TWI651536B - 一種用以診斷及預斷癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容是關於一種用以決定一個體是否罹患癌症或有罹患癌症之風險的方法。該方法包含:由該個體取得一檢體;決定至少二種標的多肽的含量,該至少二種標的多肽係選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組;以及基於該至少二種標的多肽的含量來評估該個體是否罹患癌症或有罹患癌症的風險。本發明方法可用以診斷及預斷口腔鱗狀細胞癌的發生,據此及時對有需要之個體投予適當的治療。
Description
本揭示內容是關於一用以偵測口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的多標誌分析組;更具體來說,本揭示內容是關於以四蛋白分析組、三蛋白分析組或二蛋白分析組藉由唾液檢體來偵測口腔鱗狀細胞癌及監測罹患口腔惡性潛能病變(oral potentially malignant disorder,OPMD)之病患的方法。
口腔癌是一種全球性的好發癌症,於世界各地造成日益嚴重的疾病問題。歐美及亞洲地區最常見的口腔癌發生位置為舌頭及頰部區域。於2012年,估計約有300,400名新增的口腔癌病患,而約有145,400名病患因口腔癌而死亡。口腔癌發生率最高的地區為美拉尼西亞、中南亞及中東歐(每100,000人中約有9.1-22.9人)。超過三分之一的新增個案及半數的死亡人數皆發生
於開發中國家。然而,若在分析西方歐洲國家之口腔癌發生率時一併將年齡列入考量因素,可發現西方罹患口腔癌的個體數亦逐漸攀升,顯示在過去二十年間口腔癌呈現穩定增加的趨勢。口腔鱗狀細胞癌是一種最常見的口腔癌,估計佔口腔癌總個數的90%以上。造成口腔鱗狀細胞癌的主要致病因素包含吸菸、酗酒、非吸菸性的菸草使用及咀嚼檳榔。即使可藉由外科手術及管理等方法予以處理,多數國家口腔鱗狀細胞癌的5年存活率仍約為50%。該統計數據顯示超過60%的病患為第III或IV期的病患,且相較於其他癌症,口腔鱗狀細胞癌較易造成第二原位性腫瘤的發生。癌症確診時的分期是決定個體5年存活率的關鍵因素,第I期病患的5年存活率約為80%,相較之下,晚期病患的5年存活率則會顯著下降。因此,相關領域亟需一種可早期診斷口腔鱗狀細胞癌的方法。
口腔鱗狀細胞癌多發生於口腔的可見病變,且伴隨著口腔上皮異常。世界衛生組織將該病變稱為口腔惡性潛能病變。目前已確認超過20種口腔惡性潛能病變。相較於薄型同質性白斑症(thin homogeneous leukoplakia)及扁平苔癬(lichen planus),黏膜紅斑(erythroplakia)、黏膜下纖維化(submucous fibrosis)、異質性白斑症(heterogeneous leukoplakia)及疣狀增生(verrucous hyperplasia)等病變具有更高的惡性轉形機率。口腔惡性潛能病變於各國的惡性轉形率約為0.13%到17.5%。在台灣病患中,不同組織形態的總惡性轉形率為4.32%,且惡性轉形的
平均發生時間為33.56個月。其中,上皮異常(24.4%)及疣狀增生(20%)具有更高的轉形率。口腔惡性潛能病變惡性轉形為口腔鱗狀細胞癌的過程相當緩慢,且幾乎無法觀察,造成病患無法及時注意,進而延誤口腔鱗狀細胞癌的診斷。此外,許多口腔惡性潛能病變的病灶包含潛在惡性細胞、尚未侵襲他處的惡性細胞、已侵襲他處的惡性細胞及正常細胞的混合性組織。該混合性組織反應了區域性的癌化現象,造成臨床醫療人員在面對相同病灶時產生不同的判斷,且使檢體的診斷過程過於複雜化。病理學家曾因此錯誤診斷病患的病情。基於該些因素,臨床醫療人員往往不易診斷出早期的口腔鱗狀細胞癌,因此醫療相關領域亟需可用以確認高風險之口腔惡性潛能病變及/或監測該病變惡性轉形的方法。
由於口腔鱗狀細胞癌多由可觀察之口腔惡性潛能病變轉形而成,通常可藉由觀察口腔黏膜及病理檢驗異常組織的檢體,來偵測口腔鱗狀細胞癌(特別是像在台灣等好發性國家)。最近一項於印度進行之觀察性篩選口腔鱗狀細胞癌或口腔惡性潛能病變的隨機分配對照試驗(191,873位參與者,15年觀察期後確認553位罹患口腔鱗狀細胞癌,且6749位罹患口腔惡性潛能病變)指出,口腔觀察可減少接觸菸草及酒精之病患的死亡率。過去二十年間,口腔鱗狀細胞癌於台灣的發生率正逐漸提高;在1996到2009年之間,男性每年罹患口腔鱗狀細胞癌的比例為24.64/100,000(將年齡列入考量因素後),該比例為世界最高的比例之一。2010後,台灣政府已推
動台灣口腔癌篩檢計畫(Taiwan’s Oral Cancer Screening Program),提供高風險族群(30歲以上有咀嚼檳榔或吸菸習慣的個體)每年免費的口腔檢查。每年約有一百萬參與者參與篩檢活動,包含請臨床醫生或牙醫進行口腔檢察,轉診進行病理確認及後續的治療(口腔癌篩檢臨床路徑)。然而,2011到2012的篩檢結果指出,相較於常規臨床診斷,篩檢僅能提升約3%之早期性(即第I期)口腔鱗狀細胞癌的診斷率(表1)。該結果並不意外,原因在於第一線健康工作者通常不易判斷何種口腔病變應轉診進行組織確認。此外,早期口腔鱗狀細胞癌多與某些良性或發炎病狀相似,且會與多種口腔惡性潛能病變共同存在;在此情況下,癌化病灶的分布或瀰漫性黏膜下纖維化往往使臨床醫療人員無法藉由組織切片來準確判斷癌細胞。因此,相關領域亟需一種非侵入式的臨床檢測方法,用以有效檢測包埋於口腔惡性潛能病變病灶的癌細胞。
a 1,850,697位具有罹患口腔鱗狀細胞癌風險的個體參與篩檢。
近年來,已有多種非侵入式的候選生物標誌可用以檢測口腔鱗狀細胞癌。然而,多數的候選生物標誌皆未經詳細的分析評估,或利用適當的體液檢體進行定量平行比對,據以確認何種候選生物標誌可進一步於大規模檢體族群進行臨床驗證。上述原因也部分解釋了為何至今仍無分子生物標誌獲得政府健康機關的許可,可用以早期診斷及/或處理口腔鱗狀細胞癌。有鑑於此,相關領域亟需一種新穎的生物標誌,可用以預斷及/或診斷口腔鱗狀細胞癌,進而及時提供有需要之個體適當的治療。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要,以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述,且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌之風險的方法。該方法包含:(a)由該個體取得一檢體;(b)決定該檢體中至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由膜聯蛋白A2(annexin A2,ANXA2)、熱休克蛋白A5(heat shock protein A5,HSPA5)、激肽原-1(kininogen-1,KNG1)及基
質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP1)所組成的群組;(c)基於步驟(b)決定之該至少二種標的多肽的含量來計算一風險指數(risk score);以及(d)基於步驟(c)之風險指數來決定該個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌的風險。
依據本揭示內容某些實施方式,是利用邏輯式迴歸(logistic regression)來計算風險指數。較佳地,是利用以下公式來計算風險指數:
其中e為一數學常數,其為自然對數之基數;a為一常數值;X1、X2、X3及X4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的濃度;且b1、b2、b3及b4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的變異係數。
依據本揭示內容之實施方式,在步驟(d)中,當該風險指數低於0.4時,則該個體未罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的低風險族群;而當該風險指數等於或高於0.4時,則該個體罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的高風險族群。臨床醫療人員可對風險指數等於或高於0.4的個體及時安排適當的病理檢查及/或投予抗癌治療(例如預防性治療或治療性治療)。
一般來說,該個體為一哺乳動物;較佳是一人類。依據本揭示內容之實施方式,該檢體為唾液。
本揭示內容的第二態樣是關於一種用以決定一生物檢體是否包含癌化口腔鱗狀細胞的方法。本發明方法包含:(a)決定該生物檢體中至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組;(b)基於步驟(a)決定之該至少二種標的多肽的含量來計算一風險指數;以及(c)基於步驟(b)的風險指數來評估該生物檢體是否包含癌化口腔鱗狀細胞。
依據本揭示內容某些實施方式,是利用邏輯式迴歸來計算該風險指數。較佳地,是利用以下公式來計算該風險指數:
其中e為一數學常數,其為自然對數之基數;a為一常數值;X1、X2、X3及X4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的濃度;且b1、b2、b3及b4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的變異係數。
依據本揭示內容一實施方式,當該風險指數等於或高於0.4時,則該生物檢體包含癌化口腔鱗狀細胞。
依據本揭示內容某些實施方式,該檢體為唾液。
本揭示內容亦提供一種藥學套組,以及其
於診斷口腔鱗狀細胞癌或評估口腔鱗狀細胞癌發生風險的用途。本發明藥學套組包含至少二試劑,用以決定該個體體內至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組。依據本揭示內容一實施例,該至少二試劑中的各試劑皆為一以同位素標記的多肽,且包含選自由序列編號:5、6、7及8所組成之組群的胺基酸序列。
基於定量結果所產生的風險指數可作為口腔鱗狀細胞癌指標。依據本揭示內容之實施方式,當該風險指數低於0.4時,則該個體未罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的低風險族群;而當該風險指數等於或高於0.4時,則該個體罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的高風險族群。
例示性之可用以決定該至少二種標的多肽的試驗包含,但不限於,酵素結合免疫吸附分析試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、利用條帶進行的快速檢測(strip-based rapid test)、西方墨點法(western blotting)、質譜分析法(mass spectrometry)、蛋白微陣列(protein microarray)、流式細胞儀分析(flow cytometry)、免疫螢光分析(immunofluorescence)、免疫組織化學分析(immunohistochemistry)及多重探針監測試驗(multiplex detection assay)。在本揭示內容一特定實施例中,是利用液相層析串聯質譜法以多反應監測模式(liquid chromatography-tandem mass
spectrometry with multiple reaction monitoring(MRM)mode,LC-MRM-MS)來決定該至少二種標的多肽的含量。
在參閱下文實施方式後,本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的,以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:第1A圖之分群樹狀圖是關於篩選的四種蛋白及其於各分截點的濃度截止值(cut-off value,單位為每毫升之奈克);第1B圖之二維點狀圖是關於測試資料組(training set,n=224)之健康對照個體、口腔低惡性潛能病變病患(OPMD I)及口腔鱗狀細胞癌病患(OSCC)的風險指數;第1C圖之二維點狀圖是關於試驗組(test set,n=106)之健康對照個體、口腔低惡性潛能病變病患(OPMD I)及口腔鱗狀細胞癌病患(OSCC)的風險指數;第1D圖闡述了測試資料組及試驗組的曲線下面積(area under the curve,AUC)、靈敏度及專一性;
第2圖之二維點狀圖闡述了相對於非口腔鱗狀細胞癌族群(健康對照+口腔低惡性潛能病變(OPMD),n=199),利用四蛋白分析組計算第I到IV期之口腔鱗狀細胞癌病患(n分別為50、29、16及36)的風險指數;以及第3圖之二維點狀圖闡述了相對於非口腔鱗狀細胞癌族群(健康對照+口腔低惡性潛能病變(OPMD I),n=199)及口腔鱗狀細胞癌族群(OSCC,n=131),利用四蛋白分析組計算口腔高惡性潛能病變族群(OPMD II,n=130)的風險指數。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值,此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處,「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平
均值的可接受標準誤差之內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處,將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間;除非另有說明,此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義,此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外,在不和上下文衝突的情形下,本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型;而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「胺基酸序列相同度百分比」(Percentage(%)amino acid sequence identity)一詞在本說明書是指在將一候選胜肽序列(candidate sequence)與一特定胜肽序列進行比對後,二序列間胺基酸殘基的相同百分比;在比對時,是將二序列排比,且若有必要,加入適當的間隙(gap),藉以達到最大的相同度百分比,且不將保留性置換(conservative substitution)視為序列相同的一部份。可利用各式相關領域習知技藝人士所熟知的方法來進行比對,並決定二序
列的相同百分比;舉例來說,可以利用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等電腦軟體來進行比對分析。相關領域習知技藝人士可使用適當的參數(包含各式演算法)來測量比對,以於胺基酸全長序列中產生最大的比對序列。在本說明書中,二胺基酸序列間的序列比對是利用國家生物技術訊息中心(Nation Center for Biotechnology Information,NCBI)線上提供的Blastp(蛋白-蛋白BLAST)電腦軟體來進行分析。具體來說,一特定胺基酸序列A與一特定胺基酸序列B之間的胺基酸序列相同百分比(亦可表述為一特定胺基酸序列A與一特定胺基酸序列B具有某百分比的胺基酸序列相同度)是利用下列公式來計算:
×100%其中X是經比對程式BLAST評比後,A與B序列間相互吻合的胺基酸殘基數量,Y則是A或B序列中(取較短者)胺基酸殘基的總數量。
「接受者操作特徵曲線」(receiver operating characteristic curve,ROC curve)一詞於本揭示內容中是指一利用真陽性率(true positive rate)與偽陽性率(false positive rate)繪出的曲線,用以決定一預斷試驗之截止值(cut-off value)。ROC曲線通常將(1-專一性)定義為x軸,將靈敏度定義為y軸。一高靈敏度的數值表示低偽陽性率。同理,一高專一性的數值亦表示低偽陽性率。「截止值」(cut-off value)
一詞於此處是指一由ROC曲線所得的數值,用以表示該預斷試驗之敏度感及專一性達到平衡。一切點範圍可以包含數個切點實施方式,其中各切點分別代表不同的靈敏度及其專一性間的平衡。
在揭示內容中,「曲線下面積」(area under the curve,AUC)為相關領域習知技藝人士所知的名詞,定義為ROC曲線下的面積。一AUC數值通常介於0.5-1.0之間,用以代表一預斷試驗的準確度;其中,AUC的數值愈高,表示該預斷試驗的預斷效果愈佳。AUC數值通常會伴隨95%信賴區間(信賴區間,CI),其係指一具有特定概率的統計範圍,以使一設定參數可落於該範圍內。
在本揭示內容中,「評估」(assessing)一詞是指決定一個體之健康狀況的過程。該個體之健康狀況可指診斷或預斷該個體罹患癌症,或是具有罹患癌症的風險。
「風險」(risk)一詞於此是指一項可能會產生不良結果的可能性,例如,口腔鱗狀細胞癌的發生、進展或復發。依據一個體、其檢體或其相關事件的分析結果,該名個體可被歸類至「高度風險」(high risk)、或「低度風險」(low risk)群族。本揭示內容所述之風險指數是指,當一病患的風險指數風險指數0.4時,則該名病患會歸類為「高度風險」族群;亦即,他/她五年內罹患口腔鱗狀細胞癌的可能性高於分析族群中其餘的病
患。當一病患的風險指數<0.4時,則該名病患會歸類為「低度風險」族群;亦即,他/她五年內罹患肝癌的可能性低於分析族群中其餘的病患。
在本揭示內容中,「預防性治療」(prophylactic treatment或preventive treatment)是指防止或抑制一臨床疾病或病狀的發生,或是延緩一臨床疾病或病狀之早期臨床病徵的發生;舉例來說,口腔鱗狀細胞癌。依據本揭示內容之實施方式,「預防性治療」一詞是指對一有罹患口腔鱗狀細胞癌傾向之個體投予防止性治療。一般來說,罹患癌症傾向可能是由遺傳因子、年齡、性別及損傷等因素所造成。
在本揭示內容中,「治療性治療」(therapeutic treatment)是指對一已罹患一疾病(例如口腔鱗狀細胞癌)的個體投予治療,藉以產生治療功效,例如減緩既有病徵、減緩病徵的潛在代謝原因、延緩或防止病狀進一步的發生及/或減少病徵可能或預期會產生的嚴重程度。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物,其可接受本發明方法的治療。除非特定指出,否則「個體」(subject)一詞同時意指不同年齡的男性及女性,例如孩童或成人。
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌之風險的方法。依據本揭示內容之實施方式,該方法
包含以下步驟:(a)由該個體取得一檢體;(b)決定該檢體中至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組;(c)基於步驟(b)決定之該至少二種標的多肽的含量來計算一風險指數;以及(d)基於步驟(c)之風險指數來決定該個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌的風險。
在步驟(a)中,先由個體取得一檢體。該個體為一哺乳動物;較佳為一人類。依據本揭示內容較佳的實施例,該個體為一亞洲人。在本揭示內容一操作實施例中,該個體為一華人。依據本揭示內容的實施方式,該檢體較佳為唾液。
步驟(b)是用以決定檢體中ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中至少二種(例如ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1任二種、三種或四種)多肽的含量。依據本揭示內容某些實施方式,是對ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中任二種多肽進行定量分析(可以是相對定量值或絕對定量值),藉以產生可用以診斷或預斷癌症的二標誌分析組。該二標誌分析組可以由(1)ANXA2及HSPA5多肽,(2)ANXA2及KNG1多肽,(3)ANXA2及MMP1多肽,(4)HSPA5及KNG1多肽,(5)HSPA5及MMP1多肽,或是(6)KNG1及
MMP1多肽所組成。依據本揭示內容某些實施方式,是對ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中任三種多肽進行定量分析(可以是相對定量值或絕對定量值),藉以產生可用以診斷或預斷癌症的三標誌分析組。該三標誌分析組可以由(1)ANXA2、HSPA5及KNG1多肽,(2)ANXA2、HSPA5及MMP1多肽,(3)ANXA2、KNG1及MMP1多肽,或是(4)HSPA5、KNG1及MMP1多肽所組成。依據本揭示內容其他實施方式,是對ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1四種多肽進行定量分析(可以是相對定量值或絕對定量值),藉以產生四標誌分析組。
一般來說,可利用習知技藝人士所熟知的方法來決定ANXA2、HSPA5、KNG1及/或MMP1的含量;舉例來說,酵素結合免疫吸附分析試驗、利用條帶進行的快速檢測、西方墨點法、質譜分析法、蛋白微陣列、流式細胞儀分析、免疫螢光分析、免疫組織化學分析或多重探針監測試驗。依據本揭示內容一實施方式,是利用液相層析串聯質譜法以多反應監測模式(一種蛋白質體學領域常用來專一且準確定量分析多肽的方法)來決定ANXA2、HSPA5、KNG1及/或MMP1的含量。
依據本揭示內容某些實施方式,標的多肽ANXA2包含與序列編號:1具有至少90%(即90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相似度的胺基酸序列;標的多肽HSPA5包含與序列編號:2具有至少90%相似度的胺基酸序列;標的多肽KNG1包含與序列編號:3具有至少90%相似
度的胺基酸序列;而標的多肽MMP1則包含與序列編號:4具有至少90%相似度的胺基酸序列。依據本揭示內容一操作實施例,標的多肽ANXA2具有序列編號:1的胺基酸序列;標的多肽HSPA5具有序列編號:2的胺基酸序列;標的多肽KNG1具有序列編號:3的胺基酸序列;而標的多肽MMP1具有序列編號:4的胺基酸序列。
在步驟(c)中,利用步驟(b)得到的二、三或四標誌分析組來計算可作為風險指數的預期或然率。依據本揭示內容某些實施方式,是利用邏輯式迴歸來分析二、三或四標誌分析組,以得到風險指數。依據本揭示內容較佳的實施方式,是利用以下公式來計算風險指數:
其中e為一數學常數,其為自然對數之基數;a為一常數值;X1、X2、X3及X4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的濃度;且b1、b2、b3及b4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的變異係數。
依據本揭示內容一操作實施例,公式的常數值及變異係數會隨著標誌分析組的不同而改變,可依據表12-13或表16-17之公式來計算特定標的多肽的風險指數。
依據本揭示內容一實施方式,是利用包含二種標的多肽的二標誌分析組來計算風險指數,其中該二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組。依據本揭示內容另一實施方式,
是利用包含三種標的多肽的三標誌分析組來計算風險指數,其中該三種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組。依據本揭示內容較佳的實施方式,是利用包含ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1四種標的多肽的四標誌分析組來計算風險指數。
在步驟(d)中,是利用步驟(c)計算的風險指數來評估一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌的風險。依據本揭示內容某些實施方式,風險指數可用以區分非口腔鱗狀細胞癌個體(例如健康個體或口腔惡性潛能病變病患)與口腔鱗狀細胞癌病患。在某些實施方式中,當風險指數等於或高於0.4(0.4)時,代表該個體罹患口腔鱗狀細胞癌(陽性預測值(positive predictive value,PPV)為75.5%-89.1%);相反地,當風險指數低於0.4(<0.4)時,則代表該個體未罹患口腔鱗狀細胞癌(陰性預測值(negative predictive value,NPV)為81.9%-93.6%);用以區別非口腔鱗狀細胞癌個體及口腔鱗狀細胞癌病患的準確度為80.9%-86.7%。依據一操作實施例,風險指數是與口腔鱗狀細胞癌的分期數相關,其中相較於晚期口腔鱗狀細胞癌,罹患早期口腔鱗狀細胞癌的病患具有較低的風險指數。依據本揭示內容其他實施方式,風險指數可用以評估口腔鱗狀細胞癌於口腔惡性潛能病變(例如口腔低或高惡性潛能病變)病患的發生風險。在該些實施方式中,當風險指數等於或高於0.4(0.4)時,該病患為罹患口腔鱗狀細胞癌的高風險族群(轉形率為37.8%);或者是,當風
險指數低於0.4(<0.4)時,則該病患為罹患口腔鱗狀細胞癌的低風險族群(轉形率為7.8%)。
臨床醫療人員可依據本發明方法所得之風險指數來及時診斷並對有需要之個體投予治療,其中應對風險指數等於或高於0.4的個體投予一抗癌治療(例如一預防性治療或一治療性治療)或安排其進行後續的追蹤檢查。
本揭示內容的第二態樣是關於一種用以診斷及治療一罹患口腔鱗狀細胞癌之個體的方法。該方法包含利用上述方法之步驟(a)到(c)來決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌,接著對風險指數等於或高於0.4的個體投予一有效量之抗癌治療。一般來說,抗癌治療可以是一預防性治療(例如投予抗氧化劑)、一治療性治療(例如化療、手術切除、放射線治療及免疫治療)或其組合。較佳地,抗癌治療為手術切除口腔鱗狀細胞癌。
本揭示內容的第三態樣是關於一種用以決定一生物檢體是否包含癌化口腔鱗狀細胞的方法。該方法包含:(a)決定該生物檢體中至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組;(b)基於步驟(a)決定之該至少二種標的多肽的含量來計算一風險指數;以及(c)基於步驟(b)的風險指數來評估該生物檢體是否
包含癌化口腔鱗狀細胞。
用以評估生物檢體之方法(即第三態樣之方法)的步驟(a)到(b)分別與上述用以評估由個體取得之檢體之方法(即第一態樣之方法)的步驟(b)到(c)相同,因此,為求精簡,在此省略其相關敍述。
在步驟(c)中,是利用步驟(b)計算的風險指數來分析生物檢體。依據本揭示內容一實施方式,該生物檢體為一口腔鱗狀細胞癌檢體;在該實施方式中,生物檢體的風險指數等於或高於0.6。依據本揭示內容另一實施方式,該生物檢體包含癌化口腔鱗狀細胞;舉例來說,一由口腔高惡性潛能病變病患分離的檢體,其中檢體中的癌化細胞無法以傳統方法(例如活體組織切片)來偵測,或是未來(5年內)有轉形成異常病灶的可能性;在該實施方式中,生物檢體的風險指數等於或高於0.4,且低於0.6。
依據本揭示內容某些實施方式,該檢體為唾液。
本揭示內容亦提供一種藥學套組,可用以決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌的風險。本發明藥學套組包含至少二試劑(例如二種、三種或四種試劑),可用以決定個體體內ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中至少二多肽(例如ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中任二種、三種或四種多肽)的含量。舉例來說,本發明藥學套組可包含二試劑,分別
用以定量分析ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中任二種多肽的含量。或者是,本發明藥學套組可包含三試劑,分別用以定量分析ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1中任三種多肽的含量。具選擇性地,本發明藥學套組可包含四試劑,分別用以定量分析ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的含量。
依據使用需求的不同,各試劑可以是一多肽(例如抗體或以同位素標記的多肽)或一適體(aptamer)。依據本揭示內容一實施例,各試劑皆為一以同位素標記的多肽,其中用以定量分析ANXA2(序列編號:1)、HSPA5(序列編號:2)、KNG1(序列編號:3)及MMP1(序列編號:4)的試劑分別包含序列編號:5、6、7及8的胺基酸序列。
可依據試劑類型的不同來決定分析ANXA2、HSPA5、KNG1及/或MMP1含量的方法。依據本揭示內容一實施方式,各試劑皆為一以同位素標記的多肽,且是以LC-MRM-MS來定量分析ANXA2、HSPA5、KNG1及/或MMP1含量。
ANXA2、HSPA5、KNG1及/或MMP1的定量結果可用以計算風險指數,藉以診斷口腔鱗狀細胞癌或評估其發生風險。如上所述,可利用邏輯式迴歸來計算風險指數;較佳地,可利用以下公式來計算風險指數:
其中e為一數學常數,其為自然對數之基數;a為一常數
值;X1、X2、X3及X4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的濃度;且b1、b2、b3及b4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的變異係數。
依據本揭示內容一實施例,公式的常數值及變異係數會隨著標誌分析組的不同而改變,可依據表12-13或表16-17之公式來計算特定標的多肽的風險指數。
依據本揭示內容之實施方式,當風險指數低於0.4時,該個體未罹患口腔鱗狀細胞癌,或為罹患口腔鱗狀細胞癌的低風險族群;而當風險指數等於或高於0.4時,則該個體罹患口腔鱗狀細胞癌,或為罹患口腔鱗狀細胞癌的高風險族群。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣,以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明,且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後,可在不需過度解讀的情形下,完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻,其全文皆視為本說明書的一部分。
材料及方法
樣本
在收集預處理的唾液檢體前,確保參與的個體皆有簽署奇美醫學中心人體試驗委員會許可的知情同意書,同意本發明使用其唾液檢體。由96位健康對照
個體(具有正常黏膜)、103位具有口腔低惡性潛能病變(OPMD I)病患、130位具有口腔高惡性潛能病變(OPMD II)病患及131位罹患口腔鱗狀細胞癌的病患收集唾液檢體。由奇美醫學中心(台灣,柳營)取得2008-2013年的檢體(表2)。所有的個體皆有參與台灣口腔癌篩檢計畫。利用活體組織切片來診斷確認口腔鱗狀細胞癌,並依據標準流程使病患接受常規檢查。依據已知方法來分類口腔惡性潛能病變病例。將130位口腔高惡性潛能病變的個案分為:黏膜紅白斑(erythroleukoplakia,n=6,4.6%)、具有高度口腔黏膜下纖維化的黏膜紅斑(erythroplakia plus high-grade oral submucous fibrosis(OSF),n=1,0.8%)、異質性白斑症(heterogeneous leukoplakia,n=5,3.8%)、具有高度OSF的白斑症(n=7,5.4%)、高度OSF(n=21,16.2%)、斑點白斑症(speckle leukoplakia,n=7,5.4%)、疣狀白斑症(verrucous leukoplakia,n=1,0.8%)、疣狀增生(verrucous hyperplasia,n=44,33.8%)及具有OSF的疣狀增生(n=38,29.2%)。將103位口腔低惡性潛能病變的個案分為:白斑症(n=91,88.3%)、苔蘚樣的變灶(lichenoid lesions,n=4,3.9%)及低度OSF(n=8,7.8%)。
收集並處理唾液檢體。簡單來說,在口腔黏膜檢查期間,收集未經刺激的全唾液。確保供體於檢體收集前至少1小時未進食、飲食、吸菸及使用口腔清潔產品。將各檢體於4℃以3000×g的轉速離心15分鐘。對上清液投予蛋白酶抑制劑混合物(Sigma,St.Louis,MO,USA)後,將檢體儲存於-80℃。
篩選標的蛋白的代理胜肽
對每一標的蛋白篩選一代理胜肽。首先,由代表癌細胞株及初代細胞之分泌蛋白體(secretomes)以及口腔鱗狀細胞癌之組織蛋白質體(tissue proteomes)的獵槍MS資料組(shotgun MS datasets)來挑選胜肽。接著挑選:(a)包含8到23個殘基的特定胜肽,其中經由人類蛋白參考資料庫(human protein reference database)確認該些殘基不具有已知轉譯後修飾位置,且無連續或漏失之胰蛋白酶切割位點;
(b)不具化學反應之胺基酸(例如半胱胺酸或甲硫胺酸)的胜肽;(c)不包含潛在會導致漏失切割之序列(例如RP或KP)的胜肽;以及(d)於MS2數據中具有高度辨識分數的胜肽。進一步利用MRMPilot軟體(2.1版;AB Sciex,Forster City,CA,USA)來分析符合上述條件的胜肽,以預測其碎片離子是否可以MS進行偵測。對於無可用之實質證據且在獵槍MS資料組中無適合之胜肽的四種標的蛋白(DSG3、HGF、CRNN及TP53),是藉由生物資訊預測法來取得所有可能的胰蛋白酶胜肽,並利用上述條件來挑選其代理胜肽。
胰蛋白酶分解及加入穩定同位素標記之標準化(stable isotope-labeled standard,SIS)胜肽
利用LC-MRM-MS來分析經3重複處理之唾液檢體3次。以BCA蛋白試驗套組(Thermo Scientific Pierce,USA)來檢測各唾液檢體的蛋白濃度。將15微克之唾液蛋白溶解於15微升之25mM的碳酸氫銨(ammonium bicarbonate)中,再加入15微升之10%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate,DOC)進行變性反應。以81.35微克之25mM碳酸氫銨稀釋檢體,並與12.4微升之50mM三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)於60℃反應30分鐘進行還原反應後,再與13.75微升之100mM碘乙醯胺(iodoacetamide)於37℃作用30分鐘進行烷基化反應。將改良之定序級胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)以20:1蛋白/酵素的比例加至經還原及
烷化的檢體中,並於37℃反應9小時以分解檢體。中止胰蛋白酶分解反應,並將檢體保存於-20℃以供後續研究分析使用。將49條SIS胜肽標準化混合物(參見後續內容)滲入各檢體中,再以6微升之10%甲酸(formic acid)及1.5微升之10%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)進行酸化反應以沉澱DOC。在滲入SIS胜肽標準化混合物時,是將等量之包含49[13C6;15N2]離胺酸或[13C6;15N4]精胺酸編碼之SIS胜肽的SIS混合物加入分解物中,均勻混合。SIS胜肽是由UVic-Genome BC Proteomics Centre,BC Canada合成及純化而得。ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1之SIS的純度分別為93.4%、98.3%、98.2%及99.1%。表3闡述了特定標的多肽之SIS胜肽的序列及濃度,其中ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的SIS胜肽分別為:「QDIAFAYQR」(序列編號:5)、「ITPSYVAFTPEGER」(序列編號:6)、「TVGSDTFYSFK」(序列編號:7)及「DIYSSFGFPR」(序列編號:8)。在SIS重胜肽中,將精胺酸(Arginine,R)及離胺酸(Lysine,K)的碳-12(12C)置換為碳-13(13C),將精胺酸及離胺酸的氮-14(14N)置換為氮-15(15N)。將酸化的檢體於室溫以16,000×g的速度離心2分鐘,移除DOC後,將上清液冷凍於-20℃中以進行後續實驗。依據使用操作方法並加入些微修改步驟,利用Waters Oasis HLB Elution Plate(Waters,MA)以固相萃取法來使檢體去鹽化並進行濃縮。簡單來說,以
乙腈(acetonitrile)潤溼樹脂後,利用平衡緩衝液(0.1%TFA及0.1%甲酸)進行平衡。加入唾液蛋白分解物,經水洗滌後,以50微升之70%乙腈沖提2次。冷凍乾燥沖提檢體,再加入0.1%甲酸(體積比),使濃度調整為每微升0.25微升,以進行後續LC-MRM-MS分析。
LC-MRM-MS分析及取得數據
利用nanoACQUITY UPLC系統(Waters,USA)來注入唾液胜肽。各檢體的LC-MRM/MS分析(參見後續內容)耗費70分鐘。將4微升檢體(代表1微克的胜肽)注入解析管柱(nanoACQUITY UPLC C18,150微米×10毫米,1.7微米之顆粒大小;水),於97%緩衝液A(0.1%之溶於水的甲酸)(J.T.Baker,USA)及3%緩衝液B(0.1%之溶於乙腈的甲酸)(J.T.Baker)中,流速設定為每分鐘1微升,持續10分鐘。利用48分鐘的線性濃度梯度(由3%到28%之緩衝液B)及5分鐘的線性濃度梯度(由28%到38%之緩衝液B)及1分鐘的線性濃度梯度(由38%到95%之緩衝液B)以每分鐘400奈升的流速來分離檢體。加入95%緩衝液B作用5分鐘後,逐漸降至3%溶劑B(時間超過1分鐘),再以3%緩衝液B重新平衡10分鐘,以回復解析管柱。在各檢體操作間注入空白溶劑(以每分鐘400奈升的速度分析25分鐘),以防止留存於UPLC管柱的檢體相互干擾。
利用具備由Analyst 1.5.1軟體控制之奈米電噴霧游離源的AB/MDS Sciex 5500 QTRAP(all from AB Sciex,Singapore)來進行LC-MRM-MS分析。以下列參數進行偵測:離子噴霧電壓為1900-2200伏特;氣簾設定為20psi(UHP氮氣);界面加熱溫度為150℃;MS操作壓力為3.5×10-5Torr;Q1及Q3之單元分解(0.6-0.8Da,於半高的全寬度)。利用三組MRM離子對以下列條件針對各胜肽進行MRM偵測:碎片離子特定去團簇電位(fragment-ion-specific-tuned declustering potential,DP);進入電位(entrance potential,EP);碰撞能量(collision energy,CE);碰撞細胞輸出電位(collision cell exit potential,CXP)及滯留時間。以1秒的標的循環時間及4分鐘的MRM偵測窗來偵測所有的數據。在一次LC-MRM-MS運作中定量分析49條受測胜肽(對應於49種標的蛋白)的轉移。Table 3總結了用以分析標的多肽ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的MRM參數。
MRM數據分析及產生校正曲線
利用MultiQuant軟體(2.1版;AB
Sciex)以MQ4公式計算峰積分(peak integration)來處理所有MRM數據。在偵測數據時,使用預定MRM來減少循環時間及於各高峰產生更多點,藉以確保定量結果更為準確。各標的胜肽皆有一條標準曲線,其係以不同量之胰蛋白酶分解一標準唾液檢體所得。如臨床檢體之操作,收集並混合由三個體(二位口腔鱗狀細胞癌病患及一位對照個體)收集的唾液,再進行胰蛋白酶分解,以製備標準唾液檢體。將固定量之SIS胜肽滲入標準唾液檢體後,產生11個點(空白,以及A到J)稀釋曲線,其中SIS胜肽濃度為固定,並以適當稀釋的胰肽蛋酶分解物來調整輕胜肽的濃度。於各臨床唾液檢體中加入固定量之49-SIS-胜肽混合物。依據內源性唾液胜肽的濃度及訊號強度來調整SIS混合物的組成,以確保定量的準確度。加入相同濃度的標準唾液檢體(檢體I)作為未知組(注入1微克的內源性胜肽),而檢體A、B、C、D、E、F、G、H及J則分別對應於0.00001-、0.0001-、0.005-、0.01-、0.05、0.1-、0.2-、0.5-及2倍之標準檢體(檢體I)濃度。將固定量之49 SIS混合物滲入檢體A到I,其中是將0.5倍稀釋的SIS混合物加至檢體J中。已知各SIS胜肽的確切濃度,因此可藉由觀察高峰區域的比例來決定未知檢體中蛋白的濃度。
重複3次獨立操作重複(由分解到最終的LC-MRM-MS步驟)以得到各唾液檢體及校正曲線的濃度點。利用標準1/x(x=濃度比)權值選項(可涵蓋廣泛的動態範圍)來得到所有校正曲線的線性迴歸。以三組
MRM離子對來測所各胜肽;其中一組是作為計量計,另二組則是用以確認滯留時間及顯示任何訊號干擾。手動檢查所有峰積分以確保正確的高峰偵測及準確的積分。在統計分析時,將未偵測到高峰的蛋白濃度設定為0。由三次獨立實驗所得之濃度來計算各標的蛋白濃度的平均值,並以每微克之飛莫耳(fmol/μg)及每毫升之奈克(ng/ml)來表示唾液蛋白;其中是假設胰蛋白酶完全分解及100%的胜肽回收,而由各原型胜肽之莫耳含量來得該些數值。
統計分析
在適當的情況下,利用Fisher’s正確檢定(Fisher’s exact test)、單向變異分析(one-way analysis of variance,ANOVA)及/或無母數Mann-Whitney檢定(nonparametric Mann-Whitney test)比對四組(健康對照組、口腔低惡性潛能病變、口腔高惡性潛能病變及口腔鱗狀細胞癌)的分類和連續數據。當ANOVA結果為顯著時,利用Student-Newman-Keuls事後多重比對(Student-Newman-Keuls post-hoc multiple comparison)來確認不同的平均值。在篩選口腔鱗狀細胞癌之各生物標誌或生物標誌組合時,利用接受者操作特徵曲線(receiver operating characteristic(ROC)curve)、曲線下面積(the area under the ROC curve,AUC)、正概度比(the positive likelihood ratio,LR+)及負概度比(the negative likelihood ratio,LR-)來評估檢定效果。以ROC曲線得到的最高Youden
指數(定義為Se+Sp-1)來決定最佳截止值,其中該ROC曲線符合平滑無母數法(smooth nonparametric method)以減少數據所產生的篩選偏好。
利用三種常用以區分非疾病及疾病狀態的統計法來得到生物標誌分析組:k-最近鄰辨別法(k-nearest neighbors discrimination)、邏輯式迴歸及分類及迴歸樹(classification and regression tree,CART)。CART包含建構分析樹及修正分析樹二步驟,再利用二進制遞迴區分(binary recursive partitioning)來擬合數據。在建構分析樹時,當程序到達節點分割(splitting node),重複為各可能的預測值選擇一適當的分割點,直到產生錯誤分類的最低成本。以Hold-Out法將檢體以與人口特徵相似之2:1的比例隨機分組。以Bootstrap法重複刺激1000次,挑選測試資料組(n=224)中最佳的分析樹大小及最重要的預測因子,再以獨立的試驗組(n=106)來確認最終的分析樹形式。在建構分析樹後,將篩選標誌的連續數值(數值變數)依據其分割點的截止濃度二分為二元變數。當ANXA2、KNG1及MMP1的濃度高於截止值,或是HSPA5的濃度低於截止值時,將口腔鱗狀細胞癌的陽性預測值設定為1,否則將陰性預測值設定為0。將以CART得到之用以篩選標誌的二元變數作為邏輯式迴歸的共變量,並以下列公式計算罹患口腔鱗狀細胞癌的預測概率:風險指數=
,其中e為一數學常數,其為自然對數之基數;a為一常數值;X1、X2、X3及X4分別代表ANXA2、
HSPA5、KNG1及MMP1的濃度;且b1、b2、b3及b4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的變異係數。利用SAS來進行辨別及邏輯式迴歸,以R(v3.0.3)統計軟體rpart來進行CART。
實施例1 產生候選生物標誌分析組
1.1 篩選用以偵測口腔鱗狀細胞癌的生物標誌
由測試資料組(n=224)來篩選與口腔鱗狀細胞癌相關的生物標誌,並由試驗組(n=106)進行確認;其中該測試資料組及該試驗組是由330位受測者所組成,包含口腔鱗狀細胞癌病患(n=131)及非口腔鱗狀細胞癌個體(n=199),並以與人口特徵相似之2:1的比例隨機分組(結果未顯示)。利用邏輯式迴歸、最近鄰辨別法及分類及迴歸樹(CART)來分析所有的數據(表4)。將由CART分析篩選的四種標的蛋白作為生物標誌分析組,以偵測口腔鱗狀細胞癌,其中該四種標的蛋白包含ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1(第1A圖)。MMP1為第一生物標誌,其最能區別口腔鱗狀細胞癌個體與非口腔鱗狀細胞癌個體,在截止值為每毫升2.77奈克時,其可正確確認91位口腔鱗狀細胞癌病患中的71位(78%),僅對14產生偽陽性結果。接著將唾液中MMP1含量低於每毫升2.77奈克的個體(n=139)依據KNG1>每毫升40奈克及ANXA2>每毫升36奈克進行分類;該分析可正確確認剩餘20位口腔鱗狀細胞癌病患中的6位,
而僅對1位產生偽陽性結果。最後,將唾液中KNG1>每毫升40奈克,而ANXA2<每毫升36奈克的個體(n=59)再依據HSPA5<每毫升166.9奈克進行分析;該分析可正確確認11位口腔鱗狀細胞癌個體。因此,在測試資料組中,公式可正確辨識91個口腔鱗狀細胞癌檢體中的88個檢體,以及133個非口腔鱗狀細胞癌檢體中的106個檢體,靈敏度為96.7%,且專一性為79.7%。在試驗組中,該四蛋白分析組偵測口腔鱗狀細胞癌的靈敏度為87.5%,而專一性為78.8%。於測試資料組及試驗組的正確度分別為86.6%及82.1%(表4)。
由於吸菸及咀嚼檳榔為二種影響口腔鱗狀細胞癌發生的重要危險因子,接著利用蛋白標誌來分析年齡/吸菸/咀嚼檳榔之間的關聯性。然而,結果顯示在460個體中,四種蛋白與危險習慣並無顯著的關聯性(表5)。因此,相較於以口腔檢查進行的口腔癌篩選(專一性約為98%,不同國家具有不同的靈敏度(50%-99%)),本發明利用CART篩選的四蛋白分析組更適合用以偵測台灣口腔癌篩檢計畫中的口腔鱗狀細胞癌病患。
1.2 產生評分量表
接著,依據四種蛋白標誌的二元結果(即高於或低於內在截止值),利用邏輯式迴歸分析來計算可作為風險指數的預測概率。以Chi-square檢定評估四蛋白分析組的變異顯著性可得到MMP1、KNG1、ANXA2及HSPA5的p值分別<0.0001、<0.0001、0.0002及0.0007。在測試資料組中,該風險指數會由健康對照組的0.16±0.19,以及口腔低惡性潛能病變族群的0.18±0.29,顯著增加為口腔鱗狀細胞癌族群的0.75
±0.24(p<0.0001)(第1B圖),而於試驗組亦可得到相似的結果,其中健康對照組為0.21±0.26,口腔低惡性潛能病變族群為0.16±0.22,而口腔鱗狀細胞癌則為0.74±0.31(p<0.0001)(第1C圖)。非口腔鱗狀細胞癌檢體及口腔鱗狀細胞癌檢體的ROC分析結果指出,測試資料組及試驗組的AUC分別為0.926及0.91(第1D圖)。當將風險指數的截止值設定為0.4時,四標誌評分量表於測試資料組產生的靈敏度為93.4%,專一性為80.5%。在試驗組中,靈敏度仍然相當高(87.5%),而專一性則與測試資料組相同(80.5%)。
實施例2 多種標誌的組合
在建構CART樹後(第1A圖),將篩選標誌的連續數值(數值變數)依據其分割點的截止濃度二分為二元變數。若ANXA2、KNG1及MMP1的濃度高於截止值,或是HSPA5的濃度低於截止值時,將口腔鱗狀細胞癌的陽性預測值設定為1。相對地,若ANXA2、KNG1及MMP1的濃度低於截止值,或是HSPA5的濃度高於截止值時,則將口腔鱗狀細胞癌的陰性預測值設定為0。將以CART得到之用以篩選標誌的二元變數作為邏輯式迴歸的共變量,並以下列公式計算罹患口腔鱗狀細
胞癌的預測概率:,其中e為一數學常數,其為自然對數之基數;a為一常數值;X1、X2、X3及X4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的濃度;且b1、b2、b3及b4分別代表ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1的變異係數。將由CART分析四種篩
選標誌得到的二元變數作為共變量,利用測試資料組檢體進行邏輯式迴歸分析來得到個體罹患口腔鱗狀細胞癌的預測概率,其中該測試資料組是由非口腔鱗狀細胞癌組(健康對照+口腔低惡性潛能病變)及口腔鱗狀細胞癌組所組成。除了四標誌分析組之外,亦利用四種標誌中任二種標誌的組合來進行分析(表6)。此外,以四種篩選標誌的連續數據(數值變數)進行邏輯式迴歸分析,藉以將四種蛋白組合為四或二標誌分析組(表7)。該些結果指出,四種蛋白中每一種蛋白不論是基於二元變數或是基於數值變數所建構的四標誌分析組,皆具有顯著的意義(Sig.<0.05)。然而,在本分析中,利用HSPA5與ANXA2或MMP1結合所得到的二標誌分析組不具有顯著功效。
藉由二元變數分析(表8及9)或數值變數分析(表10及11)得到之不同標誌分析組的ROC,可用以比對非口腔鱗狀細胞癌族群(健康對照+口腔低惡性潛能病變)及口腔鱗狀細胞癌族群,比對口腔高惡性潛能病變族群及口腔鱗狀細胞癌族群,以及比對非轉形族群及口腔高惡性潛能病變病患中產生口腔鱗狀細胞癌轉形的族群。結果發現多數標誌分析組可用以辨別口腔鱗狀細胞癌與非口腔鱗狀細胞癌,或是口腔鱗狀細胞癌與口腔高惡性潛能病變(AUC 0.65-0.93),且除了二標誌分析組# 1、# 3及# 5之AUC值小於0.6(當用以辨識口腔高惡性潛能病變病患中非轉形病患與口腔鱗狀細胞癌轉形病患時)之外,其餘標誌分析組皆可用以預測口腔高惡性潛能病變病患的惡性轉形。
b.零假設:實際區域=0.5
由二元變數(表12)或數值變數(表13)分析得到不同標誌分析組的風險指數,可用以比對非口腔鱗狀細胞癌(健康對照+口腔低惡性潛能病變)族群及口腔鱗狀細胞癌族群。當風險指數的截止值設定為0.4時,具有高陰性預測值(除了2-標誌分析組# 1、# 2及# 4之外,其餘為81.9%-93.6%);設定為0.6時,具有高陽性預測值(除了3-標誌分析組# 1及2-標誌分析組# 4之外,其餘為81.4%-93.4%)。該些結果指出,將風險指數的截止值設定為0.4或0.6時,可高度準確(除了2-標誌分析組# 1、# 2及# 4之外,其餘為78.8%-86.7%)地辨別非口腔鱗狀細胞癌(健康對照+口腔低惡性潛能病變)個體及口腔鱗狀細胞癌病患。
XA為由截止濃度決定之ANXA2的二元結果(>每毫升36奈克為正)
XH為由截止濃度決定之HSPA5的二元結果(<每毫升166.9奈克為正)
XK為由截止濃度決定之KNG1的二元結果(>每毫升40奈克為正)
XM為由截止濃度決定之MMP1的二元結果(>每毫升2.772奈克為正)
實施例3 第I-IV期之口腔鱗狀細胞癌病患的風險指數
本研究包含50位第I期、29位第II期、16位第III期及36位第IV期之口腔鱗狀細胞癌病患。利用四標誌建立的評分量表來計算該些病患的風險指數。如第2圖所示,風險指數會由早期到晚期逐漸增加(第I期:0.63±0.29;第II期:0.78±0.23;第III期:0.83±0.23;以及第IV期:0.85±0.20)。更重要的是,相較於非口腔鱗狀細胞癌族群(健康對照+口腔低惡性潛能病變;平均分數為0.17±0.24),第I期口腔鱗狀細胞癌病患的風險指數會顯著上升(p<0.0001)。此外,84%(42/50)、97%(28/29)、94%(15/16)及97%(35/36)之第I、II、III及IV期的口腔鱗狀細胞癌病患具有>0.4的風險指數(表14),該結果指出四蛋白分析組的評分量表具有偵測第I期口腔鱗狀細胞癌病患之顯著族群(>80%)的良好潛力。
實施例4 口腔高惡性潛能病變病患之風險指數及其後續追蹤結果
基於第口腔高惡性潛能病變之病灶可能包含潛在性惡性細胞、惡性細胞及正常細胞的混合物,一般臨床醫療人員並不易由口腔高惡性潛能病變中辨識出口腔鱗狀細胞癌。然而,口腔高惡性潛能病變族群的平均風險指數(0.32±0.33)高於非口腔鱗狀細胞癌族群的平均風險指數(健康對照+口腔低惡性潛能病變;0.17±0.24),且低於口腔鱗狀細胞癌族群的平均風險指數(0.75±0.26)(第3圖)。值得注意的是,42%(55/130)之口腔高惡性潛能病變病的風險指數>0.4(表15)。該結果與口腔高惡性潛能病變病灶可能包含惡性細胞的推論一致。
除了需要偵測口腔鱗狀細胞癌之外,另一個重要的需求為預測及監控口腔惡性潛能病變(特別是口腔高惡性潛能病變族群)的惡性轉形。在本研究233位口
腔惡性潛能病變病患中,持續對153位(65位口腔低惡性潛能病變及88位口腔高惡性潛能病變)病患追蹤13.5到76.6個月,以了解其疾病的惡化狀況。18位口腔高惡性潛能病變族群於1.2到65.5個月之間惡性轉形為口腔鱗狀細胞癌;該些病患包含1位黏膜紅白斑、1位具有黏膜下纖維化的黏膜紅斑、1位黏膜下纖維化、1位斑點白斑症、4位疣狀增生,以及10位具有黏膜下纖維化的疣狀增生。相較之下,在口腔低惡性潛能病變族群的追蹤觀察中,並無觀察到惡性轉形。口腔低惡性潛能病變病患的惡性轉形為11.8%(18/153),該數值落在先前研究報告範圍內。利用二元變數(表16)或數值變數(表17)分析得到不同標誌分析組於口腔高惡性潛能病變族群的風險指數。相較於風險指數<0.4的病患,風險指數0.4的病患具有較高之口腔鱗狀細胞癌轉形率(除了2-標誌分析組# 1之外)。舉例來說,依據Table 16之4-標誌分析組,37位病患的風險指數0.4,其中37.8%(37位中的14位)在追蹤時轉形為口腔鱗狀細胞癌。該轉形率遠高於51位風險指數<0.4之口腔高惡性潛能病變病患(7.8%;4/51)(表16)。在18位口腔鱗狀細胞癌轉形病患中,77.8%(14/18)的風險指數>0.4。
XA為ANXA2的數值濃度(每毫升之奈克)
XH為HSPA5的數值濃度(每毫升之奈克)
XK為KNG1的數值濃度(每毫升之奈克)
XM為MMP1的數值濃度(每毫升之奈克)
不同形式之口腔惡性潛能病變病灶具有複雜的病理特性,常會使口腔鱗狀細胞癌的早期偵複雜化而不易診斷。約有1400篇文獻探討過候選蛋白,相較於健康對照個體,該些候選蛋白於口腔鱗狀細胞癌病患之體液或組織中具有較高的表現量。然而,目前尚未有分子標誌可實際應用於臨床階段來偵測早期疾病及/或提供轉形高風險病灶(即口腔高惡性潛能病變的病患)早期警戒。本研究提供了由四種蛋白所組成的分析組,該些蛋白可直接由唾液偵測,且可有效辨識台灣口腔癌篩檢計畫中口腔鱗狀細胞癌病患(包含第I期)及非口腔鱗狀細胞癌病患。該四蛋白分析組可用以評估臨床上可疑或口腔高惡性潛能病變病灶的惡性轉形風險,進而防止診斷延誤。在持續追蹤88位口腔高惡性潛能病變個體的過程中,18位於5年內罹患癌症,其中14位在首次診斷罹患口腔高惡性潛能病變時,由唾液檢體檢測出具有高風險指數(>0.4)。
本揭示內容提供可作為臨床試驗的應用基礎,其係利用本發明四標誌分析組來:(i)偵測高風險族群(例如參與台灣口腔癌篩檢計畫的個體)之口腔鱗狀細胞癌的發生;(ii)評估在臨床可疑病灶中惡性細胞出現的風險;(iii)篩選進一步追蹤觀察的口腔高惡性潛能病變病患;以及(iv)監控治療反應及復發。該四蛋白分析組可作為診斷輔助,以減少因病患或第一線醫療人員所造成
的診斷延誤。當將風險指數的截止值設定為0.4及0.6時,可分別於辨別口腔鱗狀細胞癌與非口腔鱗狀細胞癌時,產生高靈敏度(91.6%)及高專一性(90%)的辨識結果(表18),該設定值可用以偵測高風險族群的口腔鱗狀細胞癌。基於該結果,(i)高度風險指數(0.6)的個體需要再次進行活體組織切片或全面檢測隱匿性腫瘤;(ii)中度風險指數(0.4且<0.6)的個體需要每年追蹤檢查2次;(iii)低度風險指數(<0.4)的個體可依據近期追蹤計畫處理(每2年檢查1次);(iv)低風險指數(<0.4)且具有正常黏膜的個體可作為迴歸管理的重要指標,例如延長後續檢查的間隔時間。
本揭示內容的數項發現十分值得注意。在過去20年間,超過一千篇的研究在探討包含口腔鱗狀細胞癌等頭頸部癌的生物標誌。然而,僅有少數的生物標誌可應用至臨床階段。此結果反應了該些研究缺乏於充分的個體及對照檢體中,比對候選生物標誌,藉以確認可提供足夠預期值以適當引導醫療照顧的生物標誌。本揭示內容
提一種解決方法,藉由:(i)使用密集的文獻內容來篩選候選蛋白,該些候選蛋白皆經本研究或其他研究以不同形態的臨床檢體進行測式;以及(ii)比對高風險族群之罹癌(口腔鱗狀細胞癌)檢體及對照組(健康對照及口腔低惡性潛能病變)檢體,其具有相似的風險因子(吸菸或咀嚼檳榔)。四種篩選蛋白於唾液(其為口腔癌的特異性位置)的偵測靈敏度為87.5-93.4%。此外,標誌分析組可成功偵測88%(79位中的70位)罹患早期(第I或II期)口腔鱗狀細胞癌的病患,以及92%(131位中的120位)罹患口腔鱗狀細胞癌的病患。該結果指出由疾病位置非侵入式地收集唾液以檢測蛋白生物標誌來早期偵測口腔鱗狀細胞癌的可能性。
許多交互作用的因子會延誤口腔鱗狀細胞癌的診斷,影響病患的預斷結果及存活率。舉例來說,口腔鱗狀細胞癌會發生於口腔的所有組織中,而不同形式的口腔惡性潛能病變皆會使診斷變得更為複雜化。近期將口腔檢查病灶位置作為診斷的第一線方法,但該策略的成功性卻往往依據個人經驗的不同而有所差異。在某些情況下,罹患嚴重黏膜下纖維化的病患無法完全張開嘴巴來進行全面性的檢查或活體組織切片。此外,某些個體可能具有多種形式的病灶。再者,臨床上採用的病理檢驗通常侷限於單一檢體(活體組織切片),而錯失包覆於混合型口腔惡性潛能病變之病灶中的癌細胞。本發明四蛋白分析組於唾液檢體(包含由整口收集的混合物)的應用分析將可克服該些問題。
本發明蛋白分析組的專一性約為80%。未來,可進一步與其他類型的唾液癌細胞標誌(例如對腫瘤具有專一性的mRNA或DNA突變)合併使用,以提升其檢測功效。至於限制方面,本發明四組檢測族群皆僅包含少量的受試者,且所有的受測者皆由單一醫院的二個臨床單位收集而來。未來將需要由多個醫院收集更大量的檢體來進行臨床試驗,以評估四蛋白分析組於早期偵測口腔鱗狀細胞癌的功效。此外,本研究是採用回溯性樣本。未來將需要利用特定用途樣本進行前瞻性研究以評估新生物標誌分析組的臨床應用性。
對一成功的生物標誌評估研究而言,諸如多重測定、高靈敏度及專一性,以及廣泛的偵測範圍是相當重要的評估指標。在本揭示內容中,是利用LC-MRM-MS(一種用以定性及定量檢測的技術)來分析唾液中蛋白(胜肽)的含量。本研究可偵測28種候選蛋白標誌,且偵測濃度範圍為每毫升1奈克到每毫升2000奈克。偵測限制與抗體(例如使用於ELISA的抗體)的專一性一樣好,唯LC-MRM-MS可避免因偏離標的抗體作用所引發的偏差結果。
總結上述,早期偵測口腔鱗狀細胞癌對於成功及具成本效益的疾病控制,以及病患的管理相當重要。目前相關領域仍缺乏可用以臨床診斷或監控口腔鱗狀細胞癌的分子標誌。本揭示內容闡述了具臨床應用性之唾液蛋白生物標誌分析組的研發及確認結果,可用以早期偵測口腔鱗狀細胞癌及監控口腔高惡性潛能病變病患。在台灣
衛生福利部的支持下,本研究近期將進行臨床試驗,可由另外二家醫院收集更大量的口腔鱗狀細胞癌病患及口腔高惡性潛能病變病患。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例,然其並非用以限定本發明,本發明所屬技術領域中具有通常知識者,在不悖離本發明之原理與精神的情形下,當可對其進行各種更動與修飾,因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
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<160> 8
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ANXA2多肽
<400> 1
<210> 2
<211> 654
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSPA5多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KNG1多肽
<400> 3
<210> 4
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP1多肽
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ANXA2的SIS胜肽
<400> 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSPA5的SIS胜肽
<400> 6
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KNG1的SIS胜肽
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP1的SIS胜肽
<400> 8
Claims (16)
- 一種用以決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌之風險的方法,包含:(a)由該個體取得一檢體;(b)決定該檢體中至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組;(c)基於步驟(b)決定之該至少二種標的多肽的含量來計算一風險指數,其中是利用以下公式來計算該風險指數:
- 如請求項1所述之方法,其中當該風險指數低於0.4時,則該個體未罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的低風險族群;以及當該風險指數等於或高於0.4時,則該個體罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的高風險族群。
- 如請求項1所述之方法,其中該檢體為唾 液。
- 如請求項1所述之方法,其中是利用一試驗來決定該至少二種標的多肽的含量,且該試驗是選自由酵素結合免疫吸附分析試驗、利用條帶進行的快速檢測、西方墨點法、質譜分析法、蛋白微陣列、流式細胞儀分析、免疫螢光分析、免疫組織化學分析及多重探針監測試驗所組成的群組。
- 如請求項4所述之方法,其中是利用液相層析串聯質譜法以多反應監測模式來決定該至少二種標的多肽的含量。
- 一種用以決定一生物檢體是否包含癌化口腔鱗狀細胞的方法,包含:(a)決定該生物檢體中至少二種標的多肽的含量,其中該至少二種標的多肽是選自由ANXA2、HSPA5、KNG1及MMP1所組成的群組;(b)基於步驟(a)決定之該至少二種標的多肽的含量來計算一風險指數,其中是利用以下公式來計算該風險指數:
- 如請求項6所述之方法,其中當該風險指數等於或高於0.4時,則該生物檢體包含癌化口腔鱗狀細胞。
- 如請求項6所述之方法,其中該檢體為唾液。
- 如請求項6所述之方法,其中是利用一試驗來決定該至少二種標的多肽的含量,且該試驗是選自由酵素結合免疫吸附分析試驗、利用條帶進行的快速檢測、西方墨點法、質譜分析法、蛋白微陣列、流式細胞儀分析、免疫螢光分析、免疫組織化學分析及多重探針監測試驗所組成的群組。
- 如請求項9所述之方法,其中是利用液相層析串聯質譜法以多反應監測模式來決定該至少二種標的多肽的含量。
- 一種用以決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌之風險的藥學套組,包含至少二試劑,其中該至少二試劑中的各試劑皆為一以同位素標記的多肽,且包含選自由序列編號:5、6、7及8所組成之組群的胺基酸序列。
- 一種如請求項11所述之藥學套組的用途,其係用以決定一個體是否罹患口腔鱗狀細胞癌或有罹患口腔鱗狀細胞癌的風險。
- 如請求項12所述之用途,其中該至少二 試劑可用以決定該個體體內至少二種標的多肽的含量,藉以計算一風險指數,其中是利用以下公式來計算該風險指數:
- 如請求項13所述之用途,其中是利用一試驗來決定該至少二種標的多肽的含量,且該試驗是選自由酵素結合免疫吸附分析試驗、利用條帶進行的快速檢測、西方墨點法、質譜分析法、蛋白微陣列、流式細胞儀分析、免疫螢光分析、免疫組織化學分析及多重探針監測試驗所組成的群組。
- 如請求項14所述之用途,其中是利用液相層析串聯質譜法以多反應監測模式來決定該至少二種標的多肽的含量。
- 如請求項13所述之用途,其中當該風險指數低於0.4時,則該個體未罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的低風險族群;以及當該風險指數等於或高於0.4時,則該個體罹患口腔鱗狀細胞癌或為罹患口腔鱗狀細胞癌的高風險族群。
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2010年06月17日,Expression of MMP-1 in histopathological different grades of oral squamous cell carcinoma and in normal buccal mucosa – an immunohistochemical study,Cancer Biomarkers, vol. 7, no. 6, pp. 275-283, 2010 |
2013年11月,Comparative proteomic analysis of oral squamous cell carcinoma and adjacent non-tumour tissue from Thailand,Arch Oral Biol. 2013 Nov;58(11):1677-85. |
2015年09月13日,Saliva proteome profiling reveals potential salivary biomarkers for detection of oral cavity squamous cell carcinoma, Proteomics 2015, 15, 3394–3404 |
年06月17日,Expression of MMP-1 in histopathological different grades of oral squamous cell carcinoma and in normal buccal mucosa – an immunohistochemical study,Cancer Biomarkers, vol. 7, no. 6, pp. 275-283, 2010 2013年11月,Comparative proteomic analysis of oral squamous cell carcinoma and adjacent non-tumour tissue from Thailand,Arch Oral Biol. 2013 Nov;58(11):1677-85. 2015年09月13日,Saliva proteome profiling reveals potential salivary biomarkers for detection of oral cavity squamous cell carcinoma, Proteomics 2015, 15, 3394–3404 * |
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