缩胶配制：
Figure BDA0002287777870000051
Figure BDA0002287777870000061
b.10％分离胶配制：
Figure BDA0002287777870000062
实施例1、原核表达并纯化Annexin A2抗原从GenBank(CM-000677.2)中获得编码人源Annexin A2基因的cDNA部分序列 (chromosome15,101bpfrombase60347151-60347252:-TGATTTTATTTTATTTTATTTCATTTAAA TTTAACTTAAATAGCGACACTTGGATAGGGGCAACCATACTGTACAGCTCAGTCCCAGA GCTTTCTTCCTACA-)并以此设计引物,引物序列如下：上游 5′-GAATTCTGATTTTATTTTATTTTA-3′(下划线含有EcoRI酶切位点)，下游 5′-GGATCCAGTAGGAAGAAAGCT-3′(下划线含有BamHI酶切位点)，与pMD19-T载体连接，转化JM109感受态细胞，挑取单克隆菌落，经菌落PCR和双酶切初步鉴定后，送公司测序。对连接成功Annexin A2-pMD19-T进行EcoRI/BamHI双酶切，回收目的片段，与经相同双酶切pET28a连接，将pET28a-Annexin A2质粒转化BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，经菌落PCR和双酶切初步鉴定后，送公司测序成功后，进行大量扩菌收集菌体，破菌后留取上清及收集包涵体，并摸索蛋白表达最佳的诱导时间和诱导剂浓度，鉴定蛋白表达部位。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析、分子筛、疏水柱、离子亲和层析法进行纯化、最后利用 SDS-PAGE鉴定重组蛋白Annexin A2分子量并进行定量，重组质粒pET28a-Annexin A2见图2。
实施例2、抗抗Annexin A2-IgG抗体标准品的制备
2.1抗Annexin A2-IgG抗体的提取通过我们初步实验，筛选出一个含量较高的抗Annexin A2-IgG抗体血清，然后按1:200稀释，取100ul加到预先用Annexin A2包被的反应孔中，共6孔，同时再做2孔只加100ul反应缓冲液以排除非特异性吸附，37℃振荡反应2小时，洗涤液洗3次，取其中的3孔加入100ul的6mol尿素，37℃振荡反应20min，这样特异性IgG解离到尿素溶液中，分别提取尿素溶液并检测溶于其中IgG的含量，然后这3孔继续洗2次，与剩下的5孔进一步进行抗Annexin A2-IgG抗体的检测，来分析是否含有未被解离的IgG抗体及其所占的比例，见图3。
2.2抗Annexin A2-IgG抗体标准品的定量检测将上面提取3孔含抗Annexin A2-IgG抗体的尿素溶液，分别用分子量50KD超滤管进行超滤，最终将收集超滤液转换到50mmol/LTris-HCl(pH7.8)缓冲液中，最终体积120ul。根据BCA定量检测蛋白试剂盒方法，通过己知浓度的人IgG标准品绘制标准曲线来测定该缓冲液中抗Annexin A2-IgG抗体的含量，最后用反应缓冲液将定量的抗Annexin A2-IgG抗体稀释到一系列浓度梯度作为标准品，见图3。
实施例3、用于检测抗Annexin A2-IgG的固相膜免疫试剂盒的制备
3.1、用于检测抗Annexin A2-IgG的固相膜免疫试剂盒的组成：
1、包被Annexin A2抗原的硝酸纤维素膜、
2、阳性质控品(标准品)人抗His标签免疫球蛋白G(购自Tribioscience公司)3、阴性质控品(抗体稀释液)
4、辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白G
5、抗原稀释液
6、洗涤液
7、TMB显色剂
8、终止液。
3.2、抗原包被硝酸纤维素膜制备及血清样本的检测步骤如下：
3.2.1包被、封闭：将用0.01M PBS PH7.4稀释的抗原液5μl直接点于硝酸纤维素膜上置37℃温箱中干燥30min，将NC膜置于板槽中，加入100μl 5％BSA于37℃温盒中封闭10min，弃去封闭液后洗涤液洗2次；
3.2.2抗原孵育：向反应槽内加入10μl用稀释液稀释的抗体标准品或待检标本，同时做阴性对照、阳性对照，充分混匀置37℃湿盒中反应30min，每个样品设置3个平行孔；
3.2.3二抗孵育：弃去槽内液体，洗涤液洗3次×1min，加入20μl抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，充分混匀，室温反应30min；
3.2.4显色：弃去槽内液体，洗涤液洗3次×1min，加显色A/B各500μl，室温反应10min然后加入500μl 2M H2SO4终止液，混匀，1min后弃去槽内液体洗涤3次，取出测试条用吹风机吹干膜条，自然干燥后进行肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性，或将NC 膜置于“Canon 9000f markii”显影仪扫描，显影仪自带的软件***以参考标准品浓度作为纵坐标、阅读仪读数值即灰度值作为横坐标，采用双对数进行Logistic拟合曲线的方法绘制标准曲线来定量分析患者血清中抗Annexin A2-IgG水平，见图4。
实施例4、用于检测抗Annexin A2-IgG的生物素亲和素***酶联免疫试剂盒的制备
4.1、用于检测抗Annexin A2-IgG的生物素亲和素酶联免疫试剂盒的组成：
1、包被Annexin A2抗原的酶标板
2、阳性质控品(标准品)人抗His标签免疫球蛋白G(购自Tribioscience公司)3、阴性质控品(抗原稀释液)
4、生物素标记的羊抗人免疫球蛋白G(NHS-PEG4-Biotin购自Thermo公司)
5、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA购自Sigma-Aldrich公司)
6、抗原稀释液、
7、洗涤液
8、TMB显色剂
9、终止液
10、封口膜。
4.2生物素标记抗体的制备和纯化步骤如下：
4.2.1抗体超滤处理：标记前需要应用截留分子量为50kDa的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理,以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、甘氨酸、Tris、BSA或其他有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。
具体步骤
1、于超滤柱中加入200μl标记反应溶液，加入500ug羊抗人IgG单克隆抗体,混匀。4℃， 6000rpm，离心2min，弃掉滤液；
2、于超滤柱中加入100μl标记反应溶液，混匀。4℃，Max 14000×g，2min；
3、重复步骤2，6-7次；
4、混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中， 4℃,1000×g，2min，收集滤液，取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min；
5、倒置超滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用，用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml，
6、计算标记抗体所需生物素的量按照抗体浓度2mg/ml来计算：含有2mg/mL IgG(150,000MW)的1mL溶液需要26μl 10mM NHS-PEG4-Biotin；向超滤后的抗体溶液中加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h进行生物素标记抗体反应。
4.2.2凝胶过滤层析纯化收集生物素标记抗体
①将1×15cm层析柱安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将凝胶填料边搅匀边沿着层析柱一圈均匀缓慢的装入，让填料在柱内自然沉降。同时将层析柱下口打开，让去离子水缓慢流出。装好的凝胶必须均匀，不能有明显气泡或裂隙。层析柱装好后，用层析平衡液平衡至少2h后才能对样品进行分离纯化。②连接层析柱、恒流泵和蛋白检测仪，蛋白检测仪在层析开始前开机稳定半小时，灵敏度0.1AUFS。③加样品前，先把层析柱内凝胶多余的平衡液放出，直至层析柱内液面与凝胶表面齐平(或仅留极薄的液体层)。然后从柱的上端缓慢加生物素标记抗体反应液250ul，(注意不要将凝胶冲散浮起)加好样品后，打开层析柱下口缓慢放出液体至柱内液面与凝胶面齐平，再用少许去离子水冲洗盛生物素标记抗体反应液的EP 管2次，待样品全部加入层析柱后，就可以进行洗脱，流速控制在0.5ml/min左右。④收集第一个洗脱峰下的蛋白，混匀，以1:50比例加入标记抗体保护液，记录洗脱峰图，见图5。
根据表1-3计算标记抗体时所需生物素的用量：
表1
抗体浓度 NHS-PEG<sub>4</sub>-Biotin：抗体摩尔比
10-12mg/ml时 12
4-7mg/ml时 16
1-3mg/ml时 20
0.5mg/ml时 50
不同抗体浓度时，NHS-PEG4-Biotin：抗体的摩尔比率(NHS-PEG4-Biotin分子量：589)。
表2：10mmol/L NHS-PEG4-Biotin配制
NHS-PEG<sub>4</sub>-Biotin(mg) PBS(μl) NHS-PEG<sub>4</sub>-Biotin(mg/μl)
0.56 95.1 0.00589
表3：标记0.5mg羊抗人IgG抗体需要的10mmol/L NHS-PEG4-Biotin体积计算
Figure BDA0002287777870000091
4.3、酶标板制备及血清样本的ELISA检测步骤如下：
4.3.1包被封闭：用抗原稀释液将抗原Annexin A2稀释成120ug/ml，每孔100μl加入到96孔板中，包上封口膜4℃过夜。第二天从4℃冰箱中取出已包被抗原的96孔板，倾去包被液，拍干；加入含有2％BSA的封闭液，每孔150μl，室温封闭2h，倾去封闭液，拍干；
4.3.2分别向包被抗原板条加入100ul标准品和用稀释液1:200稀释的检测血清，37℃振荡反应30min，同时做阴阳性对照；
4.3.3洗涂液冲洗3次(每次静置30s)，拍干后毎孔加入100ul生物素化羊抗人IgG抗体，37℃振荡反应30min；
4.3.4洗涂液冲洗3次(毎次静置30s)，拍干后毎孔加入HRP-SA 37℃振荡反应30min；
4.3.5洗涂液冲洗3次(毎次静置30s)，拍干后毎孔加入TMB显色剂,室温震荡反应5分钟后,加入终止液，通过酶标仪检测光信号并绘制标准曲线来定量分析待检血清中抗Annexin A2-IgG抗体含量。
实施例5、绘制标准曲线重组抗原蛋白Annexin A2以120μg作为包被浓度，按照3.125ng、6.25ng、12.5ng、25ng、50ng五个浓度参考标准品的顺序加入，重复两次，同时做阴阳性对照，由“Canon 9000f markii”显影仪扫描，显影仪自带的软件***以参考标准品浓度作为纵坐标、阅读仪读数值即灰度值作为横坐标，采用双对数进行Logistic拟合曲线的方法绘制标准曲线，见图6。
实施例6、灵敏度将零浓度参考标准品当做20份标本，计算20份零参考标准品的灰度值的均值和标准差，以其mean+3s代入标准曲线方程，计算得出的浓度为本方法检测抗Annexin A2-IgG抗体的最低检测限为0.56ng/ml。
实施例7
医学参考范围建立根据检测259例健康体检者血清中抗Annexin A2-IgG抗体浓度，制作频数分布表，见表4，并计算正常人的抗Annexin A2-IgG抗体95％医学参考范围P95及阴性预测值(negative predictive value，NPV)并确定检测血清标本抗Annexin A2-IgG抗体浓度的阳性确认值(Cut Off值)，以便建立该地区抗Annexin A2-IgG抗体95％医学参考范围。259 例健康体检血清抗Annexin A2-IgG浓度分布为偏态分布,计算正常人血清中抗Annexin A2-IgG 浓度值的95％医学参考范围P95＝L95+i95/f95(n×95％-∑fL)＝1.35ng/ml。试剂盒检测正常人血清抗AnnexinA2-IgG的95％医学参考范围为＜1.40ng/ml，阴性预测值为96.1％。结合上述的统计分组情况，该方法检测血清标本抗Annexin A2-IgG浓度的阳性确认值(Cut Off值)为1.40 ng/ml，即当该方法检测抗Annexin A2-IgG浓度大于1.40ng/ml时，判定为阳性检测结果。检测259例健康体检者血清中抗Annexin A2-IgG抗体浓度结果见表5。
表4正常人血清抗AnnexinA2-IgG检测结果频数分布表(n＝259)
Figure BDA0002287777870000101
Figure BDA0002287777870000111
表5 259例健康体检人员血清标本抗Annexin A2-IgG检测结果
Figure BDA0002287777870000112
Figure BDA0002287777870000121
Figure BDA0002287777870000131
实施例8、检测血清抗Annexin A2-IgG试剂盒临床应用
8.1各类肾病病人中抗AnnexinA2-IgG的检出率利用本试剂盒检测从2018年6月到2019年6月在我院诊断出各类肾病的患者血清中抗Annexin A2-IgG水平，包括370例原发性肾病综合征、44例紫癜性肾炎、50例单纯性血尿、75例IgA肾病、19例狼疮性肾炎及同时期35例健康儿童，结果显示原发性肾病综合征病人中抗AnnexinA2-IgG的检出率为17.8％， IgA肾病病人中抗AnnexinA2-IgG的检出率为2.6％，而在紫癜性肾炎、单纯性蛋白尿、狼疮性肾炎以及健康儿童中没有检测到该抗体，见图7、8。
8.2 66例原发性肾病综合征病人抗AnnexinA2-IgG浓度阳性与激素耐药和频复发的关系结合患者临床治疗情况及有无复发，本发明发现66例抗AnnexinA2-IgG阳性的原发性肾病综合征病人中有60例激素耐药，耐药率为90.1％显著高于抗AnnexinA2-IgG阴性的病人的激素耐药率(34.9％,106/304)(χ2＝34.424,P＝0.000)，见图9。
8.3抗AnnexinA2-IgG浓度阳性的原发性肾病综合征病人病人住院时间和尿蛋白含量关系抗AnnexinA2-IgG阳性的原发性肾病综合征病人病人住院中位数时间显著长于该抗体阴性的原发性肾病综合征病人(17d vs 12d，Z＝-2.539,P＝0.011)，尿蛋白(Z＝-2.341,P＝0.029) 和尿-IgG/肌酐(Z＝-2.543,P＝0.011)也显著升高，中位数分别为2550.6mg/L vs 1706.0mg/L 和11.75vs 6.5，见图10A、B、C。
8.4观察使用免疫抑制剂进行治疗以后原发性肾病综合征患者体内的抗AnnexinA2 -IgG浓度、24小时尿蛋白水平及血清白蛋白水平的变化结果显示抗AnnexinA2-IgG浓度逐渐下降，并伴随着24小时尿蛋白水平的不断减少和血清白蛋白的升高，见图11A：原发性肾病综合征患者24小时尿蛋白水平和血清白蛋白的升变化；B：免疫印迹法检测原发性肾病综合征患者血清中抗AnnexinA2-IgG的水平。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 1
tgattttatt ttattttatt tcatttaaat ttaacttaaa tagcgacact tggatagggg 60
caaccatact gtacagctca gtcccagagc tttcttccta ca 102
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
gaattctgat tttattttat ttta 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
ggatcctgta ggaagaaagc tctg 24

Claims (2)

1.一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒，其特征在于，由抗原蛋白AnnexinA2、固相载体、阳性质控品、标准品、酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的抗人IgG、底物显色剂、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、洗涤液、终止液组成，所述的抗原蛋白Annexin A2的序列如SEQ ID:1所示，所述的抗原蛋白Annexin A2上带有His标签肽，所述标准品和阳性质控品为人抗His标签肽免疫球蛋白G，或从血清中提取抗Annexin A2抗体作为阳性质控品和标准品，所述固相载体选用硝酸纤维素膜、酶标微孔板；所述显色剂为TMB、吖啶酯、AMPPD、4-MUP；所述抗原稀释液为1x PBS pH7.4、NaCL163mM、1%TritonX-100；所述样品稀释缓冲液为0.01M PBS pH7.4+10%新生牛血清；所述抗人IgG稀释液为含有1M D-glucose、2%甘油的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液为取1M D-glucose、2%甘油加入含0.35% Tween2的0.01M PBS至100ml；所述洗涤液为：1x PBS pH7.4、NaCL163mM、1%TritonX-100、甘油10%；所述终止液为：2M硫酸；所述抗原蛋白Annexin A2固定于固相载体上；所述抗原蛋白Annexin A2经Ni柱亲和层析、分子筛、离子交换柱、疏水柱纯化；所用的抗原蛋白Annexin A2固定方法为直接包被法，通过物理吸附或化学结合或非共价键结合将抗原蛋白直接固定于固相载体上。
2.根据权利要求1所述的一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒，其特征在于，试剂盒中抗原Annexin A2对应的血清自身抗体的相对滴度定量采用统一的标签肽和抗标签肽抗体之间的特异性免疫反应及标准曲线的回归来进行计算。
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Assignee: Century Yishu (Hangzhou) Medical Diagnostic Technology Co.,Ltd.

Assignor: ZHEJIANG University

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Denomination of invention: A reagent kit for detecting serum anti Annexin A2- IgG antibodies

Granted publication date: 20201030

License type: Exclusive License

Record date: 20230505

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