CN114859063A - 一种免疫球蛋白g4检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免疫球蛋白G4检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒由第一试剂R1和第二试剂R2组成：第一试剂R1包括浓度为25～200mmol/L的两性离子缓冲液、5～10g/L无机盐、0.5w%～5w%表面活性剂1以及0.05w%～1w%防腐剂；第二试剂R2包括浓度为25～200mmol/L两性离子缓冲液、5～10g/L无机盐、50～100g/L蔗糖、50～100g/L海藻糖、0.5w%～5w%表面活性剂2、1w%～5w%的被载体分子标记的偶联有免疫球蛋白G4单克隆抗体的胶乳微球、1w%～5w%封闭剂以及0.05w%～1w%防腐剂。本发明的试剂盒具有偶联效率高、灵敏度高、抗钩状效应等优点。

Description

一种免疫球蛋白G4检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种免疫球蛋白G4检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
人免疫球蛋白G4是免疫球蛋白G的一个亚型，占总免疫球蛋白G的4％-5％，相比于其他免疫球蛋白G亚型，免疫球蛋白G4浓度含量较低。但免疫球蛋白G4升高或降低，可见于多种免疫***疾病。免疫球蛋白G4相关疾病是近年来新发现的一类病因不明的慢性、进行性炎症伴纤维化和硬化的疾病，主要特征为血清免疫球蛋白G4水平显著增高；受累器官组织由于大量淋巴细胞和免疫球蛋白G4阳性浆细胞浸润伴纤维化而发生肿大或结节/硬化性病变。在免疫球蛋白G4相关性疾病诊治中国专家共识(2021版)中明确指出血清免疫球蛋白G4升高是免疫球蛋白G4-RD诊断和病情评估的重要指标。因此，血清免疫球蛋白G4浓度的检测具有一定的临床价值。
目前免疫球蛋白G4的测定方法有酶联免疫吸附法、荧光免疫层析法、免疫层析胶体金法、化学发光法、免疫比浊法、胶乳增强免疫比浊法等。由于免疫球蛋白G4在结构上与免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2、免疫球蛋白G3具有高度同源性，故试剂盒需要具备较高的特异性，此外由于免疫球蛋白G4在健康人体内水平较低，而免疫球蛋白G4高值具有临床意义，因此试剂盒需同时具备高灵敏度、线性和抗钩状(HOOK)效应的特性。
根据现有的技术，酶免法虽价格廉价，但定量测定结果不稳定且耗时较长；荧光免疫层析法虽然检测快，但对样本量要求大，重复性差；免疫层析胶体金法测定仪器便宜，但是测定结果不够准确；化学发光法灵敏度较高，但试剂的稳定性较差；普通免疫比浊法易发生交叉反应，且试剂用量较大；胶乳增强免疫比浊法相比于酶联免疫吸附法、免疫层析法等方法学具有更好的测试稳定性、准确性，检测通量高。然而在胶乳增强免疫比浊试剂制备过程中，抗体与微球的偶联存在很大的随机性，若连接的抗体无效，则大大降低了试剂的灵敏度。在CN106771251A中采用糖基化修饰抗体的方法，该方法虽能提高试剂灵敏度，但试剂盒开瓶稳定性较差，且制备工艺较复杂难控。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫球蛋白检测试剂盒及其制备方法，主要解决现有技术中存在的检测速度慢、灵敏度不高、重复性差、出现HOOK效应等技术问题。
本发明的技术方案如下：
本发明的一种免疫球蛋白G4检测试剂盒，其特征在于，由第一试剂R1和第二试剂R2组成：
所述第一试剂R1，包括浓度为25～200mmol/L的两性离子缓冲液、5～10g/L无机盐、0.5w％～5w％表面活性剂1以及0.05w％～1w％防腐剂；
所述第二试剂R2，包括浓度为25～200mmol/L两性离子缓冲液、5～10g/L无机盐、50～100g/L蔗糖、50～100g/L海藻糖、0.5w％～5w％表面活性剂2、1w％～5w％的被载体分子标记的偶联有免疫球蛋白G4单克隆抗体的胶乳微球、1w％～5w％封闭剂以及0.05w％～1w％防腐剂；
所述两性离子缓冲液为2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2[(2-氨基-2氧代乙基)氨基]乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)(HEPES)中的一种或几种；
所述无机盐为氯化钠或/和氯化钾；所述防腐剂为叠氮化钠或者ProClin-300；
所述表面活性剂1为吐温-20、曲拉通X-100、曲拉通X-405或司盘-20中的一种或几种；所述表面活性剂2为聚氧乙烯醚Brij58(CAS号：9004-95-9)、月桂酰聚果糖、非离子表面活性剂A60中的一种或几种；
所述胶乳微球为粒径为50～100nm、100～300nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球的一种或几种，所述免疫球蛋白G4单克隆抗体在所述胶乳微球上的载量为(5～50):1；所述载体分子为牛血清白蛋白、聚赖氨酸或天冬氨酸的一种或几种；
所述封闭剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、吐温-20中的一种或几种。
优选地，所述第一试剂R1和第二试剂R2的pH为6.0～8.0。
本发明所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，分别在两种不同粒径的胶乳微球表面偶联载体分子，再与还原后的抗体进行定向偶联，生成所述被载体分子标记的偶联有免疫球蛋白G4单克隆抗体的胶乳微球。
更具体地，本发明所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，取定量的所述两性离子缓冲液溶于纯化水，然后加入所述无机盐和防腐剂；搅拌均匀后，调节pH值到6.0～8.0，然后加入所述表面活性剂1，搅拌溶匀后定容，作为第一试剂R1；
S2，(1)将定量的所述缓冲液溶于纯化水，再加入所述无机盐、蔗糖、海藻糖和防腐剂；搅拌均匀后，调节pH值到6.0～8.0，然后加入所述表面活性剂2，搅拌溶匀后定容，得到胶乳微球稀释液；(2)取粒径为50～100nm的所述胶乳微球，溶于活化缓冲液中；再依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，室温振荡反应0.5～1h；再离心去除上清液，用交联缓冲液重悬沉淀物，获得活化胶乳微球；(3)向所述活化胶乳微球中加入所述载体分子，室温振荡反应1～4h；加入封闭剂，继续反应0.5～1h；用所述交联缓冲液洗涤并离心去除上清液，用所述胶乳微球稀释液重悬沉淀物，获得胶乳微球-载体分子复合物，置于2～8℃下保存备用；
S3，取所述胶乳微球-载体分子复合物溶于所述活化缓冲液中，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，室温振荡反应0.5～1h；离心去除上清液，用所述交联缓冲液重悬沉淀物，获得活化的胶乳微球-载体分子复合物；
取免疫球蛋白G4单克隆抗体与还原剂混合于pH值为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，室温还原30～120min，离心去除多余还原剂，加入0.1w％～0.3w％碘乙酰胺，室温封闭巯基30～60min，得到还原的抗体；
S4，向所述活化的胶乳微球-载体分子复合物中加入所述还原的抗体，室温振荡反应1～4h，加入封闭剂，继续反应0.5～1h；用交联缓冲液洗涤，离心去除上清液，用胶乳微球稀释液重悬沉淀物，获得粒径为50～100nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂；
S5，取粒径为200～300nm的胶乳微球，重复步骤S2～S5，获得粒径为200～300nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂；
S6，将粒径为50～100nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂与粒径为200～300nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂按(1.5～3.5)：1的比例混合，作为第二试剂R2；
S7，将所述第一试剂R1和所述第二试剂R2组合，即得所述免疫球蛋白G4检测试剂盒。
优选地，在所述步骤S2中，所述胶乳微球与所述活化缓冲液的质量比为1:(5～20)；所述胶乳微球的质量，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的质量和之比为1：(0.01～0.2)；所述载体分子与所述胶乳微球的质量比为(5～50):1。
优选地，在所述步骤S3中，所述胶乳微球-载体分子复合物与所述活化缓冲液的质量比为1:(5～20)；所述胶乳微球-载体分子复合物的质量，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的质量和之比为1：(0.01～0.2)。
优选地，在所述步骤S3中，所述免疫球蛋白G4单克隆抗体与所述还原剂的质量比为1：(5～15)；所述还原剂为β-巯基乙醇(ME)、二硫苏糖醇(DTT)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)中的一种。
优选地，在所述步骤S4中，所述还原抗体与胶乳微球的质量比为(5～50):1。
优选地，所述活化缓冲剂为浓度为25～100mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2[(2-氨基-2氧代乙基)氨基]乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)中的一种；所述交联缓冲剂为浓度为25～100mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2[(2-氨基-2氧代乙基)氨基]乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)中的一种。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的试剂盒通过选用两种粒径不同的胶乳微球分别与抗体偶联的方法，使试剂同时具备灵敏度和抗HOOK效应的能力；通过优化胶乳微球与抗体的偶联过程，即在微球与还原抗体之间增加一个载体分子，使抗体从微球表面延伸出来，从而减小抗原和抗体结合的空间位阻，同时由于还原后的抗体具有游离巯基，易与胶乳粒子上的羧基生成稳定的硫醚键，实现抗体F(c)端与胶乳微球的定向偶联，大大提高了试剂的灵敏度。与现有技术相比，本发明的试剂盒具有偶联效率高、灵敏度高、防止HOOK效应出现等优点。
附图说明
图1为双粒径胶乳微球对试剂抗HOOK效应的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本技术领域的一般技术人员应当认识到本实施例仅是用来说明本发明，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实施范围内对实施例进行变换、变型都可在本发明权利要求的范围内。
实施例1
实施例1是免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备过程和使用方法：
1、R1试剂的制备
取12g 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)于纯化水，再加入5g的NaCl和5g的NaN3，搅拌均匀后，调节pH至7.0，然后加入5g的吐温-20，搅拌溶匀，定容至1L，作为第一试剂R1；
2、R2试剂的制备
(1)胶乳微球稀释液的制备：
将12g 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)溶于纯化水，再加入10g NaCl、50g蔗糖、50g海藻糖和5g的NaN3，搅拌均匀后，调节pH为7.0，然后加入10g的曲拉通X-405，搅拌溶匀，定容至1L；
(2)胶乳微球-载体分子复合物的制备：
取1ml粒径为60nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球(Bangs公司)，溶于10ml的pH值为5.5的25mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，然后依次将20mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和100mg的N-羟基丁二酰亚胺加入到上述2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，得到胶乳微球活化反应体系，室温振荡反应0.5～1h；将胶乳微球活化反应体系离心去除上清液，取10ml pH值为6.0的50mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液重悬沉淀物，获得活化胶乳微球；向该活化胶乳微球中加入7ml浓度为5mg/ml的天冬氨酸，室温振荡反应1h，再加入牛血清白蛋白，继续反应1h；用pH值为6.0的50mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液洗涤两次，离心去除上清液，用胶乳微球稀释液重悬沉淀物，获得粒径为60nm的胶乳微球-天冬氨酸复合物，置于2～8℃下保存备用；
取1ml粒径为288nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球(Bangs公司)，重复本步过程(所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的添加量为15mg，N-羟基丁二酰亚胺的添加量为100mg，5mg/ml的天冬氨酸的添加量为1.5ml，其余步骤相同)，获得粒径为288nm的胶乳微球-天冬氨酸复合物，置于2～8℃下保存备用；
(3)抗体的还原：
取20ml浓度为2mg/ml的免疫球蛋白G4单克隆抗体与500mgβ-巯基乙醇(ME)混合于pH值为7.4的150mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)中，室温还原30min，离心去除多余还原剂，加入1mg碘乙酰胺，37℃封闭巯基30min，得到还原的抗体；
(4)抗体与胶乳微球-天冬氨酸复合物的偶联：
取1ml粒径为60nm的胶乳微球-天冬氨酸复合物溶于10ml pH值为5.5、浓度为25mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，再依次将20mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和100mg N-羟基丁二酰亚胺加入2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，室温振荡反应0.5h；离心去除上清液，用pH值为6.0的50mmol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液重悬沉淀物，获得粒径为60nm活化的胶乳微球-天冬氨酸复合物；
取1ml粒径为288nm胶乳微球-天冬氨酸复合物，采用相同的步骤(所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的添加量为15mg，N-羟基丁二酰亚胺的添加量为100mg，其余步骤相同)，获得粒径为288nm活化的胶乳微球-天冬氨酸复合物；
向粒径为60nm活化的胶乳微球-天冬氨酸复合物中加入17ml还原的免疫球蛋白G4单抗，向粒径为288nm活化的胶乳微球-天冬氨酸复合物中加入3ml还原的免疫球蛋白G4单抗，室温振荡反应1h，加入牛血清白蛋白，继续反应1h；用pH值为7.4浓度为50mmol/L的MOPS缓冲液洗涤两次，离心去除上清液，用胶乳微球稀释液重悬沉淀物，获得两种粒径的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂。
(5)R2试剂的制备
将粒径为60nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂与粒径为288nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂按2:1的比例混合，作为第二试剂R2；
3、将所述第一试剂R1和所述第二试剂R2组合，即得所述免疫球蛋白G4检测试剂盒。
4、试剂盒的使用方法
本实施例以全自动生化分析仪(日立7180)为检测工具，按照表1设置仪器参数。
表1全自动生化分析仪(日立7180)上设置参数
上机参数 日立7180
方法 2PE
时间 10min
波长 cancel/570nm
测光点 18-34
样本加样量 1.5uL
反应方向 ↑
吸光度限值 32000
第一试剂R1加样量 150uL
第二试剂R2加样量 50uL
校准类型 SPLINE
校准点 5
量程点 3
向人血清样本中加入第一试剂R1后，混匀，置于37℃下孵育3～5min；然后加入第二试剂R2，混匀；再置于37℃下孵育30s后，读取吸光度A1，再孵育约270s后，读取吸光度A2。
人血清样本中免疫球蛋白G4与试剂中包被于聚苯乙烯粒子上的抗体形成不溶性免疫复合物，其浊度与人血清样本中免疫球蛋白G4含量成正比。在570nm处测定复合物浊度ΔA，计算方法ΔA＝A2-A1。样本中免疫球蛋白G4含量由全自动生化仪通过校准曲线自动计算得出。
实施例2
实施例2是载体分子提高试剂灵敏度的验证：
为验证本发明试剂盒在胶乳制备过程中引入载体分子提高了试剂的灵敏度，设置四组试剂盒进行比较。
试剂盒1：本发明实施例1制备的试剂盒。
试剂盒2：与试剂盒1的区别在于试剂盒2中第二试剂R2，在胶乳与抗体的偶联过程中，还原后的抗体直接与胶乳微球偶联，不添加载体分子，其余制备方法与试剂盒1相同。
试剂盒3：免疫球蛋白G亚型4检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法——上市产品A)
试剂盒4：免疫球蛋白G4测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法——上市产品B)
本实施例以全自动生化分析仪(日立7180)为检测工具，试剂盒1和试剂盒2采用实施例1中试剂盒的使用方法进行测试，试剂盒3和试剂盒4分别按各自的产品说明书进行测试。
(1)分析灵敏度
四组试剂盒同时测试1g/L分析灵敏度样本(由西门子免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)赋值)，比较分析灵敏度。
表2分析灵敏度检测结果
Figure BDA0003636982000000101
Figure BDA0003636982000000111
注：ΔA为吸光度变化值。
从表2可以看出，本发明的试剂盒1的分析灵敏度显著大于试剂盒2，说明引入载体分子后试剂的分析灵敏度显著提高。与其他厂家相比，本发明的试剂盒1的分析灵敏度显著优于试剂盒3，也好于试剂盒4。
(2)低值样本的重复性
使用四组试剂盒同时测试免疫球蛋白G4低值样本(由西门子免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)赋值)，计算低值样本的CV，比较低值样本的重复性。
Figure BDA0003636982000000112
Figure BDA0003636982000000121
表3低值样本的重复性检测结果
从表3可以看出，低值样本的重复性数据表明，引入载体分子后，本发明的试剂盒1的重复性显著提高，且本发明的试剂盒1优于其他厂家试剂盒的重复性。
(3)临床低值样本的比较
使用四组试剂盒同时测试免疫球蛋白G4低值样本(由西门子免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)赋值)，每个样本重复测定2次，计算均值与靶值(西门子赋值)的偏差。
表4临床样本的检测结果
Figure BDA0003636982000000122
根据表4可以看出，本发明的试剂盒1引入载体分子后，低值样本与西门子检测结果的偏差显著降低，并且偏差比试剂盒3与西门子的偏差小；试剂盒4在检测低值样本时与西门子的偏差虽小，但其钩状严重(见实施例3)。综上，本发明的试剂盒1引入载体分子后，显著提高了试剂的灵敏度。
实施例3
实施例3是双粒径胶乳微球兼顾试剂灵敏度和抗HOOK能力的验证：
为验证本发明试剂盒采用双粒径胶乳微球能够使试剂兼顾灵敏度和抗HOOK效应的能力，设置五组试剂盒进行比较。
使用生理盐水对免疫球蛋白G4高值样本(散射比浊法、西门子)进行梯度稀释(100％、80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.63％、0.31％、0.16％、0.08％、0.04％)，三组试剂盒同时测试梯度稀释样本，每个样本重复测定2次，计算均值进行比较。
试剂盒1：本发明实施例1制备的试剂盒。
试剂盒5：与试剂盒1的区别在于试剂盒2中第二试剂R2，采用小粒径的胶乳进行偶联，其余制备方法与试剂盒1相同。
试剂盒6：与试剂盒1的区别在于试剂盒3中第二试剂R2，采用大粒径的胶乳进行偶联，其余制备方法与试剂盒1相同。
试剂盒3：免疫球蛋白G亚型4检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法——上市产品A)
试剂盒4：免疫球蛋白G 4测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法——上市产品B)
本实施例以全自动生化分析仪(日立7180)为检测工具，试剂盒1、试剂盒5和试剂盒6采用实施例1中试剂盒的使用方法进行测试，试剂盒3和试剂盒4分别按各自的产品说明书进行测试。
表5双粒径胶乳微球对试剂抗HOOK效应的检测结果
Figure BDA0003636982000000141
由图1可以看出，试剂盒5具有较好的线性和抗HOOK效应的能力，但灵敏度较差(见表5)；试剂盒6和试剂盒5灵敏度较好，但HOOK效应严重；试剂盒6与本发明的试剂盒1相比，灵敏度不足。因此，本发明的试剂盒1具有兼顾灵敏度和抗HOOK效应的能力。
实施例4
实施例4是免疫球蛋白免疫球蛋白G4检测试剂盒的性能验证：
对实施例1制备的试剂盒进行性能验证。
(1)准确度验证
在全自动生化分析仪(日立7180)上使用该试剂盒，检测参考物质ERM-DA470K/IFCC，每个样本测试3次，计算测定均值与靶值的偏差。
表6样本测试结果
检测结果
1 0.368
2 0.376
3 0.356
均值(g/L) 0.367
参考物质(g/L) 0.373
相对偏差 -1.70％
根据表6检测结果，本试剂盒3次检测参考物质ERM-DA470K/IFCC的均值与靶值的偏差仅为-1.70％。满足准确度≤±15％的要求。
(2)精密度验证
使用全自动生化分析仪(日立7180)，按前述方法使用本试剂盒测试质控品，每个质控品测10次，计算CV。
表7精密度检测结果
Figure BDA0003636982000000151
Figure BDA0003636982000000161
表8批间差检测结果
Figure BDA0003636982000000162
从表7、表8可以看出，根据检测结果，本发明的试剂盒1在两个浓度水平处的重复性和批间差均满足≤±10％要求。
(3)线性验证
使用全自动生化分析仪(日立7180)，按前述方法使用校准品稀释液对免疫球蛋白G4高值样本进行梯度稀释(100％、80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.63％、0.31％、0.16％、0.08％、0.04％)，使用该试剂盒对梯度稀释样本进行测试，每个样本重复测定3次。
表9线性验证结果
Figure BDA0003636982000000171
从表9可以看出，本试剂盒在0.04～4g/L范围内，具有良好的线性，相关系数>0.99；在0.04～1.5g/L内，绝对偏差可控制在±0.1g/L内；在1.5～4.0g/L内，相对偏差可控制在±10g/L内。

Claims (10)

1.一种免疫球蛋白G4检测试剂盒，其特征在于，由第一试剂R1和第二试剂R2组成：
所述第一试剂R1，包括浓度为25～200mmol/L的两性离子缓冲液、5～10g/L无机盐、0.5w%～5w%表面活性剂1以及0.05w%～1w%防腐剂；
所述第二试剂R2，包括浓度为25～200mmol/L两性离子缓冲液、5～10g/L无机盐、50～100g/L蔗糖、50～100g/L海藻糖、0.5w%～5w%表面活性剂2、1w%～5w%的被载体分子标记的偶联有免疫球蛋白G4单克隆抗体的胶乳微球、1w%～5w%封闭剂以及0.05w%～1w%防腐剂。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒，其特征在于，所述两性离子缓冲液为2-（N-吗啉代）乙磺酸、2[(2-氨基-2氧代乙基)氨基]乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嚓-N/-(2-乙磺酸)中的一种或几种；所述无机盐为氯化钠或/和氯化钾；所述防腐剂为叠氮化钠或者ProClin-300；所述封闭剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、吐温-20中的一种或几种；所述表面活性剂1为吐温-20、曲拉通X-100、曲拉通X-405或司盘-20中的一种或几种；所述表面活性剂2为聚氧乙烯醚Brij58、月桂酰聚果糖、非离子表面活性剂A60中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球为粒径为50～100nm、100～300nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球的一种或几种，所述免疫球蛋白G4单克隆抗体在所述胶乳微球上的载量为（5～50）:1；所述载体分子为牛血清白蛋白、聚赖氨酸或天冬氨酸的一种或几种。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂R1和第二试剂R2的pH为6.0～8.0。
5.根据权利要求4所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，分别在两种不同粒径的胶乳微球表面偶联载体分子，再与还原后的抗体进行定向偶联，生成所述被载体分子标记的偶联有免疫球蛋白G4单克隆抗体的胶乳微球。
6.根据权利要求5所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，取定量的所述两性离子缓冲液溶于纯化水，然后加入所述无机盐和防腐剂；搅拌均匀后，调节pH值到6.0～8.0，然后加入所述表面活性剂1，搅拌溶匀后定容，作为第一试剂R1；
S2，（1）将定量的所述缓冲液溶于纯化水，再加入所述无机盐、蔗糖、海藻糖和防腐剂；搅拌均匀后，调节pH值到6.0～8.0，然后加入所述表面活性剂2，搅拌溶匀后定容，得到胶乳微球稀释液；（2）取粒径为50～100nm的所述胶乳微球，溶于活化缓冲液中；再依次加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，室温振荡反应0.5～1h；再离心去除上清液，用交联缓冲液重悬沉淀物，获得活化胶乳微球；（3）向所述活化胶乳微球中加入所述载体分子，室温振荡反应1～4h；加入封闭剂，继续反应0.5～1h；用所述交联缓冲液洗涤并离心去除上清液，用所述胶乳微球稀释液重悬沉淀物，获得胶乳微球-载体分子复合物，置于2～8℃下保存备用；
S3，取所述胶乳微球-载体分子复合物溶于所述活化缓冲液中，再加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，室温振荡反应0.5～1h；离心去除上清液，用所述交联缓冲液重悬沉淀物，获得活化的胶乳微球-载体分子复合物；
取免疫球蛋白G4单克隆抗体与还原剂混合于pH值为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，室温还原30～120min，离心去除多余还原剂，加入0.1w%～0.3w%碘乙酰胺，室温封闭巯基30～60min，得到还原的抗体；
S4，向所述活化的胶乳微球-载体分子复合物中加入所述还原的抗体，室温振荡反应1～4h，加入封闭剂，继续反应0.5～1h；用交联缓冲液洗涤，离心去除上清液，用胶乳微球稀释液重悬沉淀物，获得粒径为50～100nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂；
S5，取粒径为200～300nm的胶乳微球，重复步骤S2～S5，获得粒径为200～300nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂；
S6，将粒径为50～100nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂与粒径为200～300nm的偶联免疫球蛋白G4单抗的胶乳试剂按(1.5～3.5)：1的比例混合，作为第二试剂R2；
S7，将所述第一试剂R1和所述第二试剂R2组合，即得所述免疫球蛋白G4检测试剂盒。
7.根据权利要求5所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述胶乳微球与所述活化缓冲液的质量比为1:（5～20）；所述胶乳微球的质量，与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的质量和之比为1：（0.01～0.2）；所述载体分子与所述胶乳微球的质量比为（5～50）:1。
8.根据权利要求5所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述胶乳微球-载体分子复合物与所述活化缓冲液的质量比为1:（5～20）；所述胶乳微球-载体分子复合物的质量，与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的质量和之比为1：（0.01～0.2）。
9.根据权利要求5所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述免疫球蛋白G4单克隆抗体与所述还原剂的质量比为1：(5～15)；所述还原剂为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇，三(2-羧乙基)膦中的一种；在所述步骤S4中，所述还原抗体与胶乳微球的质量比为（5～50）:1。
10. 根据权利要求5所述的免疫球蛋白G4检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述活化缓冲剂为浓度为25～100 mmol/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸、2[(2-氨基-2氧代乙基)氨基]乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸中的一种；所述交联缓冲剂为浓度为25～100 mmol/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸、2[(2-氨基-2氧代乙基)氨基]乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸中的一种。
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