CN110736836B - 一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒 - Google Patents
一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒,具体地,提供的他克莫司检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品,其中试剂R1包含他克莫司蛋白复合物、防腐剂、表面活性剂、稳定剂及缓冲液;试剂R2包含结合有抗他克莫司单克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、表面活性剂、稳定剂及缓冲液;校准品包含防腐剂、类全血基质、他克莫司纯品。本发明采用单克隆抗体包被胶乳颗粒与蛋白复合物发生反应的方法保证了试剂盒的高灵敏度和宽线性范围,同时还具有准确度高、重复性好、特异性强、操作简单等优点,可用于临床常用的全自动生化分析仪。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂领域,特别地,本发明涉及一种测定全血中他克莫司的试剂盒。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus)又名FK506,是从链霉菌属(streptomyces tsukubaensis)中分离出的发酵产物,其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强力的新型免疫抑制剂,主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放,全面抑制T淋巴细胞的作用,较环孢素(CsA)强100倍。近年来,作为肝、肾移植的一线用药,已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明,其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎(AD)、***性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。
由于不同患者对FK506的吸收和代谢往往表现出很大的个体差异,即使使用相同的药物剂量,不同患者的FK506血药浓度也常差异显著;由于FK506的肝、肾毒性及其狭窄的治疗剂量范围,FK506的药效与药毒均与血药浓度密切相关,因此,准确检测FK506的血药浓度对于控制FK506的药毒性和发挥FK506的抗排斥作用均具有重要参考价值。
目前,检测FK506血药浓度的方法主要有高效液相-质谱联用(HPLC-MS)、微粒子酶免疫测定(MEIA)、化学发光微粒子免疫测定(CMIA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中HPLC-MS法测定血药浓度准确、灵敏,但其操作繁琐,检测时间长,检测成本高,需要昂贵设备,主要用于科研领域或作为一种参考方法。MEIA和CMIA是目前常用的检测方法,其检测自动化程度高,检测结果准确,但试剂价格昂贵,需要使用配套的仪器。酶联免疫吸附法则存在检测时间长,操作复杂,重复性差等缺点。胶乳增强免疫比浊法具有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪等优点,如能开发出可在全自动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂用于检测全血中他克莫司,将为临床他克莫司作为免疫抑制剂的使用提供强有力的支持。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点,提供一种具有高灵敏度和宽线性范围的他克莫司检测试剂盒,同时还具有测值准确,操作简单、快速可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点,所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品,其中
a)试剂R1包含他克莫司蛋白复合物、防腐剂、稳定剂和缓冲液;
b)试剂R2包含结合有抗他克莫司单克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲液;
c)校准品包含防腐剂、他克莫司纯品和牛全血基质。
优选的,本发明中的他克莫司蛋白复合物是环他克莫司与BSA偶联产生
优选的,本发明中聚苯乙烯胶乳微球交联他克莫司单克隆抗体。
本发明的技术方案是将他克莫司抗体交联在聚苯乙烯胶乳微球表面,与他克莫司蛋白复合物反应,带动聚苯乙烯胶乳微球聚集产生一定浊度,而全血中的他克莫司将竞争的结合聚苯乙烯微球表面的单克隆抗体,因此浊度与全血中的他克莫司在一定范围成反比,可以用全自动生化仪在400-800nm波长下检测他克莫司的含量。
本发明所述试剂R1中的缓冲液1选自MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液中的一种或几种,其pH为5.5~8.0,浓度为25~200mmol/L;所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、硼砂缓冲液缓冲液中的一种或几种,其pH为7.0~9.0,浓度为25~200mmol/L。
本发明所述试剂R1中的稳定剂采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用:其中离子稳定剂为NaCl、KCl或者MgCl2等一种或几种,含量为1%~2%;悬浮稳定剂为PEG8000、PEG6000或者葡萄糖,含量为2%~5%
本发明所述试剂R2中的稳定剂2选用离子稳定剂NaCl、KCl或者K2SO4中一种或几种,含量为0.5%~5%
本发明所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300;所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300;所述校准品中的防腐剂3为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300。
本发明所诉试剂R2中的采用表面官能团为羧基的聚苯乙烯胶乳微球,粒径为200nm~400nm。
本发明所述试剂R2中的他克莫司抗体为鼠单克隆抗体。
本发明所述试剂R2中的表面活性剂剂为Tween-20,含量为0.05%~2%。
本发明所述试剂R2中的保护剂为牛血清白蛋白,含量为0.5%~5%
本发明所述校准品中采用冻融2~5次的牛全血作为基质。
本发明所述的一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)试剂R1的制备:将他克莫司100~200mg,琥珀酸酐25~50mg,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)5~10mg,二氯甲烷(DCM)4~6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相(注:用酸洗,需要的有机相在下层);再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相(注:用饱和NaCl洗,需要的有机相在上层)。负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥。称取5~10mg产物,加入200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),继续加入2~3mg EDCI,10~20mg NHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200uL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物。再在缓冲液1中加入他克莫司蛋白复合物、稳定剂1、防腐剂1搅拌混合均匀,即得试剂R1;
(2)试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.01%~0.1%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入0.5~2%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,最后用包括、稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬。
(3)校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融2~5次后过滤,加入0.05%~0.1的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品。得到不同浓度的他克莫司校准品
本发明采用6点定标法,以样条函数作为计算模式,绘制出校准曲线。
本发明所述的试剂盒,用于测定全血中他克莫司,与现有技术相比,具有特异性好、灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点;另外,进行检测时操作简便适用于全自动生化分析仪,大幅度提高了检测效率。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1:
一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂他克莫司试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)将他克莫司100mg,琥珀酸酐40mg,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)10mg,二氯甲烷(DCM)6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相(注:用酸洗,需要的有机相在下层);再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相(注:用饱和NaCl洗,需要的有机相在上层)。负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥。称取10mg产物,加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),继续加入3mg EDCI,20mg NHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200uL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物。再按照如下浓度配置试剂R1:
(2)试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.05%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入1%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,最后用包括、稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下:
(3)校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融3次后过滤,加入0.05%的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品。得到不同浓度的他克莫司校准品
实施例2:
一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂他克莫司试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)将他克莫司200mg,琥珀酸酐50mg,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)10mg,二氯甲烷(DCM)6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相(注:用酸洗,需要的有机相在下层);再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相(注:用饱和NaCl洗,需要的有机相在上层)。负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥。称取10mg产物,加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),继续加入1.5mg EDCI,10mgNHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200uL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物。再按照如下浓度配置试剂R1:
(2)试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.05%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入1%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,最后用包括、稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下:
(3)校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融3次后过滤,加入0.05%的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品。得到不同浓度的他克莫司校准品
实施例3:
一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂他克莫司试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)将他克莫司100mg,琥珀酸酐35mg,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)10mg,二氯甲烷(DCM)4mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相(注:用酸洗,需要的有机相在下层);再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相(注:用饱和NaCl洗,需要的有机相在上层)。负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥。称取10mg产物,加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),继续加入1.5mg EDCI,10mgNHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200uL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物。再按照如下浓度配置试剂R1:
(2)试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.05%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入1%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,最后用包括、稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下:
(3)校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融2~5次后过滤,加入0.05%的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品。得到不同浓度的他克莫司校准品
实施例4:
一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法检测全血中免疫抑制剂他克莫司试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)将他克莫司100mg,琥珀酸酐35mg,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)5mg,二氯甲烷(DCM)4mL放入瓶中室温搅拌反应10小时。加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相(注:用酸洗,需要的有机相在下层);再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相(注:用饱和NaCl洗,需要的有机相在上层)。负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥。称取10mg产物,加入200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),继续加入1.5mg EDCI,10mgNHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白(BSA)的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200uL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物。再按照如下浓度配置试剂R1:
(2)试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.05%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入1%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,最后用包括、稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬,具体浓度如下:
(3)校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融3次后过滤,加入0.05%的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品。得到不同浓度的他克莫司校准品
测试结果:
对上述4个实施例及对比例制备的试剂用贝克曼AU480全自动生化仪进行测试,测试波长为600nm,取样本或校准品4uL,再加入160uL的试剂R1,37℃恒温5min,然后加入40ul试剂R2,20s后读取吸光度A1,37℃孵育4分40秒后读取吸光度A2,则反应吸光度ΔA=A2-A1;首先使用标准品进行多点定标,并用样条函数进行计算,得到定标曲线。样本通过其吸光度变化,与标准曲线进行对比即可得到样本中PCT浓度。对上述4个实施例和对比例进行了分析灵敏度、准确度、精密性以及稳定性等进行了验证,验证结果
如表1所示:
根据其测试结果可知,在本发明参数范围内制得的检测试剂,均能够具备较好的分析灵敏度、准确度、精密性和稳定性,其中实施2为最优实施例,可以最好地提高试剂测试效果。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
Claims (2)
1.一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒,包含如下制备步骤:
(1) 将他克莫司200mg,琥珀酸酐50mg,4-二甲基氨基吡啶10mg,二氯甲烷6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时;加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相;再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相;负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥;称取10mg 产物,加入200μL N,N-二甲基甲酰胺,继续加入1.5mg EDCI,10mg NHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200μL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物;再按照如下浓度配置试剂R1:1mL/L他克莫司蛋白复合物,32g/L PEG-6000,5.33g/L MES一水合物,10g/L KCl,10g/L BSA,4.5g/L MgCl2,5mL/L 10%NaN3溶液;
(2) 试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.05%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入1%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,按照以下浓度用包括稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬:1mL/L标记抗体的微球,11.915g/L HEPES,10g/LKCl,10g/L BSA,1g/L Tween-20,5mL/L 10%NaN3溶液;
(3) 校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融3次后过滤,加入0.05%的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品;得到不同浓度的他克莫司校准品。
2.一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包含如下制备步骤:
(1) 将他克莫司200mg,琥珀酸酐50mg,4-二甲基氨基吡啶10mg,二氯甲烷6mL放入瓶中室温搅拌反应10小时;加入2倍体积0.1N盐酸洗涤2次,取有机相;再加入2倍体积饱和NaCl溶液,洗涤3次,取有机相;负压抽干,然后再加入少量二氯甲烷,再次抽干,尽量使产物干燥;称取10mg 产物,加入200μL N,N-二甲基甲酰胺,继续加入1.5mg EDCI,10mg NHS搅拌反应10min;在另一西林瓶中加入10mL含有20mg牛血清白蛋白的MES缓冲液,混匀;磁搅拌下,取200μL活化好的他克莫司的DMF溶液,缓慢滴加至含有BSA的溶液中,室温反应5小时,纯化即得到他克莫司蛋白复合物;再按照如下浓度配置试剂R1:1mL/L他克莫司蛋白复合物,32g/L PEG-6000,5.33g/L MES一水合物,10g/L KCl,10g/L BSA,4.5g/L MgCl2,5mL/L 10%NaN3溶液;
(2) 试剂R2的制备:用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.05%的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后12000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入他克莫司单克隆抗体,37℃下搅拌反应60min,再加入1%BSA作为封闭剂反应60min,将得到的反应液12000rpm离心、洗涤,按照以下浓度用包括稳定剂2、防腐剂2和表面活性剂2的缓冲液2将胶乳重悬:1mL/L标记抗体的微球,11.915g/L HEPES,10g/LKCl,10g/L BSA,1g/L Tween-20,5mL/L 10%NaN3溶液;
(3) 校准品的制备:将新鲜抗凝牛全血反复冻融3次后过滤,加入0.05%的防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品;得到不同浓度的他克莫司校准品。
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