CN110755884B - 一种反向吸附提取生物产品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反向吸附提取生物产品的方法。本发明利用大孔吸附树脂，通过反向上柱吸附的方式从含有细胞及菌丝体碎片的生物产品液体中直接提取弱极性或非极性产品，且提取的产品纯度高。本发明方法不仅克服了传统生物产品提取中使用有机溶媒萃取所带来的一系列弊端，而且解决了传统树脂分离中对上柱液要求严苛的矛盾。本发明技术工艺简单，对产品的选择吸附性强，产品质量好，生产废弃物产生量少；同时，本发明可帮助实现部分生物产品的在线提取和连续生产。

Description

一种反向吸附提取生物产品的方法

技术领域

本发明涉及生化技术领域，具体涉及到一种反向吸附提取生物产品的方法。

背景技术

生物转化和酶催化是生产药物及药物中间体的两种重要方法，由于上述方法具有污染小、立体选择性高的特点，目前许多产品的化学合成方法正在被逐步替代。虽然，现有技术中固定化细胞、固定化酶技术已在某些生物产品生产中得到应用，某些液体酶也以澄清液体的形式被使用，但基于生物催化剂的不稳定性，因此，大部分生物催化剂是以整细胞或全菌体破碎液的形式参与生物反应，反应结束后将产品从反应体系中提取出来变得十分困难。而生物转化和酶催化方法生产的大部分产品分子量较大、极性低、水溶性小，因此，利用有机溶媒萃取成为了生物产品提取过程中普遍使用和最经典的方法。然而，有机溶媒萃取会产生乳化现象，乳化现象中产生的水溶性杂质则会影响产品质量，而且提取母液中残留的部分有机溶媒还会给污水处理***带来沉重压力。

树脂分离方法也被用于生物产品提取，但传统的上柱液必须是澄清液体，否则会造成树脂柱堵塞。生产上一般采用过滤的方法去除生物产品液体中的菌丝体等固体物质，但必须添加絮凝剂进行预处理；由于一般絮凝剂的最佳使用PH范围在中性至微酸性附近，因此，当生物产品液体中含有固体产品时，这种方法是不适宜的，同时，过滤产生的大量滤饼不可避免地夹带部分产品，对产品收率也会有一定的影响。

目前，实验过程中通常采用的树脂分离方法其树脂的上柱方式一般是正向上柱，即上柱液从树脂柱的上部进入，从底部流出。正向上柱的优点是产品在树脂柱上具有清晰的层析分布、交换饱和度高、产品质量好，但交换周期长、对上柱液要求质量高。上柱液从树脂柱的底部进入、从上部排出称为反向上柱，一般认为反向上柱存在着层析分布不明显、吸附量低的缺陷，因此，反向上柱方法无论是在生产中还是在科研中都未发现当前正在实际应用的报道。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种反向吸附提取生物产品的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种反向吸附提取生物产品的方法，包括如下步骤：

步骤1）：生物产品液体经过60-120目滤网过滤，调整PH；

步骤2）:树脂柱内部上下两端设置40-60目滤网，防止树脂填料流失；

步骤3）：以反向上柱方式上柱吸附，上柱流速为3-5BV/h；收集过柱液，过柱液进污水处理厂处理；

步骤4）：当树脂吸附量达到饱和吸附量的60%-70%，切换，用去离子水进行反向冲洗，冲洗速率3-6BV/h，冲洗时间0.5-2h；

步骤5）：解吸，解吸速率0.5-2BV/h；收集解吸液，提取产品。

优选地，步骤1）中生物产品为中极性物质、弱极性物质或非极性物质。

优选地，步骤1）中生物产品液体来源为生物转化液、酶催化反应液或生物发酵液。

优选地，步骤1）中生物产品液体为水相，不含有机溶媒。

优选地，步骤2）中使用的填料为大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂为中极性大孔吸附树脂、弱极性大孔吸附树脂或非极性大孔吸附树脂。

优选地，步骤2）中树脂柱的茎高比为1:8-14。

优选地，步骤2）中树脂柱使用形式为单柱使用或多柱串联使用。

优选地，步骤4）中冲洗结束的指标：冲洗流出液澄清透明。

优选地，步骤5）中解吸方式包括正向解吸或反向解吸。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

树脂的粒度范围一般在300-1000微米，而生物产品液体中的细胞或破碎菌丝体的大小在微米级及亚微米级，本申请中较高的上柱速率和冲洗速率使树脂颗粒呈半悬浮状态，因此，本申请吸附过程中不会产生树脂柱堵塞的问题。大孔吸附树脂的内部孔径一般在几纳米到几十纳米，只有分子级别大小的物质才可以进入树脂内部，因此，生物产品液体中的悬浮固体物质不会影响树脂对产品的吸附。树脂柱较大的茎高比或树脂柱的串联使用，使待提取的生物产品液体得到充分的吸附，提高了产品的吸附效果和产品回收率。

本发明利用反向吸附方法，成功完成了两个机理方向的分离：100 纳米以上的物质，包括几乎所有的细胞和菌丝体碎片，因不能够进入树脂颗粒内部被吸附而流经树脂颗粒间隙，随过柱液排出；进入树脂颗粒内部的中型分子量及小型分子量物质，除产品外几乎都具有较高的极性和亲水性而不被吸附，最终也随过柱液和冲洗水流出，从而完成对待提取产品的高效吸附分离。

许多生物产品属于弱酸性或弱碱性物质，它们的溶解度和极性随着PH的改变而发生一定的变化。本发明通过对生物产品液体PH的调整，将被提取产品极性控制在理想的水平，再通过选择合适极性水平的吸附树脂进行吸附，从而完成对产品的精准吸附分离。已有充分的实验数据证实，能够利用有机溶媒进行萃取的生物产品，几乎都可以用吸附树脂进行分离提取。

本发明通过大孔吸附树脂对非高极性的生物产品进行反向吸附提取，解吸后用去离子水进行冲洗即完成了树脂的再生，生产废弃物减少到最小程度。

本发明利用反向上柱的方式对含有细胞或菌丝体碎片的生物产品液体直接进行吸附提取，不但简化了生产工艺，还获得了高纯度的产品；此外，利用本发明提供的反向吸附技术还有望实现某些产品的在线提取、连续提取及连续生产。

具体实施方式

实施例一：

⑴生物转化液体的制备：刺盘孢菌在30L发酵培养基中培养18h，加入无菌处理的固体去氢表雄酮（普拉睾酮）80g，通气流量1.8Nm³/h，温度29℃，生物转化30h左右，TLC检测，转化完毕即结束培养，得生物转化液。HPLC检测生物转化液，去氢表雄酮未检出，7-羟基去氢表雄酮未检出，双羟基普拉睾酮（7α,15α-二羟基雄烯醇酮）2.21mg/ml；将该上述生物转化液加入60L去离子水稀释，而后用胶体磨进行第一次破碎，之后再用高压均质机进行第二次破碎，其中均质压力为60MP，使双羟基普拉睾酮产品从菌丝体中充分释放出来，得待检测的生物产品液体。

⑵反向吸附提取生物产品的方法，包括以下步骤：

步骤1）：取上述待检测的生物产品液体4800ml，进行HPLC检测，检测结果为双羟基普拉睾酮含量0.73mg/ml；将待检测的生物产品液体经过120目滤网过滤，检测滤液PH为6.64，用液碱调节PH至7.2；

步骤2）：采用规格为θ22×400的树脂柱，在树脂柱内底部固定60目不锈钢滤网，在该不锈钢滤网上方装入80ml非极性大孔吸附树脂，在非极性大孔吸附树脂上部预留50mm高度的空间后固定另一个60目不锈钢滤网；该步骤中将树脂柱上口用带有排液胶管的橡胶塞密封，将树脂柱下口安装1m左右长度的乳胶管作为上柱液入口；

步骤3）：将步骤1）中经过滤处理的生物产品液体利用步骤2）中处理好的树脂柱进行反向上柱吸附，上柱流速300ml/h；收集过柱液，泵入污水处理厂处理；

步骤4）：树脂吸附量达到饱和吸附量的60%-70%，上柱完毕；用去离子水反向冲洗，冲洗速率400ml/h,冲洗0.5h后冲洗流出液澄清，冲洗结束；

步骤5）：用丙酮正向解吸，流速80ml/h，解吸液起始的40ml弃去，收集之后解吸液340ml，树脂柱用去离子水200ml正向冲洗再生；解吸液回收丙酮，浓缩体积减小至20ml左右时停止蒸馏，降温至4-8℃结晶，过滤，干燥，得产品3.15g，双羟基普拉睾酮含量为98.7%。

实施例二：

⑴生物转化液体的制备：与实施例一中生物转化液体的制备方式相同。

⑵反向吸附提取生物产品的方法，包括以下步骤：

步骤1）：取实施例二中制备的待检测的生物产品液体4000ml，100目滤网过滤，用液碱调节PH至7.15；

步骤2），采用规格为θ22×400的树脂柱，在树脂柱内底部固定40目不锈钢滤网，而后在不锈钢滤网上方装入70ml非极性大孔吸附树脂，在非极性大孔吸附树脂上部预留60mm高度的空间，然后固定另一个40目不锈钢滤网；该步骤中用橡胶塞和橡胶管将上述两个同样树脂柱串联，将上部树脂柱上口用带有排液胶管的橡胶塞密封，将下部树脂柱下口安装1.5m左右长度的乳胶管作为上柱液入口；

步骤3）：将步骤1）中经过滤处理的生物产品液体利用步骤2）中处理好的树脂柱进行反向上柱吸附，上柱流速350ml/h；收集过柱液，过滤液进污水处理厂处理；

步骤4）：树脂吸附量达到饱和吸附量的60%-70%，上柱完毕；将两个串联的树脂柱分离，上部的树脂柱直接用于下一批的一级上样柱，下部树脂柱用去离子水反向冲洗，流速400ml/h, 冲洗0.5h后流出液澄清，冲洗结束；

步骤5）：用丙酮正向解吸，流速70ml/h，开始解吸液35ml弃去，收集之后解吸液300ml，树脂柱用去离子水200ml正向冲洗再生；解吸液回收丙酮，蒸干得固体，收集固体用60ml 4℃正庚烷搅拌洗涤，过滤，干燥，得产品2.78g，双羟基普拉睾酮含量为99.3%。

实施例三：

⑴生物转化液体的制备：将7-β脱氢酶复合葡萄糖脱氢酶基因重组于工程大肠杆菌内，培养，离心收集菌体；取100g质量份数的菌体重悬于400g去离子水中，超声波破碎得到全菌体酶液，加入葡萄糖25g，加入7-酮基石胆酸 10g，催化反应8h，得到熊去氧胆酸反应液627ml，熊去氧胆酸含量15.15mg/ml；

⑵反向吸附提取生物产品的方法，包括以下步骤：

步骤1）：取熊去氧胆酸反应液300ml，加入300ml去离子水，用液碱调节至PH值为9.0，80目滤网过滤；

步骤2），采用规格为θ22×400的树脂柱，在树脂柱内底部固定40目不锈钢滤网，而后在不锈钢滤网上方装入80ml中极性大孔吸附树脂，中极性大孔吸附树脂上部预留60mm高度的空间，然后固定另一个40目不锈钢滤网；该步骤中将树脂柱上口用带有排液胶管的橡胶塞密封，树脂柱下口安装1m左右长度的乳胶管作为上柱液入口；

步骤3）：将步骤1）中经过滤处理的熊去氧胆酸反应液利用步骤2）中处理好的树脂柱进行反向上柱吸附，上柱流速300ml/h；收集过柱液，过滤液进污水处理厂处理；

步骤4）：树脂吸附量达到饱和吸附量的60%-70%，上柱完毕；用去离子水反向冲洗，冲洗速率400ml/h,冲洗0.5h后冲洗流出液澄清，冲洗结束；

步骤5）：用50%乙醇溶液反向解吸，流速60ml/h，收集全部解吸液300ml，树脂柱用去离子水200ml正向冲洗再生；解吸液回收乙醇，浓缩至体积180ml时停止，用硫酸调节至PH值为2.5，结晶4h，过滤，干燥，得熊去氧胆酸产品4.43g，熊去氧胆酸含量为98.9%。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种反向吸附提取生物产品的方法，其特征在于：生物转化液体的制备：刺盘孢菌在30L发酵培养基中培养18h，加入无菌处理的固体去氢表雄酮80g，通气流量1.8Nm³/h，温度29℃，生物转化30h左右，TLC检测，转化完毕即结束培养，得生物转化液；

HPLC检测生物转化液，去氢表雄酮未检出，7-羟基去氢表雄酮未检出，双羟基普拉睾酮2.21mg/ml；将该上述生物转化液加入60L去离子水稀释，而后用胶体磨进行第一次破碎，之后再用高压均质机进行第二次破碎，其中均质压力为60MP，使双羟基普拉睾酮产品从菌丝体中充分释放出来，得待检测的生物产品液体；

反向吸附提取生物产品的方法，包括如下步骤：

步骤1）：取待检测的生物产品液体4000ml，100目滤网过滤，用液碱调节PH至7.15；

步骤2）：采用规格为θ22×400的树脂柱，在树脂柱内底部固定40目不锈钢滤网，而后在不锈钢滤网上方装入70ml非极性大孔吸附树脂，在非极性大孔吸附树脂上部预留60mm高度的空间，然后固定另一个40目不锈钢滤网；该步骤中用橡胶塞和橡胶管将上述两个同样树脂柱串联，将上部树脂柱上口用带有排液胶管的橡胶塞密封，将下部树脂柱下口安装1.5m左右长度的乳胶管作为上柱液入口；

步骤3）：将步骤1）中经过滤处理的生物产品液体利用步骤2）中处理好的树脂柱进行反向上柱吸附，上柱流速350ml/h；收集过柱液，过滤液进污水处理厂处理；

步骤4）：树脂吸附量达到饱和吸附量的60%-70%，上柱完毕；将两个串联的树脂柱分离，上部的树脂柱直接用于下一批的一级上样柱，下部树脂柱用去离子水反向冲洗，流速400ml/h, 冲洗0.5h后流出液澄清，冲洗结束；

步骤5）：用丙酮正向解吸，流速70ml/h，开始解吸液35ml弃去，收集之后解吸液300ml，树脂柱用去离子水200ml正向冲洗再生；解吸液回收丙酮，蒸干得固体，收集固体用60ml 4℃正庚烷搅拌洗涤，过滤，干燥，得产品2.78g，双羟基普拉睾酮含量为99.3%。