CN111398490A - 质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒 - Google Patents

质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒；所述试剂盒包括：用于平衡透析分离结合态和游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括透析液；以及用于通过固相萃取从透析液中提取游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括内标溶液、平衡液、淋洗液和洗脱液。本发明的试剂盒检测时，利用平衡透析法将人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中，然后通过固相萃取方法将其从透析液中提取出来；通过超高效液相色谱进行分离后，进入质谱进行检测，利用与校准品的比较得到待测样品的浓度，保障了检测结果准确性。不同浓度的质控品保证了检测结果的可靠性。

Description

质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒
技术领域
本发明属于生物化学检测领域，涉及一种质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的试剂盒，尤其涉及超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的试剂盒及测试方法。
背景技术
甲状腺激素由颈部的两个圆锥状腺体分泌，它能调节体内多种代谢过程。甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)是两种主要的甲状腺激素。甲状腺素是在甲状腺囊泡中由酪氨酸和四分子碘结合形成的。在甲状腺或外周体循环中，通过酶介导的消除反应，将一分子碘移除从而形成。合成后的这些激素储存在甲状腺胶体中，在受到促甲状腺素(TSH)刺激后进入循环***。
在循环***中，甲状腺激素以游离和结合形态存在。结合态T3、T4的水平会因为TBG的浓度变化而发生改变，但游离T3、游离T4的水平不会受到影响，因而甲状腺激素的生理功能不会受到影响。所以游离T3、游离T4的水平是评价甲状腺功能和研究下丘脑—垂体—甲状腺轴的主要指标之一，可用于原发性及继发性甲状腺疾病的辅助诊断及疗效评价。
测定血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)是甲状腺功能亢进与低下，以及亚临床型甲状腺功能亢进的诊断与鉴别诊断最灵敏的指标之一。
临床采用测定血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的传统方法有放免法、酶联免疫技术、化学发光法等。
放免法试剂盒：以FT4为例：血清(血浆)样品的FT4和125I-T4对一定量的FT4抗血清中的抗体产生竞争性结合，使用沉淀剂将其抗原-抗体结合物沉淀，测定沉淀物的放射强度(cpm)。计算被检样品的抗原-抗体结合率，可在标准曲线上查到相应的FT4的含量。早期放免法试剂盒受方法学限制，其灵度和抗干扰能力严重不足，存在很大弊端，已基本上退出市场。
酶联免疫法试剂盒：以测定血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)为例。酶联免疫法原理:用纯化的FT3抗体包被微孔板或磁珠，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的Free-T3抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的Free-T3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(值)，计算样品浓度。本方法的缺点：操作过程有些繁琐，反应需要时间长，不能一蹴而就；特异性和灵敏度不够；不能同时测试FT3和FT4；依赖于抗体，由于不同厂家生产抗体差异性大，导致FT3和FT4结果差异大。如，CN201310403123-FT3体外诊断试剂盒及其使用方法；CN201510518771-游离甲状腺素的免疫分析试剂盒。
化学放光法和免疫磁微粒结合法试剂盒：采用竞争法的反应原理，将酶促化学放光技术和免疫磁微粒分离技术相结合。磁微粒技术是利用高分子合成一定粒度大小的磁性固相微粒做载体，载体表面修饰一定数量化学功能团，通过化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的免疫活性物质(抗原和抗体)。此方法灵敏度和特异性都优于3中酶联免疫法，但仍然不能同时测试FT3和FT4；同样依赖于抗体，导致FT3和FT4结果差异大。如，CN201010243013-游离三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒及其制备方法；CN201110257592-游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)定量测定试剂盒及其检测方法；CN201210571301-一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法；CN201210571304-一种游离甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的试剂盒，尤其是一种超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的试剂盒及测试方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，所述试剂盒包括：
用于平衡透析分离结合态和游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括透析液；
用于通过固相萃取从透析液中提取游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括内标溶液、平衡液、淋洗液和洗脱液。
进一步的，所述透析液为每1L质谱纯水中溶解氯化钠5.0～5.5g、磷酸钠0.3～0.7g、氯化钾0.15～0.50g、七水硫酸镁0.1～0.4g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸35～40g、尿素0.1～0.5g、氯化钙0.1～0.5g和叠氮化钠0.3～0.8g。
进一步的，所述内标溶液为包含13C6-三碘甲状腺原氨酸和13C6-甲状腺素的混合液；所述平衡液为水；所述淋洗液包括第一淋洗液和第二淋洗液，第一淋洗液为45～55mmol/L的铵盐水溶液，第二淋洗液为含1.5～2.5％甲酸的双氯甲烷溶液；所述洗脱液为甲醇。该混合液中13C6-三碘甲状腺原氨酸的浓度为35～45pg/mL,13C6-甲状腺素的浓度为75～85pg/mL。该铵盐水溶液优选醋酸铵水溶液。
进一步的，所述检测试剂盒还包括平衡透析板及其盖膜，固相萃取板、固相萃取接收板及其盖膜；所述平衡透析板的分子量界限为9.5～10.5kDa，固相萃取板为强阴离子交换柱，固相萃取接收板为96孔板。
进一步的，所述检测试剂盒还包括标准品；所述标准品为不同浓度的包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的透析液溶液的冻干粉。
进一步的，所述检测试剂盒还包括质控品；所述质控品为不同浓度的包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的血清基质溶液的冻干粉。
进一步的，所述检测试剂盒还包括超高效液相色谱分离用试剂，又包括流动相A和流动相B，所述流动相A为(0.08～0.12％V/V)甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇。
第二方面，本发明还涉及一种超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的方法，所述方法包括：用平衡透析法将人血清样品中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中，然后通过固相萃取方法将游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素从透析液中提取出来；通过超高效液相色谱进行分离后，进入质谱进入检测。
进一步的，该方法为非疾病诊断和治疗目的的超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的方法。
所述透析液为每1L质谱纯水中溶解氯化钠5.0～5.5g、磷酸钠0.3～0.7g、氯化钾0.15～0.50g、七水硫酸镁0.1～0.4g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸35～40g、尿素0.1～0.5g、氯化钙0.1～0.5g和叠氮化钠0.3～0.8g。
进一步的，通过以下方法将人血清样品中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中：在平衡透析板的一侧加入200uL人血清，另一侧加入等体积的透析液，将平衡透析板的两侧盖好盖膜，然后放置于恒温振荡培养器中，以10～30转/分钟速度，在36.5～37.5摄氏度下振荡16～24个小时。
进一步的，通过以下方法将游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素从透析液中提取出来：
S1、在平衡透析板的透析液一侧，用移液枪取出透析液，转移至反应试管中；
S2、将等体积的不同浓度的标准品溶液和质控品溶液分别转移到其他反应试管中；
S3、向步骤S2和S3的反应试管中分别加入等体积的内标溶液，震荡混合；
S4、在经活化、平衡处理后的固相萃取板的孔中分别加入步骤S3的混合液，分别依次用45～55mmol/L的铵盐水溶液和甲醇淋洗后用甲醇洗脱，用固相萃取接收板接收洗脱后的溶液。
所述标准品溶液为不同浓度的包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的透析液溶液的冻干粉用超纯水复溶得到的。所述质控品溶液为不同浓度的包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的血清基质溶液的冻干粉用超纯水复溶得到的。所述内标溶液为包含13C6-三碘甲状腺原氨酸和13C6-甲状腺素的混合液。该混合液中13C6-三碘甲状腺原氨酸的浓度为35～45pg/mL,13C6-甲状腺素的浓度为75～85pg/mL。
进一步的，固相萃取接收板接收洗脱后的溶液用氮气吹干，然后加入复溶液，盖上固相萃取接收板盖膜后转移至超高效液相色谱进样瓶；超高效液相色谱分离采用的流动相A为(0.08～0.12％V/V)甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度淋洗的方式，流速为0.3～0.5ml/min。所述复溶液为甲醇和水的混合液。复溶液中甲醇和水的体积比为35:75～45:65；优选为40:60。
进一步的，质谱检测后，采用同位素内标定量法，以标准品的浓度比为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线；根据测得的人血清样品与内标物峰面积比对照校准曲线，获得人血清样品中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的浓度。
本发明利用平衡透析法将人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中，然后通过固相萃取方法将其从透析液中提取出来。通过超高效液相色谱进行分离后，进入质谱进行检测。利用系列已知浓度三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素标准品和内标，建立校准曲线，从而计算人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的浓度。该检测试剂盒通过检测血清中的游离三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的水平，对甲状腺功能亢进，甲状腺功能减退的诊断和鉴别诊断，以及与甲状腺功能相关疾病的发展过程、疗效和预后评估具有十分重要的意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、前处理采用平衡透析将结合态(T3和T4)和游离态(FT3和FT4)分开，保证FT3和FT4检测结果的准确性；
2.采用超高效液相色谱-串联质谱方法检测游离态(FT3和FT4)，该方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测；(1)特异性高，可以极大的避免交叉反应的干扰,从而提高准确度；(2)采用同位素内标法定量，可以极大的消除基质效应，能够达到准确定量；(3)超高效液相色谱-串联质谱可以直接检测FT3和FT4,不依赖于抗体，测试结果可比性强；(4)高通量，可同时检测FT3和FT4；
3.校准品和质控品采用冻干工艺制成干粉，有利保证保存有效期内校准品和质控品性能稳定，保证结果准确性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为校准品和质控品冻干品生产工艺流程图；
图2为FT3、FT4的校准品及其内标的离子流色谱图；
图3为人血清中FT3、FT4及其内标的离子流色谱图；
图4为三碘甲状腺原氨酸的校准曲线；
图5为甲状腺素的校准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例涉及一种超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的试剂盒，包括以下份数的各组分
Figure BDA0002400037210000051
Figure BDA0002400037210000061
其中，组分1的透析液包含氯化钠5.19g、磷酸钠0.50g、氯化钾0.323g、七水硫酸镁0.246g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸37.2g、尿素0.3g、氯化钙0.275g和叠氮化钠0.52g；将上述组分溶解于1L质谱纯水。
组分2的平衡透析板的分子量界限为10kDa。
组分3的平衡透析板盖膜与上述平衡透析板匹配。
组分4的校准品：包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的透析液溶液冻干粉，分为六个不同浓度，分别为校准1，校准2，校准3，校准4，校准5和校准6。校准品1-6对应的溶液中三碘甲状腺原氨酸的浓度分别为2，4，10，20，50，100pg/mL；甲状腺素的浓度分别为4,8,20,40,100,200pg/mL。校准品的冻干品生产工艺流程图如图1所示。
组分5的质控品：包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的血清基质溶液冻干粉，分为三个不同浓度，分别为质控L，质控M和质控H。质控品L-H对应的溶液中三碘甲状腺原氨酸的浓度分别为6,25,90pg/mL；质控品L-H中甲状腺素的浓度分别为12，50,180pg/mL。质控品的冻干品生产工艺流程图如图1所示。
组分6的内标：包含13C6-三碘甲状腺原氨酸和13C6-甲状腺素的混合液(混合液中13C6-三碘甲状腺原氨酸的浓度为40pg/mL,13C6-甲状腺素的浓度为80pg/mL)。
组分7的反应试管为体积1mL的锥形体试管。
组分8的固相萃取板为强阴离子交换柱。
组分9的平衡液为超纯水。
组分10的淋洗液1为50mmol/L的醋酸铵水溶液，配置方法为称量3.854g NH4OAc，溶解于1L水中。
组分11的淋洗液2为含2％甲酸的双氯甲烷溶液。
组分12的洗脱液为甲醇。
组分13的固相萃取接收板为2mL的U型底96孔板。
组分15的复溶液为甲醇和水的混合液，体积比为40:60。
组分16的流动相A为含0.1％甲酸的水溶液。
组分17的流动相B为甲醇。
组分18的进样器洗涤液为甲醇/水混合液，体积比为50:50。
本实施例的试剂盒的使用方法包括如下步骤：
步骤一：平衡透析
在平衡透析板的一侧加入200uL人血清，另一侧加入200uL透析液，将平衡透析板的两侧盖好盖膜，然后放置于恒温振荡培养器中，以30转/分钟速度，在37摄氏度下振荡16个小时。
步骤二：加入内标
在平衡透析板的透析液一侧，用移液枪取出150uL透析液，转移至反应试管中。向六瓶校准品瓶和3瓶质控品分别加入0.2mL超纯水，将冻干粉复溶。从以上瓶中各取出150uL相应溶液，转移至9个不同的反应试管中。向上述10个试管中分别加入150uL的内标，振荡1分钟，混合均匀。将反应试管以14000转/分钟的速度在离心机中离心5分钟。
步骤三：固相萃取
1.活化：在固相萃取板中每个孔中加入1mL甲醇，使用正压装置加压，使其活化充分。
2.平衡：在固相萃取板的每个孔中加入1mL水，使用正压装置加压，使其平衡。
3.上样：在固相萃取板的孔中加入280uL步骤二中的混合液，使用正压装置加压。
4.淋洗
(1)在固相萃取板的每个孔中加入1mL淋洗液1，使用正压装置加压。
(2)在固相萃取板的每个孔中加入1mL甲醇，使用正压装置加压。
(3)在固相萃取板的每个孔中加入1mL淋洗液2，使用正压装置加压。
5.洗脱：在固相萃取板的每个孔中加入1mL洗脱液，使用正压装置加压，用96孔接收板接收洗脱后的溶液。
步骤四：氮气浓缩
将步骤三中洗脱后的1mL溶液用氮气吹干，然后加入60uL的复溶液，将96孔接收板盖好盖膜，振荡5分钟后，将复溶液转移至超高效液相色谱进样瓶中。
步骤五：超高效液相色谱分离
超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％V/V甲酸水溶液
流动相B：甲醇
色谱柱型号：biphenyl column
采用梯度淋洗的方式，流速为0.4ml/min,梯度见表1：
表1
时间(分钟) 流速(mL/min) A％ B％
0 0.4 60 40
0.5 0.4 60 40
4 0.4 2 98
5 0.4 2 98
5 0.4 60 40
6 0.4 60 40
步骤六：质谱检测
质谱条件：
在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3925V，碰撞气为2mTorr，离子源温度为300℃，离子转移管的温度为275℃,鞘气42Arb,辅助气15Arb，反吹气0Arb。
各个目标物的保留时间，MRM检测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压见表2：
表2
Figure BDA0002400037210000091
试剂盒的测试性能结果如下：
1.离子流色谱图：
图2为两种激素的校准品及其内标的离子流色谱图，图3为人血清中两种激素及其内标的离子流色谱图。由图2、3可知2种甲状腺激素的标准品和血清的峰型比较对称，没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到很好的检测。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，以标准物的浓度比为x轴，以标准物与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线。两种激素FT3、FT4(图4与图5)在各自浓度范围内的线性拟合方程线性良好，相关系数在0.99以上。
3.最低定量限
游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的最低定量限分别为4pg/mL和8pg/mL，基本满足血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测要求。
4.精密度试验：
重复性：CV≤15％；
批间精密度：相对极差(R)≤20％。
5.准确度
用回收率(％)表示测定结果的准确度，回收率在85％-115％范围内。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
用于平衡透析分离结合态和游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括透析液；
用于通过固相萃取从透析液中提取游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括内标溶液、平衡液、淋洗液和洗脱液。
2.如权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述透析液为每1L质谱纯水中溶解氯化钠5.0～5.5g、磷酸钠0.3～0.7g、氯化钾0.15～0.50g、七水硫酸镁0.1～0.4g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸35～40g、尿素0.1～0.5g、氯化钙0.1～0.5g和叠氮化钠0.3～0.8g。
3.如权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述内标溶液为包含13C6-三碘甲状腺原氨酸和13C6-甲状腺素的混合液；所述平衡液为水；所述淋洗液包括第一淋洗液和第二淋洗液，第一淋洗液为45～55mmol/L的铵盐水溶液，第二淋洗液为含1.5～2.5％甲酸的双氯甲烷溶液；所述洗脱液为甲醇。
4.如权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括标准品；所述标准品为不同浓度的包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的透析液溶液的冻干粉。
5.如权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括质控品；所述质控品为不同浓度的包含三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的血清基质溶液的冻干粉。
6.如权利要求1所述的游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括超高效液相色谱分离用试剂，又包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇。
7.一种超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的方法，其特征在于，所述方法包括：用平衡透析法将人血清样品中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中，然后通过固相萃取方法将游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素从透析液中提取出来；通过超高效液相色谱进行分离后，进入质谱进入检测。
8.如权利要求7所述的超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的方法，其特征在于，通过以下方法将人血清样品中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中：在平衡透析板的一侧加入200uL人血清，另一侧加入等体积的透析液，将平衡透析板的两侧盖好盖膜，然后放置于恒温振荡培养器中，以10～30转/分钟速度，在36.5～37.5摄氏度下振荡16～24个小时。
9.如权利要求7所述的超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的方法，其特征在于，通过以下方法将游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素从透析液中提取出来：
S1、在平衡透析板的透析液一侧，用移液枪取出透析液，转移至反应试管中；
S2、将等体积的不同浓度的标准品溶液和质控品溶液分别转移到其他反应试管中；
S3、向步骤S2和S3的反应试管中分别加入等体积的内标，震荡混合；
S4、在经活化、平衡处理后的固相萃取板的孔中分别加入步骤S3的混合液，分别依次用45～55mmol/L的铵盐水溶液和甲醇淋洗后用甲醇洗脱，用固相萃取接收板接收洗脱后的溶液。
10.如权利要求7所述的超高效液相色谱-串联质谱检测人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的方法，其特征在于，质谱检测后，采用同位素内标定量法，以标准品的浓度比为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线；根据测得的人血清样品与内标物峰面积比对照校准曲线，计算人血清样品中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素的浓度。
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