WO2020105700A1 - 抗体コンジュゲート - Google Patents

抗体コンジュゲート

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WO2020105700A1
WO2020105700A1 PCT/JP2019/045589 JP2019045589W WO2020105700A1 WO 2020105700 A1 WO2020105700 A1 WO 2020105700A1 JP 2019045589 W JP2019045589 W JP 2019045589W WO 2020105700 A1 WO2020105700 A1 WO 2020105700A1
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WO
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antibody
tau protein
conjugate
epitope
antibody conjugate
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PCT/JP2019/045589
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ヘールト ヤネス
マルチネ ダウエ
雄一 石井
涼 岡田
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富士レビオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to antibody conjugates and the like.
  • AD Alzheimer's disease
  • PHF Paired Helical Filaments
  • tau protein including phosphorylated tau protein
  • the present inventors have found that when an individual anti-tau protein antibody is used by using an antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier in immunological measurement. As a result, they have found that the detection sensitivity of tau protein is improved, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the antibody conjugate of [2] which comprises a second antibody that recognizes an epitope existing between position 207.
  • Kit including the following: (I) an antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier; and (ii) an anti-tau protein antibody that recognizes an epitope different from the anti-tau protein antibody contained in the antibody conjugate.
  • a method for detecting tau protein which comprises detecting tau protein in a sample using an antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier.
  • the method of [9] wherein the sample is a body fluid sample collected from human.
  • the detection sensitivity of tau protein is improved in immunological measurement such as sandwich immunoassay as compared with the case of using individual anti-tau protein antibody. Detection of tau protein using the antibody conjugate of the present invention is useful for highly accurate diagnosis of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease.
  • CV coefficient of variation
  • the present invention provides an antibody conjugate (also referred to as “hybrid conjugate”) in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier.
  • the tau protein is preferably human tau protein.
  • Human tau protein contains multiple isoforms, and it is known that 4 to 6 isoforms are detected in the adult brain, and only one isoform is detected in the embryonic brain. This isoform diversity results from alternative mRNA splicing from a gene present on human chromosome 17. These isoforms differ from each other with or without the insertion of a 3 or 4 repeat domain in the C-terminal part and a region of 29 or 58 amino acid residues in the N-terminal part.
  • the amino acid number in the tau protein is represented herein as the amino acid number corresponding to the longest isoform (441 amino acids) shown in SEQ ID NO: 1.
  • Tau proteins include modified tau proteins. Examples of the modified tau protein include phosphorylated tau protein. Phosphorylated tau protein refers to tau protein in which hydroxyl group-containing amino acid residues (serine residue, threonine residue, tyrosine residue) are phosphorylated.
  • An anti-tau protein antibody is an antibody that recognizes at least part of the amino acid sequence of tau protein as an epitope.
  • the two or more anti-tau protein antibodies may be, for example, 2 to 5, preferably 2 to 4, more preferably 2 to 3, and particularly preferably 2 anti-tau protein antibodies. It is preferable that the two or more anti-tau protein antibodies each recognize non-overlapping epitopes in the tau protein.
  • the two or more anti-tau protein antibodies include a first antibody and a second antibody.
  • the epitope recognized by the first antibody is preferably between positions 153 and 169, more preferably between positions 155 and 167, and even more preferably between positions 157 and 165 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be an existing epitope, particularly preferably PPGQK (between positions 159 and 163, SEQ ID NO: 2).
  • the epitope recognized by the second antibody is preferably between positions 188 and 207, more preferably between positions 190 and 204, even more preferably between positions 192 and 201 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be an existing epitope, and particularly preferably DRSGYS (between positions 193 and 198, SEQ ID NO: 3).
  • the number of amino acid residues between the epitope recognized by the first antibody and the epitope recognized by the second antibody in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is, for example, 18 amino acids or more, preferably 20 amino acids or more, more preferably 22 amino acids or more. It may be even more preferably 24 amino acids or more, particularly preferably 26 amino acids or more.
  • the number of amino acid residues between the epitopes may be, for example, 44 amino acids or less, preferably 41 amino acids or less, more preferably 38 amino acids or less, even more preferably 35 amino acids or less, and particularly preferably 33 amino acids or less.
  • the number of amino acid residues between the epitopes is, for example, 18 to 44 amino acids, preferably 20 to 41 amino acids, more preferably 22 to 38 amino acids, even more preferably 24 to 35 amino acids, particularly preferably 26 amino acids. It may be up to 33 amino acids.
  • the epitope recognized by two or more anti-tau protein antibodies may be either an unmodified peptide or a modified peptide.
  • modified peptides include phosphorylated peptides.
  • the phosphorylated tau protein refers to a peptide in which a hydroxyl group-containing amino acid residue (serine residue, threonine residue, tyrosine residue) is phosphorylated.
  • the anti-tau protein antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the anti-tau protein antibody may be any isotype of immunoglobulin (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY).
  • the anti-tau protein antibody may also be a full length antibody.
  • a full-length antibody refers to an antibody that includes a heavy chain and a light chain that include a variable region and a constant region (eg, an antibody that includes two Fab and Fc portions).
  • the anti-tau protein antibody may also be an antibody fragment derived from such a full-length antibody.
  • the antibody fragment is a part of a full-length antibody, and examples thereof include constant region-deleted antibodies (eg, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv).
  • the anti-tau protein antibody may also be a modified antibody such as a single chain antibody.
  • the anti-tau protein antibody can be produced using a method known in the art.
  • an anti-tau protein antibody can be prepared using the above epitope as an antigen.
  • many anti-tau protein antibodies that recognize the above-mentioned epitopes are commercially available, such commercially available products can also be used.
  • the carrier may be a linker compound or a solid phase.
  • the linker compound refers to a compound capable of binding to a plurality of antibodies (eg, full-length antibody, antibody fragment).
  • the linker compound may be a linker compound that has the ability to bind to a label, a linker compound that is bound to a label, or a linker compound that is itself a label.
  • linker compound examples include maleimide, haloacetyl, isothiocyanate, sulfonyl chloride, N-hydroxysuccinimide, azide, polysaccharide (eg, dextran), peptide, polypeptide, protein (eg, bovine serum albumin (BSA)), nucleic acid (DNA, RNA), and polyethylene glycol.
  • solid phase examples include a solid phase that can be suspended or dispersed in a liquid phase (eg, solid phase carriers such as particles and beads), and a solid phase that can contain or mount the liquid phase (eg, plate, membrane, Supports such as test tubes, and well plates, microchannels, glass capillaries, nanopillars, containers such as monolith columns) can be mentioned.
  • the solid phase for the carrier is preferably a solid phase that can be suspended or dispersed in the liquid phase.
  • solid phase materials include glass, silica, polymer compounds (eg, polystyrene, plastic), metals, and carbon.
  • a non-magnetic material or a magnetic material can also be used as the material of the solid phase.
  • a conventionally known method can be used as a method of binding the antibody to the linker compound.
  • a conventionally known method include a physical adsorption method, a covalent bond method, a method using an affinity substance (eg, biotin, streptavidin), and an ionic bond method.
  • an affinity substance eg, biotin, streptavidin
  • an ionic bond method e.g, an ionic bond method.
  • the covalent bond method for example, the periodate method, the glutaraldehyde method, the maleimide method, or the N-hydroxysuccinimide method can be used to covalently bond the antibody to the linker compound.
  • the same method as the method for binding the antibody to the linker compound can be used as the method for binding the antibody to the linker compound.
  • the antibody conjugate of the present invention may include a label.
  • the carrier may be a labeled carrier, or the antibody may be bound to the label, or both.
  • the labeled carrier means a carrier bound to the label or a carrier which is itself a label.
  • an enzyme eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase
  • an affinity substance eg, one of streptavidin and biotin, a nucleic acid having a sense strand and an antisense strand complementary to each other
  • a fluorescent substance eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein
  • a luminescent substance eg, luciferin, aequorin, acridinium ester, tris (2,2′-bipyridyl) ruthenium
  • radioactive materials eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I
  • colloidal gold eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I
  • the carrier bound to the label may be, for example, particles or beads (eg, fluorescent beads) containing a fluorescent substance therein.
  • the material for the particles and beads the same material as the solid phase for the carrier can be used.
  • the carrier which is itself a label includes, for example, an enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), an affinity substance (eg, streptavidin and biotin, a sense strand and an antisense strand complementary to each other).
  • the antibody conjugate containing the label may be produced by binding the label to the antibody conjugate, or may be produced by attaching the antibody to the label carrier.
  • a conventionally known method can be used as the coupling method.
  • the antibody conjugate of the present invention can be used for detection of tau protein by immunoassay.
  • immunoassays include, for example, direct competition method, indirect competition method, sandwich method, Western blotting method, and immunohistochemical staining method.
  • Such an immunoassay may preferably be a sandwich method.
  • immunoassays include chemiluminescent immunoassay (CLIA) (eg, chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)), immunoturbidimetric assay (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competitive ELISA).
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • TIA immunoturbidimetric assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • the antibody conjugate of the present invention may be used as a detection antibody or a capture antibody, preferably a detection antibody.
  • a detection antibody tau protein can be detected by binding a label to the antibody conjugate and detecting the label bound to the antibody conjugate.
  • tau protein can be detected by detecting the label in the antibody conjugate bound to tau protein.
  • the detection of the label can be performed based on a method appropriately selected from known methods according to the type of the label.
  • the label can be detected by detecting the enzyme activity using a signal-generating substrate (eg, fluorescent substrate, luminescent substrate, chromogenic substrate).
  • a signal-generating substrate eg, fluorescent substrate, luminescent substrate, chromogenic substrate.
  • the label is an affinity substance
  • the enzyme or signal-generating substance capable of binding to such an affinity substance may be an enzyme or signal-generating substance bound to a substance capable of binding to the affinity substance.
  • the label is a fluorescent substance, a luminescent substance, or a radioactive substance
  • the label can be detected by detecting the signal generated from these labels.
  • the antibody conjugate of the present invention may be provided in the form of a composition (eg, solution).
  • the antibody conjugate of the present invention may be provided in the form of a device (eg, a form in which the antibody conjugate is contained in the device).
  • the invention also provides a kit, including: (I) an antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier; and (ii) an anti-tau protein antibody that recognizes an epitope different from the anti-tau protein antibody contained in the antibody conjugate.
  • an epitope recognized by an “anti-tau protein antibody that recognizes an epitope different from the anti-tau protein antibody included in the antibody conjugate” (hereinafter, referred to as “another anti-tau protein antibody”) (hereinafter, “another epitope”) May be an epitope that does not overlap with the epitope recognized by the anti-tau protein antibody contained in the antibody conjugate, and is preferably between position 170 and position 187 or position 209 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • PPAPKTP between positions 176 and 182, preferably T is a phosphorylated threonine residue, SEQ ID NO: 4
  • PPTREPK between positions 218 and 224, SEQ ID NO: 5
  • Another epitope may be either an unmodified peptide or a modified peptide. Examples of the modified peptide include those mentioned above. Examples of the modified amino acid residue in another epitope include phosphorylated threonine at position 181 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the kit of the present invention can be used for detection of modified tau protein.
  • Another anti-tau protein antibody may be immobilized on the solid phase.
  • the method of immobilizing (binding) the antibody to the solid phase the same method as the method of binding the antibody to the linker compound described above can be used.
  • the kit of the present invention can be used in an immunoassay for tau protein.
  • an immunoassay include the methods described above, and the sandwich method is preferable.
  • the sandwich method preferably the antibody conjugate and another anti-tau protein antibody may be used as the detection antibody and the capture antibody, respectively.
  • the kit of the present invention comprises (i) an antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier (antibody conjugate); and (ii) another anti-tau protein antibody contained in the antibody conjugate. It is preferable to include an anti-tau protein antibody that recognizes the epitope (another anti-tau protein antibody) in a form isolated from each other.
  • the antibody conjugate and another anti-tau protein antibody may be housed in different containers (eg, tubes, plates).
  • the antibody conjugate and another anti-tau protein antibody may be provided in the form of a composition (eg, solution).
  • the kit of the invention may be provided in the form of a device.
  • all of its components may be housed in the device.
  • some of the components may be contained in the device, and the rest may not necessarily be contained in the device (eg, in a form of different containers).
  • components not housed in the device may be injected into the device upon detection of tau protein.
  • the kit of the present invention may have a configuration depending on the type of immunoassay to be adopted.
  • the kit of the present invention may include a label, a diluent (buffer), a substrate that reacts with the label, and a tau protein preparation as optional components.
  • the antibody conjugate or another anti-tau protein antibody may be immobilized on magnetic particles.
  • Specific examples of the constitution of the kit of the present invention include an antibody conjugate containing a labeled carrier, another anti-tau protein antibody immobilized on a solid phase (eg, magnetic particles, support, container), a substrate that reacts with a label, And tau protein preparation.
  • the present invention also provides a method for detecting tau protein.
  • the method of the invention comprises detecting tau protein in a sample using an antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier.
  • the "antibody conjugate in which two or more anti-tau protein antibodies are bound to a carrier" is as described above.
  • Detection of tau protein in a sample may be performed by immunoassay.
  • immunoassay examples include those described above, and the sandwich method is preferable.
  • the antibody conjugate may be used as a detection antibody or a capture antibody, and preferably as a detection antibody.
  • Detection of tau protein can be performed, for example, by treating the sample with an antibody conjugate to bind the antibody conjugate to tau protein in the sample (eg, contacting the sample with the antibody conjugate), and binding to tau protein. It may be performed by the step of detecting the antibody conjugate.
  • the detection of tau protein may further include the step of removing the antibody conjugate not bound to tau protein (eg, washing step).
  • the detection of the antibody conjugate bound to the tau protein may be performed by the step of binding the label to the antibody conjugate and the step of detecting the label bound to the antibody conjugate.
  • detection of the antibody conjugate bound to tau protein may be performed by detecting the label in the antibody conjugate.
  • the method of the present invention may further comprise contacting the sample with an anti-tau protein antibody that recognizes an epitope different from the anti-tau protein antibody contained in the antibody conjugate (“another anti-tau protein antibody”).
  • another anti-tau protein antibody is as described above.
  • the detection of tau protein is performed, for example, by treating the sample with another anti-tau protein antibody to bind (capture) tau protein in the sample to another anti-tau protein antibody (eg, when the sample is different from the sample).
  • Detection of tau protein can be accomplished by removing free tau protein or another anti-tau protein antibody (B / F separation or washing step), or removing antibody conjugate not bound to tau protein (eg, washing). Step), or both steps may be further included. Detection of antibody conjugate bound to tau protein is as described above.
  • the sample may be, for example, a liquid sample (eg, body fluid, standard sample), a tissue sample, or a blotting sample.
  • the sample may be a body fluid sample taken from a human.
  • the body fluid sample includes, for example, a blood sample (eg, whole blood, plasma, serum), cerebrospinal fluid, urine, and saliva, and preferably cerebrospinal fluid, plasma, or serum.
  • Examples of the detection of tau protein include evaluation of the presence or absence or amount of tau protein, evaluation of the presence or absence or amount of modified tau protein (eg, phosphorylated tau protein), modification of tau protein (eg, phosphorus The degree of oxidation) is evaluated. Based on the evaluation of these tau proteins, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease can be diagnosed. Diagnosis of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease based on the evaluation of tau protein can be carried out based on a known method (eg, Japanese Patent Publication Nos. 8-502898 and 9-506771).
  • Example 1 Preparation of Alkaline Phosphatase-Labeled Hybrid Conjugate Monoclonal antibody BT2 (epitope: DRSGYS (SEQ ID NO: 3), Fujirebio Europe Ltd.) specifically recognizing tau protein and pepsin in citrate buffer (pH 3.5). ), And incubated for 1 hour at 37 ° C. for pepsin digestion. After stopping the reaction, gel filtration purification was performed using a Superdex200 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) to obtain an F (ab ′) 2 fragment. Next, the concentration of the purified F (ab ′) 2 fragment was determined and, if necessary, adjusted to a concentration of 2.5 mg / mL.
  • Bromelain was mixed with a monoclonal antibody HT7 (epitope: PPGQK (SEQ ID NO: 2), Fujirebio Europe Ltd.) specifically recognizing tau protein, and incubated at 37 ° C. for 1 hour to perform bromelain digestion. After stopping the reaction, gel filtration purification was performed to obtain an F (ab ′) 2 fragment. Next, the concentration of the purified F (ab ′) 2 fragment was determined and, if necessary, adjusted to a concentration of 2.5 mg / mL.
  • HT7 epitopope: PPGQK (SEQ ID NO: 2), Fujirebio Europe Ltd.
  • alkaline phosphatase ALP
  • GMBS N- (4-maleimidobutyryloxy) -succinimide
  • the resulting conjugate reaction mixture was desalted and purified, and then added to a HiLoad Superdex200 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) to purify the antibody by gel filtration.
  • a HiLoad Superdex200 column manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • fractions in which two or more Fab's were bound to one ALP were pooled and used as a hybrid conjugate.
  • 0.1 mg / mL in 0.1 M MES buffer (1 mM MgCl 2 , 0.1 mM ZnCl 2 , 0.1% NaN 3 , 0.1% BSA, pH 6.8).
  • the concentration was adjusted to
  • Comparative Example 1 Preparation of alkaline phosphatase-labeled single monoclonal antibody Monoclonal antibody BT2 and pepsin were mixed in a citrate buffer (pH 3.5) and incubated at 37 ° C for 1 hour to perform pepsin digestion. After stopping the reaction, gel filtration purification was performed using a Superdex200 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) to obtain an F (ab ′) 2 fragment. Next, the concentration of the purified F (ab ′) 2 fragment was determined and, if necessary, adjusted to a concentration of 2.5 mg / mL. The resulting BT2 F (ab ′) 2 fragment was incubated with 2-MEA hydrochloride at 37 ° C. for 90 minutes and reduced to give the BT2 Fab ′ fragment.
  • ALP alkaline phosphatase
  • GMBS N- (4-maleimidobutyryloxy) -succinimide
  • the resulting ALP-labeled BT2 Fab 'fragment was subjected to gel filtration purification using a Superdex200 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience). Of the multiple peaks at the absorbance of 280 nm of the obtained fraction, the fraction in which two or more Fab's were bound to one ALP was divided into two groups, a low molecular weight side and a high molecular weight side, and pooled. The low molecular weight fraction was used as the first ALP-labeled BT2 Fab 'fragment (1: X), and the high molecular weight fraction was used as the second ALP-labeled BT2 Fab' fragment (1: XX).
  • each ALP-labeled BT2 Fab ′ fragment was purified in 0.1 M MES buffer (1 mM MgCl 2 , 0.1 mM ZnCl 2 , 0.1% NaN 3 , 0.1% BSA, pH 6.8). The concentration was adjusted to 0.05 mg / mL.
  • the first and second ALP-labeled HT7 Fab 'fragments were prepared similarly to the first and second ALP-labeled BT2 Fab' fragments.
  • the first ALP-labeled BT2 Fab 'fragment solution prepared above and the first ALP-labeled HT7 Fab' fragment solution were mixed at a volume ratio of 1: 1 to obtain a first ALP-labeled Fab 'fragment mixture. It was In addition, the second ALP-labeled BT2 Fab 'fragment solution prepared above and the second ALP-labeled HT7 Fab' fragment solution were mixed at a volume ratio of 1: 1 to give a second ALP-labeled Fab 'fragment mixture.
  • Example 2 Preparation of antibody-bound magnetic particles
  • a mouse monoclonal antibody AT270 epitopope: PPAPKT (p) P (SEQ ID NO: 4)
  • T (p) represents a phosphorylated threonine residue
  • a mouse monoclonal antibody AT120 epitopope: PPTREPK (SEQ ID NO: 5)
  • EDC ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • AT270-bonded magnetic particles were collected with a magnet and separated from the reaction solution, and the particles were washed with 50 mM Tris buffer (0.15M NaCl, containing 3% BSA, pH 7.2) to remove AT270-bound magnetic particles. Obtained.
  • the obtained AT270-bonded magnetic particles were suspended in a 50 mM MOPS buffer to a concentration of 0.25 mg / mL to obtain an AT270-bonded magnetic particle liquid.
  • AT120-bonded magnetic particles were also prepared in the same manner as AT270-bonded magnetic particles.
  • Example 3 Measurement of phosphorylated tau peptide A phosphorylated tau peptide antigen in which the 181th threonine of tau protein is phosphorylated is diluted with 100 mM Tris buffer, and each concentration is 0, 4.5, 9. , Phosphorylated tau standard solution was prepared so as to have a concentration of 18, 36, 72, 150 pM. 150 ⁇ L of the AT270-bonded magnetic particle solution prepared in Example 2 and 100 ⁇ L of the diluted phosphorylated tau standard solution were dispensed into a reaction tank, and after stirring, they were incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Then, B / F separation and washing were performed.
  • a "Lumipulse G (registered trademark)" exclusive cleaning liquid (Lumipulse G Wash Solution, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.) was used. After washing, 250 ⁇ L of a solution prepared by diluting the hybrid conjugate prepared in Example 1 with a 50 mM MOPS buffer (containing 1% BSA, pH 6.8) to 0.2 ⁇ g / mL was dispensed into a reaction tank, and the mixture was incubated at 37 ° C. And incubated for 10 minutes. Then, B / F separation and washing were performed.
  • MOPS buffer containing 1% BSA, pH 6.8
  • a chemiluminescent substrate 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 "-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt (AMPPD)
  • AMPPD phenyl-1,2-dioxetane disodium salt
  • a substrate solution Lipulse G Substrate Solution, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.
  • 200 ⁇ L was dispensed, stirred and reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and the luminescence amount was measured by a luminometer to obtain a count value.
  • the actual measurement was performed using a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system "Lumipulse G" (manufactured by Fujirebio).
  • the ALP-labeled single antibody (first ALP-labeled Fab ′ fragment mixture and second ALP-labeled Fab ′ fragment mixture) prepared in Comparative Example 1 was used in the same manner as the standard instead of the hybrid conjugate solution. The solution was measured and the count value was obtained.
  • the results are shown in Table 1.
  • the count value of each phosphorylated tau standard solution is shown as an average value of the count values measured in duplicate. Further, the ratio (S / N ratio) of the count value at 4.5 pM to the count value at 0 pM was obtained.
  • the first ALP-labeled Fab 'fragment mixture produced low counts.
  • the second ALP-labeled Fab 'fragment mixture produced similar count values as the hybrid conjugate only in the high concentration standard solution. On the other hand, only the hybrid conjugate showed a very high count value even for the low-concentration standard solution.
  • the ratio (S / N ratio) of the count value of the lowest standard solution (4.5 pM) to the count value of the blank (0 pM) was found to be the ALP-labeled Fab ′ fragment mixture (ALP) when the hybrid conjugate was used. It was revealed that it was about 6 times higher than that when the labeled single antibody) was used.
  • a high S / N ratio is an important factor for obtaining a stable assay system and high sensitivity, and it has been shown that a highly sensitive and stable assay system can be constructed by using a hybrid conjugate. It was
  • Example 4 Measurement of total tau protein 150 ⁇ L of the AT120-bound magnetic particle solution prepared in Example 2 and a calibrator reagent for measuring total tau protein (“LUMIPULSE G Total Tau Calibrators set”, manufactured by Fujirebio Inc.) or the calibrator reagent.
  • a calibrator reagent for measuring total tau protein (“LUMIPULSE G Total Tau Calibrators set”, manufactured by Fujirebio Inc.) or the calibrator reagent.
  • 50 mM Tris buffer to prepare 75 ⁇ L of a tau protein standard solution
  • 50 ⁇ L of a solution prepared by diluting the hybrid conjugate prepared in Example 1 to 0.2 ⁇ g / mL with 50 mM Tris buffer was added to a reaction tank.
  • the mixture was aliquoted, stirred and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. Then, B / F separation and washing were performed.
  • biotinylated monoclonal antibody BT2 manufactured by Fujirebio Europe
  • biotinylated monoclonal antibody HT7 manufactured by Fujirebio Europe
  • streptavidin-labeled ALP streptavidin-labeled ALP
  • Table 2 shows the measured count value, S / N ratio, and LoQ (quantification limit value) determined by both assay systems.
  • the count value of each standard solution (CAL) is shown as an average value of the count values obtained by measuring the standard solution in duplicate.
  • the S / N ratio was determined as the ratio of the count value of 600 pg / mL to the count value of the blank (0 pg / mL).
  • the count value of 600 pg / mL was calculated from the count value of the standard solution.
  • FIG. 1 hybrid conjugate
  • FIG. 2 antibody mixture
  • FIG. 1 shows the concentration of each sample (LoQ1 to LoQ5) calculated based on the standard curve prepared from the average count value and concentration of each standard solution, and the concentration of each sample (LoQ1).
  • the coefficient of variation (CV) of the count value when n 10 is measured for (-LoQ5).
  • LoQ CV 20% was determined for both assay systems based on the accuracy profile.
  • the use of hybrid conjugates produced much higher counts than the mixture of each labeled antibody, and the S / N ratio was also higher for the hybrid conjugate than for each labeled antibody mixture. It increased about 6 times. Furthermore, the LoQ using the hybrid conjugate was about 1/10 of the LoQ using the mixture of each labeled antibody. Therefore, it was found that low concentrations of total tau protein can be quantified by using the hybrid conjugate.
  • Example 5 Preparation of bovine serum albumin (BSA) linker hybrid conjugate 1
  • BSA bovine serum albumin
  • GMBS bovine serum albumin
  • BSA and GMBS were mixed at a molar ratio of 1:10 and incubated at 30 ° C. for 1 hour to carry out maleimidization of BSA.
  • the mixture of Fab ′ fragment of BT2 and Fab ′ fragment of HT7 obtained in Example 1 and maleimidated BSA were mixed at a molar ratio of 2: 1 and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • Coupling was performed. The coupling reaction was stopped by adding 2-MEA hydrochloride and further incubated for 30 minutes at 25 ° C. The reaction was then quenched by adding 0.5 M iodoacetamide and incubating at 25 ° C. for 30 minutes to give a conjugate reaction mixture.
  • the obtained conjugate reaction mixture was added to a HiLoad Superdex200 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) equilibrated with a phosphate buffer (pH 6.8), and gel filtration purification of the antibody was performed. Of the multiple peaks at the absorbance of 280 nm of the obtained fractions, the fractions in which two or more Fab's were bound to one BSA were pooled to obtain a BSA linker hybrid conjugate.
  • the BSA linker hybrid conjugate thus obtained and NHS-PEG4-Bition were mixed at a molar ratio of 1:30 and incubated at 25 ° C for 45 minutes to biotinate the BSA linker hybrid conjugate. Further desalting treatment was performed to obtain biotinylated BSA linker hybrid conjugate 1. Furthermore, it was diluted to 0.4 ⁇ g / mL in 50 mM MOPS buffer (150 mM sodium chloride, 1.0% BSA, pH 6.8), and alkaline phosphatase-labeled streptavidin (ALP-SA) (Streptavidin, Alkaline Phosphate Conjugate, Invitrogen) was added. Was added at a concentration of 0.4 ⁇ g / mL to obtain a reaction solution containing the BSA linker hybrid conjugate 1 labeled with ALP (hybrid conjugate reaction solution 1).
  • ALP-SA alkaline phosphatase-labeled streptavidin
  • Example 6 Preparation of BSA linker hybrid conjugate 2 2-MEA hydrochloride was added to BSA and incubated (37 ° C. for 60 minutes) for reduction (thiolation). Further desalting treatment was performed to obtain thiolated BSA. Further, thiolated BSA and NHS-PEG4-Bition (made by Thermo Fisher) have a molar ratio of 1:25, and thiolated BSA and 1,2-bis (maleimide) ethane (made by Tokyo Kasei Kogyo) have a molar ratio of 1: 350. Were mixed and incubated at 30 ° C. for 1 hour, and BSA was biotinylated and maleimidated at the same time.
  • the mixture of the Fab ′ fragment of BT2 and the Fab ′ fragment of HT7 obtained in Example 1 was mixed with biotinylated maleimidated BSA at a molar ratio of 2: 1 and incubated at 25 ° C. for 1 hour. Then, coupling was performed. The coupling reaction was stopped by adding 2-MEA hydrochloride and further incubated for 30 minutes at 25 ° C. Then, the reaction was quenched by adding 0.5 M iodoacetamide and incubating at 25 ° C. for 30 minutes to obtain biotinylated BSA linker hybrid conjugate 2.
  • the obtained biotinylated BSA linker hybrid conjugate 2 was diluted to 0.2 ⁇ g / mL in 50 mM MOPS buffer (150 mM sodium chloride, 1.0% BSA, pH 6.8), and ALP-SA (Streptavidin, Alkaline Phosphatase Conjugate) was diluted. , Invitrogen) was added at a concentration of 0.4 ⁇ g / mL to obtain a reaction solution containing the BSA linker hybrid conjugate 2 labeled with ALP (hybrid conjugate reaction solution 2).
  • Comparative Example 2 Preparation of BSA Linker Single Monoclonal Antibody Monoclonal antibody BT2 and pepsin were mixed in a citrate buffer (pH 3.5) and incubated at 37 ° C for 1 hour to perform pepsin digestion. After stopping the reaction, gel filtration purification was performed using a Superdex200 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) to obtain an F (ab ′) 2 fragment. Next, the concentration of the purified F (ab ′) 2 fragment was determined and, if necessary, adjusted to a concentration of 2.5 mg / mL. The resulting BT2 F (ab ′) 2 fragment was incubated with 2-MEA hydrochloride at 37 ° C. for 90 minutes and reduced to give the BT2 Fab ′ fragment.
  • the BSA linker BT2 Fab 'fragment and the BSA linker HT7 Fab' fragment obtained were diluted with 50 ⁇ M MOPS buffer (150 mM sodium chloride, 1.0% BSA, pH 6.8) at 0.2 ⁇ g / mL each, and ALP-SA was added. (Streptavidin, Alkaline Phosphatase Conjugate, Invitrogen) was added at a concentration of 0.4 ⁇ g / mL, and a mixture of ALP-labeled BSA linker BT2 Fab 'fragment and ALP-labeled BSA linker BT2 Fab' fragment (mixed conjugate reaction solution).
  • Example 7 Measurement of phosphorylated tau peptide
  • a phosphorylated tau peptide antigen in which the 181th threonine of tau protein is phosphorylated is diluted with 100 mM Tris buffer, and each concentration is 0, 40, 100, 200.
  • a phosphorylated tau standard solution was prepared so as to have a concentration of 400 pg / mL.
  • 150 ⁇ L of the AT270-bonded magnetic particle solution prepared in Example 2 and 30 ⁇ L of the diluted phosphorylated tau standard solution were dispensed into a reaction tank, and after stirring, they were incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Then, B / F separation and washing were performed.
  • a "Lumipulse G (registered trademark)" exclusive cleaning liquid (Lumipulse G Wash Solution, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.) was used. After washing, 250 ⁇ L of the hybrid conjugate reaction solution 1 prepared in Example 5 or the hybrid conjugate reaction solution 2 prepared in Example 6 was dispensed into the reaction tank and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Then, B / F separation and washing were performed. After washing, 200 ⁇ L of a substrate solution (Lumipulse G Substrate Solution, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.) containing AMPPD was dispensed into the reaction tank, and after stirring, the mixture was reacted at 37 ° C.
  • a substrate solution Lipulse G Substrate Solution, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.
  • the standard solution was similarly measured using the mixed conjugate reaction solution prepared in Comparative Example 2 instead of the hybrid conjugate reaction solution, and the count value was obtained.
  • the results are shown in Table 3.
  • the count value of each phosphorylated tau standard solution is shown as an average value of the count values measured in duplicate. Further, the ratio (S / N ratio) of the count value at 40 pg / mL to the count value at 0 pg / mL was obtained. As a result, a low count was generated when the mixed conjugate reaction solution was used. On the other hand, when the hybrid conjugate reaction solution 1 and the hybrid conjugate reaction solution 2 were used, a very high count value was shown even for the low-concentration standard solution.
  • the ratio (S / N ratio) of the count value of the lowest standard solution (40 pg / mL) to the count value of the blank (0 pg / mL) was the same when the hybrid conjugate reaction solution 1 was used. It is about 9 times higher than when using the reaction solution (mixture of ALP-labeled single antibodies), and when using the hybrid conjugate reaction solution 2, it is about 13 times higher than when using the mixed conjugate reaction solution. It became clear that it was twice as expensive.
  • a high S / N ratio is an important factor for obtaining a stable assay system and high sensitivity, and it has been shown that a highly sensitive and stable assay system can be constructed by using a hybrid conjugate. It was

Abstract

本発明は、タウタンパク質の免疫学的測定において感度を向上させる技術を提供する。具体的には、本発明は、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートなどを提供する。

Description

抗体コンジュゲート
　本発明は、抗体コンジュゲートなどに関する。
　アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的な認知症の一つであり、大脳皮質や大脳辺縁系にわたる神経細胞内の神経原線維変化、および細胞外のアミロイド班の蓄積によって組織学的に特徴づけられる神経変性疾患である。神経原線維変化の超微形態は、主に異常リン酸化されたタウタンパク質（ｐＴａｕ）からなるＰａｉｒｅｄ　Ｈｅｌｉｃａｌ　Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦ）で構成される。タウタンパク質（リン酸化タウタンパク質を含む）のアルツハイマー病等の神経変性疾患の診断マーカーとしての有用性、および体液中のタウタンパク質の免疫学的測定方法が、報告されている（特許文献１および２）。
特表平８－５０２８９８号公報 特表平９－５０６７７１号公報
　体液等のサンプル中のタウタンパク質の免疫学的測定において、従来よりもさらに感度を向上させることが求められている。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、免疫学的測定において、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いることにより、個別の抗タウタンパク質抗体を用いた場合に比してタウタンパク質の検出感度が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート。
〔２〕前記２種以上の抗タウタンパク質抗体が、２種以上の抗ヒトタウタンパク質抗体である、〔１〕の抗体コンジュゲート。
〔３〕２種以上の抗タウタンパク質抗体が、配列番号１のアミノ酸配列において１５３位～１６９位の間に存在するエピトープを認識する第１の抗体、および配列番号１のアミノ酸配列において１８８位～２０７位の間に存在するエピトープを認識する第２の抗体を含む、〔２〕の抗体コンジュゲート。
〔４〕前記第１の抗体が認識するエピトープが、ＰＰＧＱＫ（配列番号２）であり、前記第２の抗体が認識するエピトープが、ＤＲＳＧＹＳ（配列番号３）である、〔３〕の抗体コンジュゲート。
〔５〕担体が、標識担体である、〔１〕～〔４〕のいずれかの抗体コンジュゲート。
〔６〕以下を含む、キット：
（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート；および
（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
〔７〕前記別のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列において１７０位～１８７位の間または２０９位～２３３位の間に存在するエピトープである、〔６〕のキット。
〔８〕前記別のエピトープが、ＰＰＡＰＫＴＰ（配列番号４）またはＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号５）である、〔７〕のキット。
〔９〕２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む、タウタンパク質の検出方法。
〔１０〕サンプルが、ヒトから採取された体液サンプルである、〔９〕の方法。
〔１１〕抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体にサンプルを接触させることをさらに含む、〔９〕または〔１０〕の方法。
　本発明の抗体コンジュゲートを用いることにより、サンドイッチイムノアッセイ等の免疫学的測定において、個別の抗タウタンパク質抗体を用いた場合に比してタウタンパク質の検出感度が向上する。本発明の抗体コンジュゲートを用いたタウタンパク質の検出は、アルツハイマー病等の神経変性疾患の高精度な診断に有用である。
図１は、ハイブリッドコンジュゲートを用いた総タウタンパク質の測定における、各標準溶液の平均カウント値と濃度から作成した標準曲線に基づいて算出した各サンプル（ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）の濃度と、各サンプル（ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）を１０回（ｎ＝１０）測定した際のカウント値の変動係数（ＣＶ）をプロットしたグラフ、および精度プロファイル（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ）に基づいて求めた定量限界値（ＬｏＱ（ＣＶ２０％））を示す図である。 図２は、抗体混合物を用いた総タウタンパク質の測定における、各標準溶液の平均カウント値と濃度から作成した標準曲線に基づいて算出した各サンプル（ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）の濃度と、各サンプル（ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）を１０回（ｎ＝１０）測定した際のカウント値の変動係数（ＣＶ）をプロットしたグラフ、および精度プロファイルに基づいて求めた定量限界値（ＬｏＱ（ＣＶ２０％））を示す図である。
　本発明は、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート（「ハイブリッドコンジュゲート」とも呼ぶ）を提供する。
　タウタンパク質は、ヒトタウタンパク質が好ましい。ヒトタウタンパク質は、複数のアイソフォームを含み、４～６つのアイソフォームが成人脳で検出され、胎生期の脳では１つのアイソフォームのみが検出されることが知られている。このアイソフォームの多様性は、ヒト第１７番染色体に存在する一遺伝子からの選択的ｍＲＮＡスプライシングにより生じる。これらのアイソフォームは、Ｃ末端部分における３つまたは４つのリピートドメインと、Ｎ末端部分における２９個または５８個のアミノ酸残基からなる領域の挿入の有無において、互いに異なる。本明細書では、タウタンパク質におけるアミノ酸番号を、配列番号１に示す最も長いアイソフォーム（４４１アミノ酸）に対応するアミノ酸番号として表す。タウタンパク質には、修飾タウタンパク質を含む。修飾タウタンパク質としては、例えば、リン酸化タウタンパク質が挙げられる。リン酸化タウタンパク質とは、水酸基含有アミノ酸残基（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基）がリン酸化されたタウタンパク質をいう。
　抗タウタンパク質抗体は、タウタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。２種以上の抗タウタンパク質抗体は、例えば２～５種、好ましくは２～４種、より好ましくは２～３種、特に好ましくは２種の抗タウタンパク質抗体であってもよい。２種以上の抗タウタンパク質抗体は、それぞれタウタンパク質中の重複しないエピトープを認識することが好ましい。
　２種以上の抗タウタンパク質抗体は、第１の抗体および第２の抗体を含む。第１の抗体が認識するエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列において好ましくは１５３位～１６９位の間、より好ましくは１５５位～１６７位の間、さらにより好ましくは１５７位～１６５位の間に存在するエピトープであってもよく、特に好ましくはＰＰＧＱＫ（１５９位～１６３位の間、配列番号２）であってもよい。第２の抗体が認識するエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列において好ましくは１８８位～２０７位の間、より好ましくは１９０位～２０４位の間、さらにより好ましくは１９２位～２０１位の間に存在するエピトープであってもよく、特に好ましくはＤＲＳＧＹＳ（１９３位～１９８位の間、配列番号３）であってもよい。
　配列番号１のアミノ酸配列における第１の抗体が認識するエピトープと第２の抗体が認識するエピトープと間のアミノ酸残基数は、例えば１８アミノ酸以上、好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは２２アミノ酸以上、さらにより好ましくは２４アミノ酸以上、特に好ましくは２６アミノ酸以上であってもよい。前記エピトープ間のアミノ酸残基数は、例えば４４アミノ酸以下、好ましくは４１アミノ酸以下、より好ましくは３８アミノ酸以下、さらにより好ましくは３５アミノ酸以下、特に好ましくは３３アミノ酸以下であってもよい。より具体的には、前記エピトープ間のアミノ酸残基数は、例えば１８～４４アミノ酸、好ましくは２０～４１アミノ酸、より好ましくは２２～３８アミノ酸、さらにより好ましくは２４～３５アミノ酸、特に好ましくは２６～３３アミノ酸であってもよい。
　２種以上の抗タウタンパク質抗体が認識するエピトープは、非修飾ペプチドまたは修飾ペプチドのいずれであってもよい。修飾ペプチドとしては、例えば、リン酸化ペプチドが挙げられる。リン酸化タウタンパク質とは、水酸基含有アミノ酸残基（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基）がリン酸化されたペプチドをいう。
　抗タウタンパク質抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗タウタンパク質抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。抗タウタンパク質抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。抗タウタンパク質抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。抗タウタンパク質抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
　抗タウタンパク質抗体は、従前公知の方法を用いて作製することができる。例えば、抗タウタンパク質抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識する多数の抗タウタンパク質抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。
　担体は、リンカー化合物または固相であってもよい。リンカー化合物とは、複数の抗体（例、全長抗体、抗体断片）と結合する能力を有する化合物をいう。リンカー化合物は、標識と結合する能力を有するリンカー化合物、標識と結合したリンカー化合物、またはそれ自体が標識であるリンカー化合物であってもよい。リンカー化合物としては、例えば、マレイミド、ハロアセチル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アジド、多糖類（例、デキストラン）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、およびポリエチレングリコールが挙げられる。固相としては、例えば、液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子、ビーズ等の固相担体）、ならびに液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、およびウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）が挙げられる。担体のための固相は、液相中に懸濁または分散可能な固相が好ましい。固相の材料としては、例えば、ガラス、シリカ、高分子化合物（例、ポリスチレン、プラスチック）、金属、およびカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、または磁性材料を用いることができる。
　抗体のリンカー化合物への結合方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、およびイオン結合法が挙げられる。共有結合法を利用する場合、例えば、過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド法を用いて、抗体をリンカー化合物に共有結合させることができる。抗体の固相への結合方法としては、抗体のリンカー化合物への結合方法と同様の方法を利用することができる。
　本発明の抗体コンジュゲートは、標識を含んでいてもよい。本発明の抗体コンジュゲートが標識を含む場合、担体が標識担体であってもよく、または、抗体が標識と結合していてもよく、あるいは、これらの両方の場合であってもよい。標識担体とは、標識と結合した担体、またはそれ自体が標識である担体をいう。標識としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）、および金コロイドが挙げられる。標識と結合した担体は、例えば、蛍光物質を内部に含む粒子またはビーズ（例、蛍光ビーズ）であってもよい。粒子およびビーズの材料としては、担体のための固相と同様の材料を用いることができる。それ自体が標識である担体としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、および金コロイドが挙げられる。標識を含む抗体コンジュゲートは、標識を抗体コンジュゲートに結合させることにより作製してもよく、抗体を標識担体に結合させることにより作製してもよい。これらの結合方法としては、従前公知の方法を利用することができる。
　本発明の抗体コンジュゲートは、イムノアッセイによるタウタンパク質の検出に用いることができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法、ウエスタンブロット法、および免疫組織化学的染色法が挙げられる。このようなイムノアッセイは、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ））、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法が挙げられる。サンドイッチ法において、本発明の抗体コンジュゲートは、検出抗体または捕捉抗体として用いてもよく、好ましくは検出抗体として用いてもよい。本発明の抗体コンジュゲートを検出抗体として用いる場合、標識を抗体コンジュゲートに結合させ、抗体コンジュゲートに結合した標識を検出することによりタウタンパク質を検出することができる。あるいは、担体が標識担体である抗体コンジュゲートを検出抗体として用いる場合、タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲート中の標識を検出することによりタウタンパク質を検出することができる。
　標識の検出は、標識の種類に応じて公知の手法から適宜選択した手法に基づいて行うことができる。標識が酵素である場合、シグナル発生基質（例、蛍光基質、発光基質、発色基質）を用いて酵素活性を検出することにより、標識を検出することができる。標識が親和性物質である場合、親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質を用いて、親和性物質に結合した酵素またはシグナル発生物質を検出することにより、標識を検出することができる。そのような親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質は、親和性物質と結合する能力を有する物質を結合した酵素またはシグナル発生物質であってもよい。標識が蛍光物質、発光物質、または放射性物質である場合、これらの標識から発生するシグナルを検出することにより、標識を検出することができる。
　本発明の抗体コンジュゲートは、組成物の形態（例、溶液）で提供されてもよい。あるいは、本発明の抗体コンジュゲートは、デバイスの形態（例、抗体コンジュゲートがデバイス中に収容された形態）で提供されてもよい。
　本発明はまた、以下を含む、キットを提供する：
（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート；および
（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
　「２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート」は、上述したとおりである。
　「抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体」（以下、「別の抗タウタンパク質抗体」と呼ぶ）が認識するエピトープ（以下、「別のエピトープ」と呼ぶ）は、例えば、抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体が認識するエピトープと重複しないエピトープであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列において好ましくは１７０位～１８７位の間または２０９位～２３３位の間、より好ましくは１７２位～１８５位の間または２１２位～２３０位の間、より好ましくは１７４位～１８３位の間または２１５位～２２７位の間に存在するエピトープであってもよく、特に好ましくはＰＰＡＰＫＴＰ（１７６位～１８２位の間、好ましくは、Ｔはリン酸化スレオニン残基である、配列番号４）またはＰＰＴＲＥＰＫ（２１８位～２２４位の間、配列番号５）であってもよい。別のエピトープは、非修飾ペプチドまたは修飾ペプチドのいずれであってもよい。修飾ペプチドとしては、例えば、上述したものが挙げられる。別のエピトープ中の修飾アミノ酸残基としては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列における１８１位のリン酸化スレオニンが挙げられる。別のエピトープが修飾ペプチドである場合、本発明のキットは、修飾タウタンパク質の検出に用いることができる。
　別の抗タウタンパク質抗体は、固相へ固定されてもよい。抗体の固相への固定化（結合）方法としては、上述した、抗体のリンカー化合物への結合方法と同様の方法を利用することができる。
　本発明のキットは、タウタンパク質に対するイムノアッセイにおいて利用することができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、上述した方法が挙げられ、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。サンドイッチ法において、好ましくは、抗体コンジュゲートおよび別の抗タウタンパク質抗体をそれぞれ、検出抗体および捕捉抗体として用いてもよい。
　本発明のキットは、（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート（抗体コンジュゲート）；および（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体（別の抗タウタンパク質抗体）を、互いに隔離された形態で含むことが好ましい。具体的には、抗体コンジュゲートと別の抗タウタンパク質抗体はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容されてもよい。あるいは、抗体コンジュゲートおよび別の抗タウタンパク質抗体は組成物の形態（例、溶液）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、抗体コンジュゲートと別の抗タウタンパク質抗体を含む、その構成成分の全部がデバイス中に収容されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容され、残りのものがデバイス中に必ずしも収容されていなくてもよい（例、異なる容器に収容された形態）。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、タウタンパク質の検出の際に、デバイス中に注入されてもよい。
　好ましい実施形態では、本発明のキットは、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明のキットは、任意の構成成分として、標識、希釈液（緩衝液）、標識と反応する基質、およびタウタンパク質標品を含んでいてもよい。好ましくは、抗体コンジュゲートまたは別の抗タウタンパク質抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。本発明のキットの構成の具体例は、標識担体を含む抗体コンジュゲート、固相（例、磁性粒子、支持体、容器）に固定化された別の抗タウタンパク質抗体、標識と反応する基質、およびタウタンパク質標品である。
　本発明はまた、タウタンパク質の検出方法を提供する。本発明の方法は、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む。「２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート」は、上述したとおりである。
　サンプル中のタウタンパク質の検出は、イムノアッセイによって行われてもよい。このようなイムノアッセイとしては、例えば、上述したものが挙げられ、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。本発明の方法において、抗体コンジュゲートは、検出抗体または捕捉抗体として用いてもよく、好ましくは検出抗体として用いてもよい。
　タウタンパク質の検出は、例えば、サンプルを抗体コンジュゲートで処理して抗体コンジュゲートをサンプル中のタウタンパク質に結合させる工程（例、サンプルと抗体コンジュゲートを接触させる工程）、およびタウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートを検出する工程により行われてよい。タウタンパク質の検出は、タウタンパク質に結合していない抗体コンジュゲートを除去する工程（例、洗浄工程）をさらに含んでもよい。タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートの検出は、標識を抗体コンジュゲートに結合させる工程、および抗体コンジュゲートに結合した標識を検出する工程により行われてよい。抗体コンジュゲートが標識を含む場合、タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートの検出は、抗体コンジュゲート中の標識を検出する工程により行われてよい。
　本発明の方法は、抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体（「別の抗タウタンパク質抗体」）にサンプルを接触させることをさらに含んでもよい。「別の抗タウタンパク質抗体」は、上述したとおりである。この場合において、タウタンパク質の検出は、例えば、サンプルを別の抗タウタンパク質抗体で処理してサンプル中のタウタンパク質を別の抗タウタンパク質抗体に結合（捕捉）させる工程（例、サンプルと別の抗タウタンパク質抗体を接触させる工程）、別の抗タウタンパク質抗体に結合したタウタンパク質を抗体コンジュゲートで処理して、抗体コンジュゲートを、別の抗タウタンパク質抗体に結合したタウタンパク質に結合させる工程（例、別の抗タウタンパク質抗体に結合したタウタンパク質と抗体コンジュゲートを接触させる工程）、およびタウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートを検出する工程により行われてよい。タウタンパク質の検出は、遊離のタウタンパク質または別の抗タウタンパク質抗体を除去する工程（Ｂ／Ｆ分離または洗浄工程）、もしくはタウタンパク質に結合していない抗体コンジュゲートを除去する工程（例、洗浄工程）、またはその両方の工程をさらに含んでもよい。タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートの検出は、上述したとおりである。
　サンプルは、例えば、液体サンプル（例、体液、標品）、組織サンプル、ブロッティングサンプルであってもよい。特に、サンプルは、ヒトから採取された体液サンプルであってもよい。体液サンプルとしては、例えば、血液サンプル（例、全血、血漿、血清）、脳脊髄液、尿、および唾液が挙げられ、好ましくは、脳脊髄液、血漿、または血清であってもよい。
　タウタンパク質の検出としては、例えば、タウタンパク質の存在もしくは非存在または量の評価、修飾タウタンパク質（例、リン酸化タウタンパク質）の存在もしくは非存在または量の評価、タウタンパク質の修飾（例、リン酸化）の程度の評価が挙げられる。これらのタウタンパク質の評価に基づいて、アルツハイマー病等の神経変性疾患を診断することができる。タウタンパク質の評価に基づくアルツハイマー病等の神経変性疾患の診断は、公知の手法（例、特表平８－５０２８９８号公報、特表平９－５０６７７１号公報）に基づいて行うことができる。
　以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：アルカリホスファターゼ標識ハイブリッドコンジュゲートの作製
　タウタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体ＢＴ２（エピトープ：ＤＲＳＧＹＳ（配列番号３）、フジレビオヨーロッパ社製）とペプシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
　タウタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体ＨＴ７（エピトープ：ＰＰＧＱＫ（配列番号２）、フジレビオヨーロッパ社製）とブロメラインを混合し、３７℃で１時間インキュベートしてブロメライン消化を行った。反応を停止させた後、ゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
　得られたＢＴ２のＦ（ａｂ’）２断片およびＨＴ７のＦ（ａｂ’）２断片を重量比１：１で混合し、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）塩酸塩を添加して、３７℃で９０分間インキュベートして、両断片を還元（チオール化）した。さらに脱塩処理し、ＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物を得た。
　一方、脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）をモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＡＬＰのマレイミド化を行った。脱塩した後、ＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物と、マレイミド化ＡＬＰとを、モル比２：１で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２－ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、コンジュゲート反応混合物を得た。
　得られたコンジュゲート反応混合物を脱塩、精製した後、ＨｉＬｏａｄ　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、抗体のゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数のピークのうち、ＡＬＰ１つに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分をプールし、ハイブリッドコンジュゲートとした。ハイブリッドコンジュゲートを精製後、０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）中に、０．１　ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
比較例１：アルカリホスファターゼ標識単一モノクローナル抗体の作製
　モノクローナル抗体ＢＴ２とペプシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
　得られたＢＴ２のＦ（ａｂ’）２断片を、２－ＭＥＡ塩酸塩を用いて、３７℃で９０分間インキュベートし、還元して、ＢＴ２のＦａｂ’断片を得た。
　一方、脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）をモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＡＬＰのマレイミド化を行った。脱塩した後、ＢＴ２のＦａｂ’断片と、マレイミド化ＡＬＰとを、モル比１：１の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２－ＭＥＡ塩酸塩を添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで停止し、ＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片を得た。
　得られたＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数ピークのうち、１つのＡＬＰに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分について低分子側と高分子側の二つのグループに分けてプールした。低分子側の画分を第１のＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片（１：Ｘ）とし、高分子側の画分を第２のＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片（１：ＸＸ）とした。各ＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片を精製後、それぞれ、０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）中に、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度になるようよう調整した。
　第１および第２のＡＬＰ標識ＨＴ７　Ｆａｂ’断片は、第１および第２のＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片と同様に調製した。
　上記にて調製した第１のＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片溶液と、第１のＡＬＰ標識ＨＴ７　Ｆａｂ’断片溶液とを容量比１：１で混合して、第１のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物を得た。また、上記にて調製した第２のＡＬＰ標識ＢＴ２　Ｆａｂ’断片溶液と、第２のＡＬＰ標識ＨＴ７　Ｆａｂ’断片溶液とを容量比１：１で混合して、第２のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物を得た。
実施例２：抗体結合磁性粒子の作製
　固相結合抗体として、１８１番目のスレオニンがリン酸化されたタウタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体ＡＴ２７０（エピトープ：ＰＰＡＰＫＴ（ｐ）Ｐ（配列番号４）、Ｔ（ｐ）はリン酸化スレオニン残基を示す）、およびタウタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体ＡＴ１２０（エピトープ：ＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号５））をそれぞれ磁性フェライト粒子に結合した。
　具体的には、カルボキシル化された磁性フェライト粒子（富士レビオ社製）にエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加し、２５℃で３０分ゆるやかに撹拌しながらインキュベートした。洗浄後、マウスモノクローナル抗体ＡＴ２７０を添加し、２５℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを添加し、２５℃で３０分ゆるやかに撹拌しながらインキュベートして反応停止させた。反応停止後、磁性フェライト粒子を磁石で集めて反応液から分離し、粒子を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、３％ＢＳＡを含む、ｐＨ７．２）にて洗浄し、ＡＴ２７０結合磁性粒子を得た。得られたＡＴ２７０結合磁性粒子を０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液に懸濁してＡＴ２７０結合磁性粒子液を得た。
　ＡＴ１２０結合磁性粒子も、ＡＴ２７０結合磁性粒子と同様の方法で作製した。
実施例３：リン酸化タウペプチドの測定
　タウタンパク質の１８１番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化タウペプチド抗原を、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて希釈し、各濃度が０、４．５、９、１８、３６、７２、１５０ｐＭになるようにリン酸化タウ標準溶液を調製した。
　実施例２で作製したＡＴ２７０結合磁性粒子液１５０μＬと、希釈したリン酸化タウ標準溶液１００μＬを反応槽に分注し、撹拌後３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄は、「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ（登録商標）」専用洗浄液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ　Ｗａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）を用いた。洗浄後、反応槽に、実施例１で作製したハイブリッドコンジュゲートを５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含む、ｐＨ６．８）で０．２μｇ／ｍＬに希釈した溶液２５０μＬを分注し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、化学発光基質である３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ」（富士レビオ社製）を用いて行った。
　対照として、ハイブリッドコンジュゲート溶液の代わりに、比較例１で作製したＡＬＰ標識単一抗体（第１のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物および第２のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物）を用いて、同様に標準溶液を測定し、カウント値を求めた。
　結果を表１に示す。各リン酸化タウ標準溶液のカウント値は、二重で測定したカウント値の平均値として示す。また、０ｐＭにおけるカウント値に対する４．５ｐＭにおけるカウント値の比率（Ｓ／Ｎ比）をそれぞれ求めた。その結果、第１のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物は、低いカウントを生じていた。第２のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物は、高濃度の標準溶液でのみハイブリッドコンジュゲートと同様のカウント値を生じていた。一方で、ハイブリッドコンジュゲートのみが低濃度の標準溶液に対しても非常に高いカウント値を示した。結果として、ブランク（０ｐＭ）のカウント値に対する、最も低い標準溶液（４．５ｐＭ）のカウント値の比（Ｓ／Ｎ比）は、ハイブリッドコンジュゲートを用いた場合、ＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物（ＡＬＰ標識単一抗体）を用いた場合に比べて約６倍高いことが明らかとなった。
　高いＳ／Ｎ比は、安定したアッセイシステムを得るために、かつ高い感度を得るために重要な要素であり、ハイブリッドコンジュゲートを用いることで、高感度かつ安定したアッセイシステムを構築できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例４：総タウタンパク質の測定
　実施例２で作製したＡＴ１２０結合磁性粒子液１５０μＬと、総タウタンパク質測定用のキャリブレータ試薬（「ＬＵＭＩＰＵＬＳＥ　Ｇ　Ｔｏｔａｌ　Ｔａｕ　Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ　ｓｅｔ」、富士レビオ社製）または当該キャリブレータ試薬を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて希釈して調製したタウタンパク質標準溶液７５μＬと、実施例１で作製したハイブリッドコンジュゲートを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて０．２μｇ／ｍＬに希釈した溶液５０μＬを反応槽に分注し、撹拌後３７℃で２０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、ＡＭＰＰＤを含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ」（富士レビオ社製）を用いて行った。
　対照として、ハイブリッドコンジュゲート溶液の代わりに、ビオチン化モノクローナル抗体ＢＴ２（フジレビオヨーロッパ社製）、ビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７（フジレビオヨーロッパ社製）、およびストレプトアビジン標識ＡＬＰを用いて、以下のとおり、標準溶液を測定した。
　実施例２で作製したＡＴ１２０結合磁性粒子液１５０μＬと、上記タウタンパク質標準溶液７５μＬと、ビオチン化モノクローナル抗体ＢＴ２およびビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７を含む溶液（抗体混合物）５０μＬ（総抗体８μｇ／ｍＬ）を反応槽に分注し、撹拌後３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、０．０８μｇ／ｍＬストレプトアビジン標識ＡＬＰ（ＳＡ－ＡＬＰ）溶液２５０μＬを分注し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、ＡＭＰＰＤを含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。
　また、脳脊髄液検体を緩衝液で希釈したサンプル（ＬｏＢ、ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）についても同様に測定し、カウント値を得た。
　結果を表２に示す。表２は、両アッセイ系で決定された、測定カウント値、Ｓ／Ｎ比、ＬｏＱ（定量限界値）を示す。各標準溶液（ＣＡＬ）のカウント値は、二重で標準溶液を測定したカウント値の平均値として示す。サンプルのカウント値は、ｎ＝１０でサンプルを測定したカウント値の平均値として示す。Ｓ／Ｎ比は、ブランク（０ｐｇ／ｍＬ）のカウント値に対する６００ｐｇ／ｍＬのカウント値の比として求めた。なお、６００ｐｇ／ｍＬのカウント値は、標準溶液のカウント値から算出した。
　図１（ハイブリッドコンジュゲート）および図２（抗体混合物）は、各標準溶液の平均カウント値と濃度から作成した標準曲線に基づいて算出した各サンプル（ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）の濃度と、各サンプル（ＬｏＱ１～ＬｏＱ５）をｎ＝１０で測定した際のカウント値の変動係数（ＣＶ）をプロットしている。図１および２において、精度プロファイル（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ）に基づいて、両アッセイ系に対してＬｏＱ（ＣＶ２０％）を求めた。
　その結果、総タウタンパク質に関して、ハイブリッドコンジュゲートの使用は、各標識抗体の混合物よりも、非常に高いカウント値を生じ、Ｓ／Ｎ比もハイブリッドコンジュゲートの方が、各標識抗体の混合物よりも約６倍増加した。さらに、ハイブリッドコンジュゲートを用いた場合のＬｏＱは、各標識抗体の混合物を用いた場合のＬｏＱと比べて約１／１０であった。よって、ハイブリットコンジュゲートの使用により低濃度の総タウタンパク質を定量できることが分かった。
　以上の結果から、総タウタンパク質アッセイ系においても、ハイブリッドコンジュゲートを使用することによって、高感度かつ安定したアッセイシステムを構築できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例５：　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）リンカーハイブリッドコンジュゲートの作製１
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とＧＭＢＳをモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＢＳＡのマレイミド化を行った。脱塩した後、実施例１で得られたＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物と、マレイミド化ＢＳＡとを、モル比２：１で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２－ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、コンジュゲート反応混合物を得た。
　得られたコンジュゲート反応混合物を、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、抗体のゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数のピークのうち、ＢＳＡ１つに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分をプールし、ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートを得た。
　得られたＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートとＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｔｉｏｎ（サーモフィッシャー社製）をモル比１：３０で混合し、２５℃４５分インキュベートしてＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートのビオチン化を行った。さらに脱塩処理し、ビオチン化ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート１を得た。さらに、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に０．４μｇ／ｍＬに希釈し、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ－ＳＡ）（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．４μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＡＬＰで標識されたＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート１を含む反応溶液（ハイブリッドコンジュゲート反応溶液１）を得た。
実施例６：ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートの作製２
　ＢＳＡに２－ＭＥＡ塩酸塩を添加して、３７℃で６０分間インキュベートして、還元（チオール化）した。さらに脱塩処理し、チオール化ＢＳＡを得た。さらに、チオール化ＢＳＡとＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｔｉｏｎ（サーモフィッシャー社製）をモル比１：２５、チオール化ＢＳＡと１、２―ビス(マレイミド)エタン（東京化成工業社製）をモル比１：３５０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＢＳＡのビオチン化、マレイミド化を同時に行った。脱塩した後、実施例１で得られたＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物と、ビオチン化マレイミド化ＢＳＡとを、モル比２：１で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２－ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、ビオチン化ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート２を得た。
　得られたビオチン化ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート２を５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に０．２μｇ／ｍＬに希釈し、ＡＬＰ－ＳＡ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．４μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＡＬＰで標識されたＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート２を含む反応溶液（ハイブリッドコンジュゲート反応溶液２）を得た。
比較例２：ＢＳＡリンカー単一モノクローナル抗体の作製
　モノクローナル抗体ＢＴ２とペプシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
　得られたＢＴ２のＦ（ａｂ’）２断片を、２－ＭＥＡ塩酸塩を用いて、３７℃で９０分間インキュベートし、還元して、ＢＴ２のＦａｂ’断片を得た。
　一方、脱塩したＢＳＡとＧＭＢＳをモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＢＳＡのマレイミド化を行った。脱塩した後、ＢＴ２のＦａｂ’断片と、マレイミド化ＢＳＡとを、モル比２：１の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２－ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、ＢＳＡリンカーＢＴ２　Ｆａｂ’断片を得た。
　得られたＢＳＡリンカーＢＴ２　Ｆａｂ’断片をリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数ピークのうち、１つのＡＬＰに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分についてプールした。
　ＢＳＡリンカーＨＴ７　Ｆａｂ’断片は、ＢＳＡリンカーＢＴ２　Ｆａｂ’断片と同様に調製した。
　得られたＢＳＡリンカーＢＴ２　Ｆａｂ’断片およびＢＳＡリンカーＨＴ７　Ｆａｂ’断片を５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）にそれぞれ０．２μｇ／ｍＬで希釈し、ＡＬＰ－ＳＡ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．４μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＡＬＰ標識ＢＳＡリンカーＢＴ２　Ｆａｂ’断片とＡＬＰ標識ＢＳＡリンカーＢＴ２　Ｆａｂ’断片との混合物（混合コンジュゲート反応溶液）を得た。
実施例７：リン酸化タウペプチドの測定
　タウタンパク質の１８１番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化タウペプチド抗原を、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて希釈し、各濃度が０、４０、１００、２００、４００ｐｇ／ｍＬになるようにリン酸化タウ標準溶液を調製した。
　実施例２で作製したＡＴ２７０結合磁性粒子液１５０μＬと、希釈したリン酸化タウ標準溶液３０μＬを反応槽に分注し、撹拌後３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄は、「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ（登録商標）」専用洗浄液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ　Ｗａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）を用いた。洗浄後、反応槽に、実施例５で作製したハイブリッドコンジュゲート反応溶液１または実施例６で作製したハイブリッドコンジュゲート反応溶液２を、２５０μＬ分注し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、ＡＭＰＰＤを含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ　Ｇ」（富士レビオ社製）を用いて行った。
　対照として、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液の代わりに、比較例２で作製した混合コンジュゲート反応溶液を用いて、同様に標準溶液を測定し、カウント値を求めた。
　結果を表３に示す。各リン酸化タウ標準溶液のカウント値は、二重で測定したカウント値の平均値として示す。また、０ｐｇ／ｍＬにおけるカウント値に対する４０ｐｇ／ｍＬにおけるカウント値の比率（Ｓ／Ｎ比）をそれぞれ求めた。その結果、混合コンジュゲート反応溶液を用いた場合は、低いカウントを生じていた。一方で、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液１およびハイブリッドコンジュゲート反応溶液２を用いた場合は、低濃度の標準溶液に対しても非常に高いカウント値を示した。結果として、ブランク（０ｐｇ／ｍＬ）のカウント値に対する、最も低い標準溶液（４０ｐｇ／ｍＬ）のカウント値の比（Ｓ／Ｎ比）は、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液１を用いた場合、混合コンジュゲート反応溶液（ＡＬＰ標識単一抗体の混合物）を用いた場合に比べて約９倍高く、また、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液２を用いた場合、混合コンジュゲート反応溶液を用いた場合に比べて約１３倍高いことが明らかとなった。
　高いＳ／Ｎ比は、安定したアッセイシステムを得るために、かつ高い感度を得るために重要な要素であり、ハイブリッドコンジュゲートを用いることで、高感度かつ安定したアッセイシステムを構築できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (11)

  1. 　２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート。
  2. 　前記２種以上の抗タウタンパク質抗体が、２種以上の抗ヒトタウタンパク質抗体である、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。
  3. 　２種以上の抗タウタンパク質抗体が、配列番号１のアミノ酸配列において１５３位～１６９位の間に存在するエピトープを認識する第１の抗体、および配列番号１のアミノ酸配列において１８８位～２０７位の間に存在するエピトープを認識する第２の抗体を含む、請求項２に記載の抗体コンジュゲート。
  4. 　前記第１の抗体が認識するエピトープが、ＰＰＧＱＫ（配列番号２）であり、前記第２の抗体が認識するエピトープが、ＤＲＳＧＹＳ（配列番号３）である、請求項３に記載の抗体コンジュゲート。
  5. 　担体が、標識担体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  6. 　以下を含む、キット：
    （ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート；および
    （ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
  7. 　前記別のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列において１７０位～１８７位の間または２０９位～２３３位の間に存在するエピトープである、請求項６に記載のキット。
  8. 　前記別のエピトープが、ＰＰＡＰＫＴＰ（配列番号４）またはＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号５）である、請求項７に記載のキット。
  9. 　２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む、タウタンパク質の検出方法。
  10. 　サンプルが、ヒトから採取された体液サンプルである、請求項９に記載の方法。
  11. 　抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体にサンプルを接触させることをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
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