WO2012100599A1 - 过氧化物还原酶iv在制备类风湿关节炎体外诊断试剂中的应用 - Google Patents
过氧化物还原酶iv在制备类风湿关节炎体外诊断试剂中的应用 Download PDFInfo
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- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
Definitions
- the present invention relates to the field of medical testing, and in particular to an indirect ELISA kit for detecting a peroxide reductase IV antibody in a biological specimen, and a method and use thereof.
- Rheumatoid arthritis is a systemic autoimmune disease characterized by synovitis as a basic pathological change characterized by chronic destructive joint disease. Most of the conditions are progressive, eventually leading to joint fibrosis or bony rigidity. Severe disability, seriously affecting the quality of life of patients. Rheumatoid arthritis without proper treatment can be delayed and even cause joint deformities. As a self-immune disease, pathogenic antigen-driven autoreactive CD4+ T cell activation is a central pathway in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
- RA pathological changes of RA gradually progress from cartilage tissue to cartilage to bone. If RA is not effectively treated in the early stage, it will cause joint dysfunction and even labor loss, and cause multiple organs in the body to be involved and endangered. If you can diagnose the condition of RA as soon as possible and treat it early to prevent or delay its development, it will effectively improve the treatment effect of RA and reduce its complications.
- the detection of high sensitivity and specificity in the early stage of RA is a prerequisite for the early diagnosis and treatment of RA.
- Rheumatoid factor has the disadvantage of low sensitivity; 53.3% of patients with early RF-negative rheumatoid arthritis are positive for anti-peripheral factor (APF), but APF antigen
- APF antigen
- the storage time of the tablets is short (only 1 ⁇ 2 weeks), and the detection stability is low; the positive rate of Sa antibody in rheumatoid arthritis is 40%, the specificity is 98.9%, but the early stage of rheumatoid arthritis is only about 23%. Correlation studies between peroxide reductase IV and rheumatoid arthritis have not been reported.
- the ELISA kit for detecting a peroxide reductase IV antibody in a biological specimen according to 1, wherein the biological specimen is serum, urine, cells, tissue or plasma.
- a second object of the present invention is to provide a use of the above kit, which can make up for the technical blank in the field of detection of a peroxide reductase IV antibody, and provides a diagnostic idea for rheumatoid arthritis and other immune diseases, and is particularly suitable for use in Detection of biological specimens.
- a third object of the present invention is to provide a method for the content of a peroxide reductase IV antibody which is highly sensitive and simple to handle.
- step a coating the antibody capture agent with an enzyme label, contacting the biological sample to be tested with the antibody capture agent, and keeping warm and using The blocking solution is blocked; the biological specimen is a serum dilution of no more than 200 volume dilutions, and the antibody capture agent is a dilution of less than lg/ml of the peroxide reductase IV.
- step b The method for detecting the content of a peroxide reductase IV antibody by using an ELISA kit according to 13, in step b, separating the unbound biological specimen by washing the enzyme plate sealed in step a and blocked with a blocking solution, Antigen-antibody complex.
- step d the substrate is added to the double-antibody complex obtained in step c, and the substrate is protected from light and then terminated.
- the colorant sample solution is reacted, and the content of the peroxide reductase IV antibody bound to the antibody capture agent is detected by measuring the OD 45Qnm value of the color developing sample solution.
- the kit can specifically detect the content of the peroxide reductase IV antibody, Low, sensitive; use this kit to detect the content of peroxide reductase IV antibody, and compare with the normal human peroxide reductase IV antibody level, can specifically teach high diagnostic rheumatoid arthritis Therefore, the kit can be prepared into a rheumatoid arthritis diagnostic kit, which is especially suitable for early diagnosis.
- a human peroxidase reductase IV expression plasmid was constructed, and a recombinant antigen TRX-peroxide reductase IV fusion protein was prepared using the pET prokaryotic expression system.
- TRX-peroxide reductase IV plasmid and the expressed peroxidase IV antigen was identified by DNA sequencing, relative molecular mass analysis of the fusion protein and Western blotting.
- Horseradish-labeled goat anti-human IgM was purchased from Lifescience; horseradish-labeled goat anti-mouse IgG (H+L) was purchased from Beijing Zhongshan Biotechnology Co., Ltd.; mouse anti-human peroxide reductase IV monoclonal antibody was purchased from Abeam Company (potency 1:12800);
- 1% blocking solution Add 10mL blocking solution to 90ml TBS and store at -15 ⁇ -25°C. 0.5% blocking solution: Add 5 mL of blocking solution to 95 mL of TBS and store at -15 ⁇ -25 °C. Serum dilution: The primary antibody was diluted with 0.5% blocking solution. HRP-labeled anti-mouse or human IgG was diluted 1:0.5 times with 0.5% blocking solution to obtain a secondary antibody working solution. Coating solution: 0.85M (pH 9.6) Carbonate buffer: 1.59g Na 2 C0 3 plus 2.93g NaHC0 3 , three distilled water to a constant volume of 1000mL. Washing solution: 0.01 M pH 7.4 PBS Ten Tween-20 (T) The final mass fraction was 0.05%.
- Substrate solution Phosphate-citrate buffer (pH 5.0 ⁇ 5.5): 0.1M Citric acid 24.3mL Add 25.7ml 0.2M Na 2 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 Add o-phenylenediamine 40.0mg, dilute to 50mL , before use, add 0.15mL volume fraction of 30% 3 ⁇ 40 2 . Terminator: 22.2 mL of sulfuric acid was added to 177.8 mL of distilled water.
- the human peroxide reductase IV coating and the serum to be tested were serially diluted, and the square matrix test was carried out. The results are shown in Table 1.
- the results of square array titration showed that the concentration of human peroxidase reductase IV was 50 g/ml, and the serum to be tested was diluted 1:200, the serum OD 45 () nm value of rheumatoid arthritis was greater than 1.0, negative positive serum OD 45 () nm ratio (PIN) maximum of 10.45; human peroxide reductase IV coating concentration of 20 g / ml, serum 1: 200 dilution, rheumatoid arthritis serum OD 45 () nm value is greater than 1.0, the ratio of OD 45 () nm in the positive-positive serum (P / N) was 10.08, which was only 0.37 less than the ratio of OD 450nm in the largest negative-positive serum.
- Table 1 Determination of the optimal working concentration of human peroxidase reductase IV and human test serum. Dilution factor of human test serum. Human peroxide reductase IV coating concentration ( ⁇ g/ml)
- AD autoimmune diseases
- RA rheumatoid arthritis
- NC normal people
- the average value of OD 45Qmn value is 0.2146 0.2152 0.2336 2.4231 0.1667
- the 2 g/ul mouse anti-human peroxide reductase IV monoclonal antibody was diluted according to the following concentration gradient (2000 ng/ml, 1000 ng/mK 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62.5 ng/ Ml, 31.25 ng/mU 15.625 ng/mK 7.8125 ng/ml), 100 ⁇ L/well was added to the ELISA plate, and each dilution was repeated 3 times.
- the indirect ELISA method was established according to the established peroxide reductase IV antibody. The results are shown in Table 3 and Figure 2.
- the OD450nm value was 1.082, which was slightly larger than the blank control value of 0.895, since lOO L was added to each enzyme standard well, therefore, in serum
- the minimum content of the peroxide-containing reductase IV antibody was determined to be 0.78 ng.
- the serum OD 45Q values of the above-mentioned early RA patients and normal subjects were analyzed by the GraphPad Prism software for the receiver operating curve (R0C), as shown in Fig. 3, the specific sensitivities were 76.67%, 96.67 %, respectively. .
- the OD 45Q value of the above-mentioned patients with advanced RA and normal subjects was analyzed by the GraphPad Prism software for the receiver operating curve (R0C), as shown in Fig. 4, the specific sensitivities were 94.12%, 96.67 %, respectively. .
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Description
过氧化物还原酶 IV在制备类风湿关节炎体外诊断试剂中的应 甩 技术领域
本发明涉及医学检验领域, 特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的间 接 ELISA试剂盒及其方法与运用。
背景技术
类风湿关节炎 (RA) 是一种以滑膜炎为基本病理改变, 以慢性破坏性关节病变为特征的 全身性自身免疫病, 大多病情呈进行性, 最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残, 严重 影响患者生活质量。 未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈, 甚至导致关节畸形。 作为自 身免疫性疾病, 致病抗原驱动的自身反应性 CD4+T 细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途 径。
对于类风湿关节炎的诊断, 现在主流仍然沿用 1987 年美国风湿病学学会 RA 的分类标 准, 其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对 RA进行判断。 另外, X线改变和类风湿因 子也是判断 RA的常用标准。 但上述方法操作繁琐且特异性不高, 且不适用于早期诊断。
众所周知, RA 的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。 RA 在早期若未得到 有效治疗, 将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失, 并导致全身多脏器受累进而危及生命。 如果能尽早对 RA病情做出诊断, 及早治疗, 从而阻止或延缓其发展, 将能有效的提高 RA 的治疗效果并减少其并发症的发生。 而针对 RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实 现 RA早期诊断和治疗的前提。
早期诊断指标中, IL-8、 IL-6水平在巨细胞病毒 DNA 阳性的类风湿关节炎患者中升高 和 CMV基因组出现之间存在联系, 但特异性和敏感性低。 在 RA 自身抗体作为检测指标方 面: 类风湿因子 (RF) 存在灵敏度低的缺点; 在早期 RF 阴性的类风湿关节炎病人中可 53.3% 的病人抗核周因子 (APF ) 呈阳性, 但 APF 抗原片的保存时间较短 (仅为 1〜2 周), 检测稳定性低; Sa抗体在类风湿关节炎中阳性率为 40%, 特异性为 98.9%, 但类风湿 关节炎早期仅约 23%; 过氧化物还原酶 IV和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。
发明内容
有鉴于此, 本发明的目的之一在于提供一种试剂盒, 该试剂盒能快速检测过氧化物还原 酶 IV抗体的含量, 操作简单, 成本低廉。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
1、 用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA 试剂盒, 所述 ELISA试剂 盒包括抗体捕获剂、 酶标二抗和底物。
2、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 所述 抗体捕获剂为过氧化物还原酶 IV作不小于 1 μ g/mL的稀释。
3、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 抗体 捕获剂附于固相支持物上。
4、 根据 3所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 所述 固相支持物为酶标板或生物芯片。
5、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 所述 生物标本为血清、 尿液、 细胞、 组织物或血浆。
6、 根据 5所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 所述 生物标本为血清, 所述血清为不大于 200倍体积稀释的血清稀释液。
7、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 所述 酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人 IgG作不大于 20000倍稀释的稀释液。
8、 根据 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 所述 抗体捕获剂与酶标二抗的用量体积比为 1:1。
本发明的目的之二在于提供上述试剂盒的用途, 该用途能弥补过氧化物还原酶 IV抗体检 测领域的技术空白, 并为类风湿关节炎及其它免疫性疾病提供了诊断思路, 特别适用于生物 标本的检测。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
9、 1-8 所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA 试剂盒在检测过 氧化物还原酶 IV抗体含量的应用。
10、 根据 9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒的应 用, 所述 ELISA试剂盒在制备检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。
11、 根据 9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒的应 用, 所述 ELISA试剂盒在制备检测早期类风湿关节炎试剂盒中的应用。
12、 根据 9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒的应 用, 所述 ELISA 试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶 IV抗体的含量, 当待 测血清的 OD45Qnm值大于 0.5610为过氧化物还原酶 IV抗体阳性, 小于或等于 0.5610为过氧 化物还原酶 IV抗体阴性。
本发明的目的之三在于提供过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 该方法敏感性高, 操作 简单。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
13、 运用 1-8任一项所述 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, a、 将 生物标本与 ELISA试剂盒中的抗体捕获剂接触并保温; b、 将未结合的生物标本分离, 得抗 原-抗体复合物; c、 在步骤 b所得的抗原-抗体复合物加入 ELISA试剂盒中的酶标二抗, 得 双抗复合物; d、 检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶 IV抗体的含量。
14、 根据 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 所述方 法还包括将步骤 d所得的过氧化物还原酶 IV抗体的含量与正常人过氧化物还原酶 IV抗体的含 量进行比较判断。
15、 根据 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 步骤 a 中, 将抗体捕获剂包被酶标板, 将待测生物标本与抗体捕获剂接触, 保温并用封闭液封闭; 所述生物标本为不大于 200倍体积稀释的血清稀释液, 所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶 IV 作小于 l g/ml的稀释液。
16、 根据 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 步骤 b 中, 将步骤 a 中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离, 得抗原 -抗体 复合物。
17、 根据 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 步骤 c 中, 在步骤 b所得的抗原-抗体复合物加入 ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应, 得双 抗夹心复合物; 所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人 IgG作不大于 20000倍稀释的稀释液。
18、 根据 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 步骤 d 中, 在步骤 c所得的双抗复合物中加入底物避光显色后, 加入终止液终止反应得显色样品液, 通过测显色样品液的 OD45Qnm值检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶 IV抗体的含量。
19、 根据 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 所述方 法还包括阴性对照组和空白对照组, 所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。
20、 根据 19所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 所述待 测生物标本, (敏感性 +特异性) 一 1 最大值所对应的 OD45Qnm值为临界值, 待测生物标本的 OD45Qnm值大于临界值时, 判定为过氧化物还原酶 IV抗体阳性, 待测生物标本的 OD45Qnm值 小于或等于临界值时判定为过氧化物还原酶 IV抗体阴性。
本发明的有益效果在于: 本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶 IV抗体的含量, 其成
本低, 敏感性佳; 运用本试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体的含量, 并与正常人的过氧化物 还原酶 IV的抗体水平进行比较, 可特异性教高的诊断类风湿关节炎, 所以该试剂盒可以制备 成类风湿关节炎诊断试剂盒, 尤其适用于早期诊断。
附图说明
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面将结合附图对本发明作进一步的 详细描述, 其中:
图 1为间接 ELISA'法检测早期 RA、 晚期 RA及正常人血清中过氧化物还原酶 IV抗体的 分析图。
图 2为过氧化物还原酶 IV间接法 ELISA标准曲线,横坐标为小鼠抗人单克隆抗体稀释倍 数, 纵坐标为不同稀释倍数抗体所对应的 OD45()值。
图 3 为 ELISA试剂盒在检测早期类风湿关节炎受试者分析曲线的特异性和敏感性分析 图, 其中横坐标为敏感性, 纵坐标为 (100-特异性)。
图 4 为 ELISA试剂盒在检测晚期类风湿关节炎受试者分析曲线的特异性和敏感性分析 图, 其中横坐标为敏感性, 纵坐标为 (100-特异性)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面结合附图对本发明的优选实施例 进行详细的描述。 本实施例中所述抗原包被物人过氧化物还原酶 IV的获得是通过构建原核表 达质粒、 转化表达菌并发酵培养, 收集到大量的含有过氧化物还原酶 IV的菌体沉淀, 辣根过 氧化物 »(HRP)标记的山羊抗人 G, 作为间接法 ELISA的二抗; 进一步确定了人过氧化物 还原酶 IV包被浓度和检测血清的最佳浓度范围及阴阳性临界值的确定, 制定了一种特异性和 敏感性高的类风湿关节炎过氧化物还原酵 IV抗体检测方法, 其能捕获 7.8ng/mL过氧化物还 原酶 IV抗体。
实施例 过氧化物还原酶 IV抗体间接法 ELISA试剂盒及其方法与运用
一、 包被物人过氧化物还原 KIV的制备
构建人过氧化物还原酶 IV表达质粒,用 pET原核表达***制备重组抗原 TRX-过氧化物还 原酶 IV融合蛋白。
1 根据 enBank 中检索到的人过氧化物还原酶 IV成熟蛋白序列编码,设计合成编码过氧 化物还原酶 IV蛋白的 DNA;
2分别在 DNA5 ' 端和 3 ' 端设计 EcoR I和 Hhidlll酶切位点,经聚合酶链反应 (PCR)、 构 建重组质粒 pET过氧化物还原酶 IV;
3在 BL21 (DE3 )经 IPTG诱导表达;
更正页 (细则第 91条) ISA/CN
4 Ni-NTA亲和层析制备 TRX-过氧化物还原酶 IV;
5通过 DNA测序、 融合蛋白的相对分子质量分析及 Western印迹来鉴定 TRX-过氧化物 还原酶 IV质粒及表达的过氧化物还原酶 IV抗原的正确性。
二、 过氧化物还原酶 IV抗体的间接法 ELISA试剂盒及其方法与运用
1、 实验材料
1.1、 试剂
辣根酶标记山羊抗人 IgM购自 Lifescience公司; 辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG (H+L) 购 自北京中山生物技术公司; 小鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克隆抗体购自 Abeam 公司 (效价 1:12800);
1.2、 仪器
紫外分光光度仪 Backmen 公司。
1.3、 主要试剂配制
1 %封闭液: 加入 10mL封闭液贮液到 90mlTBS中, 在 -15~-25°C稳定保存。 0.5 %封闭 液: 加入 5mL封闭液贮液到 95mLTBS中, 在 -15~-25°C稳定保存。 血清稀释液: 用 0.5 %的 封闭液稀释一抗。 HRP标记的抗小鼠或人 IgG用 0.5 %的封闭液稀释为 1 : 10000倍, 得到 二抗工作液。 包被液: 0.85M (PH 9.6) 碳酸盐缓冲液: 1.59g Na2C03加 2.93g NaHC03, 三蒸水定容 1000mL。 洗涤液: 0.01M pH7.4 PBS十吐温 -20 (T) 使最终质量分数为 0.05 %。 底物溶液: 磷酸盐-柠檬酸缓冲液 (pH5.0~5.5) : 0.1M 柠檬酸 24.3mL 加入 25.7ml 0.2M Na2HP04 · 12H20加入邻苯二胺 40.0mg, 定容至 50mL, 临用前加 0.15mL体积分数为 30 %的¾02。 终止剂: 22.2mL硫酸加入蒸馏水 177.8mL。
1.4、 待测样品 5例 RA滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供; 534 例 RA (其中早期 67 例、 晚期 467 例)、 65 例 OA、 120 例 SLE、 10 例硬皮病
( scleroderma )、 15例皮肌炎 (dermatomyositis) 及 120例正常对照 (NC) 血液标本源自西 南医院。
将收集的促凝血液标本 4°C过夜后经 3,000rpm离心 30分钟, 取上清, lOOul分装, -70
°C保存。
2、 过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒及其方法与运用
2.1、 最佳过氧化物还原酶 IV包被浓度和检测血清稀释倍数的确定
采用方阵滴定法, 具体步骤如下: (1 ) 将含 lO g/ul重组表达的人过氧化物还原酶 IV按 照如下浓度稀释 (5 g/ml、 10 μ g/mK 20 g/mU 50 μ g/mU lOO g/ml), 100 μ Ι7孔加于酶
标板中, 置 4°C湿盒孵育 12小时, 洗板机洗涤 3次, 5min/次, 拍干; (2) 加入 100 μ ΐ/孔封 闭液, 4°C湿盒封闭过夜, 洗板机洗涤 3次, 5min/次, 拍干; (3) 待测血清按照 1 : 20、 1: 50、 1: 100、 1: 200倍稀释, 100 μ ΐ/孔, 37°C湿盒作用 lh, 洗板机洗涤 10次, 3min/次, 拍干; (4) 将 HRP标记的山羊抗人 IgG按照 1 : 4000稀释, ΙΟΟ μ Ι/L, 加入酶标板中, 37 °〇湿盒孵育 30 分钟, 洗板机洗涤 10 次, 3min/次, 拍干; 酶标二抗按照已确定比例 1 : 4 000使用; ( 5 ) 加入 TMB底物 100 μ 1/孔, 37 °C避光显色 5min后, 加入 100 μ 1/孔 2mol/L硫 酸终止反应; (6) 检测: 用酶标仪测 OD450nm值。 同时以 1%的 BSA/PBS溶液作空白对照, 以 P/N值最大的人过氧化物还原酶 IV包被物浓度和待测血清稀释度为最佳工作浓度。
分别将人过氧化物还原酶 IV包被物和待测血清作系列稀释, 进行方阵试验, 结果见表 1。 方阵滴定结果显示, 人过氧化物还原酶 IV包被浓度为 50 g/ml, 待测血清 1 : 200倍稀释 时, 类风湿关节炎血清 OD45()nm值大于 1.0, 阴阳性血清 OD45()nm比值 (P I N)最大为 10.45; 人过氧化物还原酶 IV包被浓度为 20 g/ml, 待测血清 1 : 200倍稀释时, 类风湿关节炎血清 OD45()nm值大于 1.0, 阴阳性血清 OD45()nm比值 (P / N)为 10.08, 仅比最大阴阳性血清 OD450nm 比值小 0.37, 考虑抗原包被成本, 因此选择人过氧化物还原酶 IV包被浓度为 20 g/ml 为最 佳包被浓度; 待测血清 1 : 200倍稀释为最佳稀释浓度。
表 1 人过氧化物还原酶 IV和人待测血清最佳工作浓度的确定 人待测血清的稀释倍数 人过氧化物还原酶 IV包被浓度 ( μ g/ml )
100 50 20 10 5
类风湿关节炎患者血清 OD45Qnm值 10 3.013 2.845 2.644 2.442 2.009
( P值) 50 2.866 2.342 2.201 2.002 1.867
100 2.620 2.177 2.009 1.911 1.766
200 2.221 2.102 1.977 1.800 1.633 正常人血清 OD45Qnn i 10 0.623 0.587 0.545 0.496 0.477
( N值) 50 0.532 0.388 0.335 0.321 0.302
100 0.371 0.221 0.215 0.208 0.199
200 0.321 0.201 0.196 0.195 0.188
P/N值 10 4.84 4.85 4.85 4.92 6.65
50 5.39 6.04 6.57 6.24 6.18
100 7.06 9.85 9.34 9.19 8.87
200 6.89 10.45 10.08 9.23 8.69
2.2、 阴阳性临界值的确定
表 2 30份正常人血清间接 ELISA过氧化物还原酶 IV抗体检测结果 编号 1 2 3 4 5 6 7 8
OD450nm 0.250 0.310 0.380 0.390 0.450 0.510 0.520 0.390 编号 9 10 11 12 13 14 15 16
OD450 0.370 0.340 0.330 0.660 0.520 0.490 0.460 0.530 编号 17 18 19 20 21 22 23 24
OD450nm 0.520 0.510 0.550 0.370 0.360 0.310 0.420 0.440 编号 25 26 27 28 29 30
OD450nm 0.380 0.480 0.420 0.390 0.300 0.410
表 3 30份早期 RA患者血清间接 ELISA过氧化物还原酶 IV抗体检观 U结果 编号 1 2 3 4 5 6 7 8
OD450 0.970 1.890 1.200 1.930 1.470 1.870 1.900 1.470 编号 9 10 11 12 13 14 15 16
OD450 1.210 2.120 0.790 0.360 0.950 0.810 0.300 0.280 编号 17 18 19 20 21 22 23 24
OD450nm 0.790 0.910 0.300 0.950 1.550 1.860 1.600 2.000 编号 25 26 27 28 29 30
OD450 0.570 0.410 0.440 0.480 0.880 1.780
表 4 17份晚期 RA患者血清间接 ELISA过氧化物还原酶 IV抗体检观 U结果 编号 1 2 3 4 5 6 7 8
OD450 1.860 1.890 1.800 1.990 0.620 1.300 1.200 1.100 编号 9 10 11 12 13 14 15 16
OD450nm 0.700 0.870 0.750 1.370 1.870 1.900 2.100 1.200 编号 17
OD450nm 0.780
表 5 受试者工作曲线临界值分析结果
OD值 Sensitivity % 95% CI Specificity% 95%CI Likelihood ratio
> 0.2650 100.0 92.45% to 100.0% 3.333 0.08436% to 17.22% 1.03
> 0.2900 97.87 88.71 % to 99.95% 3.333 0.08436% to 17.22% 1.01
> 0.3050 93.62 82.46% to 98.66% 10.00 2.1 12% to 26.53% 1.04
> 0.3200 93.62 82.46% to 98.66% 13.33 3.755% to 30.72% 1.08
> 0.3450 93.62 82.46% to 98.66% 16.67 5.642% to 34.72% 1.12
> 0.3650 91.49 79.62% to 97.63% 20.00 7.713% to 38.57% 1.14
> 0.3720 91.49 79.62% to 97.63% 26.67 12.28% to 45.89% 1.25
> 0.3770 91.49 79.62% to 97.63% 30.00 14.73% to 49.40% 1.31
> 0.3850 91.49 79.62% to 97.63% 36.67 19.93% to 56.14% 1.44
> 0.4000 91.49 79.62% to 97.63% 46.67 28.34% to 65.67% 1.72
> 0.4150 89.36 76.90% to 96.45% 50.00 31.30% to 68.70% 1.79
> 0.4300 89.36 76.90% to 96.45% 56.67 37.43% to 74.54% 2.06
> 0.4450 87.23 74.26% to 95.17% 60.00 40.60% to 77.34% 2.18
> 0.4550 87.23 74.26% to 95.17% 63.33 43.86% to 80.07% 2.38
> 0.4700 87.23 74.26% to 95.17% 66.67 47.19% to 82.71 % 2.62
> 0.4850 85.1 1 71 .69% to 93.80% 70.00 50.60% to 85.27% 2.84
> 0.5000 85.1 1 71 .69% to 93.80% 73.33 54.1 1 % to 87.72% 3.19
> 0.5150 85.1 1 71 .69% to 93.80% 80.00 61 .43% to 92.29% 4.26
> 0.5250 85.1 1 71 .69% to 93.80% 90.00 73.47% to 97.89% 8.51
> 0.5400 85.1 1 71 .69% to 93.80% 93.33 77.93% to 99.18% 12.77
> 0.5610 85.1 1 71 .69% to 93.80% 96.67 82.78% to 99.92% 25.53
> 0.5960 82.98 69.19% to 92.35% 96.67 82.78% to 99.92% 24.89
> 0.6400 80.85 66.74% to 90.85% 96.67 82.78% to 99.92% 24.26
取 30份正常人血清, 30份早期 RA、 17份晚期 RA患者血清, 用上述建立的过氧化物 还原酶 IV抗体间接 ELISA的方法检测。 将各样品所测得 OD450值分组带入 GraphPad Prism 软件进行受试者工作曲线 (R0C ) 分析, 选择 (特异性%+敏感性%) -1 为最大值所对应的 0D450值为临界值, 如表 5 所示, 0. 5610 为阴阳性临界值, 待测样品的 OD450nm值大于 0. 5610为过氧化物还原酶 IV阳性, 小于或等于则为阴性。
2.3特异性试验
取骨性关节炎 (0A)、 ***性红斑狼疮 (SLE)、 其他自身免疫性疾病 (AD ), 包括多 形性硬化、 硬皮病、 皮肌炎、 类风湿关节炎 (RA) 和正常人对照 (NC) 血清, 按照本实施 例中的方法进行检测, 观察结果。
过氧化物还原酶 IV抗体间接法 ELISA特异性试验结果
疾病或正常人血清 OA AD SLE RA NC
OD45Qmn值的平均值 0.2146 0.2152 0.2336 2.4231 0.1667
将含 2 g/ul 小鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克隆抗体按照如下浓度梯度倍比稀释 (2000ng/ml、 lOOOng/mK 500ng/ml、 250ng/ml、 125 ng/ml、 62.5ng/ml、 31.25 ng/mU 15.625 ng/mK 7.8125 ng/ml), 100 μ L/孔加于酶标板中, 每个稀释度重复 3次, 按建立的过氧化物 还原酶 IV抗体间接 ELISA方法检测, 结果见表 3和图 2。 将小鼠抗人过氧化物还原酶 IV单克 隆抗体稀释至 7.8125ng/ml时, OD450nm值为 1.082, 稍大于空白对照值 0.895, 由于在每一 酶标孔中加 lOO L, 因此, 血清中检测含过氧化物还原酶 IV抗体最低含量为 0.78ng。
表 7 过氧化物还原酶 IV抗体间接法 ELISA敏感性试验结果
过氧化物还原酶 IV倍比稀释浓度 ( ng/ml )
2000 1000 500 250 125 62. 5 31. 25 15. 625 7. 8125 0
OD450nm
平均值 2. 823 1. 920 1. 501 1. 277 1. 167 1. 129 1. 094 1. 087 1. 082 0. 895 线性回归公式: Y=0.0009X+1.0391
2.5重复性试验结果
( 1 ) 批内重复性测定试验: 取 3 份不同时间收集到的类风湿关节炎血清, 按最佳稀释 度稀释, 加到抗原包被孔中, 每份样品做 3次重复 ELISA测定。 由每份样品的 OD45()nm值计 算出平均 OD45()nn (X) 与标准方差 (SD), 进而计算出每份样品批内变异系数 [CV=(SD/X) X 100 ] ; (2) 批间重复性测定试验: 在其它条件相同的情况下, 用 3 份不同批次制备的纯 化的小鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体包被酶标板, 对 3份不同时间收集到的类风湿关节炎血 清进行检测。 由每份样品的 OD45()nm值计算出平均 OD45()nn (X) 与 SD, 进而计算出每份 样品的批间变异系数。
经统计学分析, 3 份不同时间收集到的类风湿关节炎血清之间批内重复试验 OD45ftm^ 的变异系数 (CV) 为 2.34%〜4.87%, 小于 5%; 3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清 3 次批间重复试验 OD45Qnm值的 CV为 1.27%〜3.79%, 小于 5% (表 4)。 表明建立的过氧化物还 原酶 IV抗体间接 ELISA方法具有很好的批内及批间重复性。
表 8 重复性试验结果
项目 血清 测定次数 Times of test 平均值 标准差 变异系数
Item Sera 1st 2nd 3rd X SD /% cv
板内 1 2.133 2.147 2.326 2.202 0.1076 4.87%
Within 2 2.536 2.521 2.632 2.563 0.060 2.34%
plate 3 1.955 1.823 1.949 1.909 0.745 3.90%
项目 血清 测定 4比次 Times of test 平均值 标准差 变异系数
Item Sera 1st 2nd 3rd X SD /% cv
板间 1 2.823 2.970 2.857 2.883 0.077 2.67%
Among 2 1.723 1.745 1.701 1.723 0.022 1.27%
plates 3 1.643 1.649 1.540 1.611 0.061 3.79%
2.6、 检测方法的确定
结论:在 RA患者血清中过氧化物还原酶 IV抗体滴度明显高于正常人血清 (P<0.01 )。 尤 其在晚期 RA 血清中过氧化物还原酶 IV抗体滴度与正常人血清比较增高更为明显 (P< 0.001 ); 通过 cutoff 值 (0.5610) 判断阳性率, 在晚期 RA 患者血清中过氧化物还原酶 IV抗 体特异性为 96.67%, 敏感性为 94.12%; 过氧化物还原酶 IV抗体在早期 RA患者血清中的特 异性为 96.67%, 敏感性为 76.67%。
3、 含过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒在 RA诊断中的运用
本申请中所述早期类风湿关节炎定义为发现临床症状时间 2月以内的患者。 取早期 RA患 者 30例, 晚期 RA患者 17例, 用实施例 2所述试剂盒及方法检测其 OD45Q值, 如表 3, 4所
7 。
将上述早期 RA患者和正常人的血清 OD45Q值通过 GraphPad Prism软件进行受试者工作 曲线 (R0C) 分析, 如图 3所示, 其特异性敏感性分别为 76. 67%、 96. 67%。
将上述晚期 RA患者和正常人的血清 OD45Q值通过 GraphPad Prism软件进行受试者工作 曲线 (R0C) 分析, 如图 4所示, 其特异性敏感性分别为 94. 12%、 96. 67%。
最后说明的是, 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制, 尽管通过参照本发 明的优选实施例已经对本发明进行了描述, 但本领域的普通技术人员应当理解, 可以在形式 上和细节上对其作出各种各样的改变, 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范 围。
Claims
1. 用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述 ELISA 试剂盒包括抗体捕获剂、 酶标二抗和底物。
2. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶 IV作终浓度不小于 1 μ g/mL的稀释液。
3. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于: 抗体捕获剂附于固相支持物上。
4. 根据权利要求 3所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
5. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述生物标本为血清、 尿液、 细胞、 组织物或血浆。
6. 根据权利要求 5所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述生物标本为血清, 所述血清为不大于 200倍体积稀释的血清稀释液。
7. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述酶标二抗为辣根酶标记的山羊抗人 IgG作不大于 20000倍稀释的稀释液。
8. 根据权利要求 1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒, 其特征在于:所述抗体捕获剂与酶标二抗用量体积比为 1:1。
9. 权利要求 1-8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶 IV抗体的 ELISA试剂盒在检 测过氧化物还原酶 IV抗体含量的应用。
10. 根据权利要求 9所述的 ELISA试剂盒的应用, 其特征在于: 所述 ELISA试剂盒在制备 检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。
11. 根据权利要求 9所述的 ELISA试剂盒的应用, 其特征在于: 所述 ELISA试剂盒在制备 检测早期类风湿关节炎试剂盒中的应用。
12. 根据权利要求 9所述的 ELISA试剂盒的应用, 其特征在于: 所述 ELISA试剂盒检测待 测血清与正常人血清的过氧化物还原酶 IV抗体的含量, 当待测血清的 OD45Qnm值大于 0.5610 为过氧化物还原酶 IV抗体阳性, 小于或等于 0.5610为过氧化物还原酶 IV抗体阴性。
13. 运用权利要求 1-8 任一项所述 ELISA 试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, a、 将生物标本与 ELISA 试剂盒中的抗体捕获剂接触并保温; b、 将未结合的生物标本分 离, 得抗原-抗体复合物; c、 在步骤 b所得的抗原-抗体复合物加入 ELISA试剂盒中的酶标 二抗, 得双抗复合物; d、 检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶 IV抗体的含量。
14. 根据权利要求 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 所述方法还包括将步骤 d所得的过氧化物还原酶 IV抗体的含量与正常人过氧化物 还原酶 IV抗体的含量进行比较判断。
15. 根据权利要求 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 步骤 a中, 将抗体捕获剂包被酶标板, 将待测生物标本与抗体捕获剂接触, 保温 并用封闭液封闭; 所述生物标本为不大于 200倍体积稀释的血清稀释液, 所述抗体捕获剂为 过氧化物还原酶 IV作不小于 1 μ g/ml的稀释液。
16. 根据权利要求 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 步骤 b中, 将步骤 a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分 离, 得抗原-抗体复合物。
17. 根据权利要求 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 步骤 c中, 在步骤 b所得的抗原-抗体复合物加入 ELISA试剂盒中的酶标二抗进 行保温反应, 得双抗夹心复合物; 所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人 IgG作不大于 20000 倍稀释的稀释液。
18. 根据权利要求 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 步骤 d中, 在步骤 c所得的双抗复合物中加入底物避光显色后, 加入终止液终止 反应得显色样品液,通过测显色样品液的 OD45Qnm值检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶 IV抗体的含量。
19. 根据权利要求 13所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 所述方法还包括阴性对照组和空白对照组, 所述阴性对照组为源自于正常人的生 物标本。
20. 根据权利要求 19所述的运用 ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶 IV抗体含量的方法, 其 特征在于: 所述待测生物标本的 OD45Qnm值对应的 (敏感性 +特异性)一 1为最大值时, 设置为 临界值, 标本 OD45Qnm值大于临界值时, 判定为过氧化物还原酶 IV抗体阳性, 标本 OD450nm 值小于或等于临界值时为阴性。
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NENP | Non-entry into the national phase |
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122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
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122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
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