CN115561450A - 用于检测触珠蛋白含量的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，包括：试剂R1，其pH为8.0；试剂R2，其包括乳胶微球和兔抗人触珠蛋白抗体，胶乳微球的粒径为220nm；兔抗人触珠蛋白抗体与胶乳微球的质量比为：7:60；试剂R2的pH为9.0；试剂R1和试剂R2用于通过胶乳增强免疫比浊法检测触珠蛋白含量。本发明应用兔抗人触珠蛋白抗体包被胶乳颗粒，利于提高了检测的灵敏度、准确性和精密度，减少非特异性反应，检测步骤简单，检测时间短，能够实现高通量检测，应用于常规实验室。

Description

用于检测触珠蛋白含量的试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种用于检测触珠蛋白含量的试剂盒。
背景技术
触珠蛋白(HPT)，又称为结合珠蛋白，是一种在人体血浆中循环的糖蛋白。其基因位于16号染色体的长臂上(16q22)，有两个主要的等位基因HP1和HP2，这两种等位基因形成的3种主要基因型，可表现出不同结构的多聚体，进而产生结合游离血红蛋白、抗氧化活性、促进血管生成、调节免疫功能等不同的生物学效应。
HPT最初是作为炎性反应的急性期反应蛋白被分离，其生物合成和降解的主要部位为肝脏，也存在于包括中性粒细胞和单核细胞在内的免疫细胞中。另有研究证实肾近曲小管上皮细胞在炎性反应因子刺激下可以合成和分泌触珠蛋白，揭示炎症反应与HPT的分泌存在密切联系。结合珠蛋白具有结合血红蛋白的能力，二者形成复合物后可被单核巨噬细胞处理，此过程能阻止血红蛋白从肾小球滤过，避免游离血红蛋白对肾脏的损害。
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，长期高血糖会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病患者的主要并发症，也是导致全球糖尿病患者病死率升高和社会医疗资源消耗的重要原因之一。此外，DKD也是世界范围内引起终末期肾病(ESRD)的最常见原因。DKD的早期确诊是预防和早期干预的基础。肾活检最具有诊断价值，但创伤程度高，不推荐常规检测。尿HPT作为一种新的生物标志物，通过对不同糖尿病患者尿蛋白质组的研究证实尿HPT在早期DKD中可预测肾功能的进展。同时，研究结果证明肾脏疾病患者血清和尿液HPT浓度之间缺乏相关性，提示尿HPT可能来源于肾脏，除肾小管细胞合成分泌HPT外，肾小管细胞损伤还可能导致HPT从管周毛细血管渗漏到肾小管中，含有HPT的肾小管细胞损伤脱落到尿液也可能是尿中HPT增高的原因。对2型糖尿病患者进行了前瞻性研究，证明尿HPT可预测2型糖尿病(T2DM)和早期肾脏疾病患者的肾功能快速下降，其作为尿微量白蛋白的补充，预测2型糖尿病患者的肾损害，是早期肾功能下降最佳预测因子。此外，在慢性肾脏病(chron-ickidney disease，CKD)3期亚群中，尿HPT优于白蛋白尿，以预测肾功能的快速下降。
尿液中触珠蛋白浓度与糖尿病型肾脏疾病密切相关，简便、精准地检测尿HP含量对糖尿病型肾脏疾病的基础研究和临床治疗具有重要意义，是疾病预防和早期干预的基础。
目前，人体触珠蛋白检测应用样本的类型多为血清、血浆、全血，常用方法包括但不限于ELISA法、免疫比浊法。其中ELISA法操作繁琐，灵敏度低，检测结果多为定性；免疫比浊法，操作简单、使用方便，但灵敏度和稳定性较差。
检测尿液HPT的产品较为单一，产品类型为尿液结合珠蛋白测试条，应用技术原理为胶体金双抗体夹心法。测试条包含玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸。将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该测试方法适用于定性或半定量检测，此外测试条采用物理吸附的方法结合，抗原-抗体容易从金颗粒表面脱离，标记物不稳定，胶体金产品批间差异较大，测试灵敏度低较低且易受干扰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：基于上述背景，常规的检测方法无法兼顾检测性能和检测便捷性，本发明提供了解决上述问题的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，应用兔抗人触珠蛋白抗体包被胶乳颗粒，利于提高了检测的灵敏度、准确性和精密度，减少非特异性反应，检测步骤简单，检测时间短，能够实现高通量检测，应用于常规实验室。
本发明通过下述技术方案实现：
用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，包括：试剂R1，其pH为7.0-8.5；试剂R2，其包括乳胶微球和兔抗人触珠蛋白抗体，胶乳微球的粒径为100-300nm；兔抗人触珠蛋白抗体与胶乳微球的质量比为：1:15-1:4；试剂R2的pH为8.5-9.5；试剂R1和试剂R2用于通过胶乳增强免疫比浊法检测触珠蛋白含量。
本发明样本中的触珠蛋白与包被抗人触珠蛋白(HPT)抗体的胶乳溶液形成乳胶微粒凝集复合物。该复合物导致散射光强度变化与HPT的浓度成比例，可进行速率散射比浊检测。
进一步可选地，试剂R1，其pH为8.0；试剂R2，其包括乳胶微球和兔抗人触珠蛋白抗体，胶乳微球的粒径为220nm；兔抗人触珠蛋白抗体与胶乳微球的质量比为：7:60；试剂R2的pH为9.0；试剂R1和试剂R2用于通过胶乳增强免疫比浊法检测触珠蛋白含量。
进一步可选地，所述试剂R1包括缓冲液、生物防腐剂和氯化钠。
进一步可选地，所述缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，浓度为0.05-0.2mol/L；优选地，浓度为0.1mol/L。
进一步可选地，所述氯化钠的浓度为10-35g/L；优选地，浓度为20g/L。
进一步可选地，所述试剂R2中，乳胶微球的质量百分含量为0.2-0.6％，和/或兔抗人触珠蛋白抗体的浓度为0.2-0.6mg/mL；优选地，乳胶微球的质量百分含量为0.3％，和/或兔抗人触珠蛋白抗体的浓度为0.35mg/mL。
进一步可选地，所述试剂R2中还包括蔗糖和proclin 300。
进一步可选地，还包括触珠蛋白标准品。
进一步可选地，检测的样本类型包括尿液。
进一步可选地，尿液触珠蛋白的检测范围是20-300ng/mL，检出限10ng/mL。
本发明具有如下的优点和有益效果：
1、本发明采用胶乳增强免疫比浊法，应用兔抗人触珠蛋白(HPT)抗体包被胶乳颗粒，关键点在于寻找最适粒径的胶乳颗粒及抗体与胶乳颗粒最优配比，达到节约抗体、降低成本的同时极大提高了检测的灵敏度、准确性和精密度，减少了非特异性反应。
2、本发明调试试剂R1与R2的PH值，使反应达到高灵敏度和较宽线性范围的需求。
3、本发明与胶体金双抗体夹心法检测尿液触珠蛋白含量相比。胶乳增强免疫比浊法在保证检测结果准确的同时，操作更加方便，快捷，并且可以和其他肾脏疾病标志物一起检测，大批量直接上机操作，可应用于常规实验室。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，组成如下所示：
(一)试剂盒的组成：
1、试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液， 0.1mol/L pH8.0；
氯化钠， 20g/L；
proclin 300， 0.05％。
2、试剂R2：
Figure BDA0003857168290000031
Figure BDA0003857168290000041
3、触珠蛋白标准品：利用重组特定蛋白复合抗原配制。
(二)试剂盒的具体配制方案如下所示：
1、试剂R1的制备：
配制0.1mol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液：准确称取三羟甲基氨基甲烷(CAS号77-86-1；分子量121.14)12.114g溶于1L纯水，加入0.5ml防腐剂proclin300和20g的氯化钠，使用浓盐酸调pH至8.0，震荡混匀，用0.22um滤膜过滤备用。
2、试剂R2的制备：
A.稀释：47ml的0.01mol/L pH7.5 Hepes缓冲液中加入3ml粒径为220nm的胶乳中，制备成胶乳稀释液。35mg的兔抗人HPT抗体加入0.01mol/L pH7.5 Hepes缓冲液中，制备成抗体稀释液，体积共50ml。将50ml胶乳稀释液加入50ml抗体稀释液中，轻柔震荡混匀，放入37℃恒温摇床180rpm震荡30min。
B.偶联：取出加入0.3ml 10mg/ml的EDC.HCl溶液，并轻轻晃动抗体胶乳混合液，防止抗体胶乳混合液局部EDC.HCl浓度过高。放入37℃恒温摇床180rpm震荡3-3.5小时。
C.封闭：CE510和CE210各加入1ml，轻柔震荡混匀，放入37℃恒温摇床180rpm震荡1h。
D.取出后用高速冷冻离心机4℃下17500rpm，离心30min；弃上清，加入保存液。再用超声波破碎仪将抗体-胶乳溶液充分分散，超声结束后将制得的试剂R2存放于4℃冰箱待用。
3、触珠蛋白标准品的配制：按计算的触珠蛋白校准品所需要的触珠蛋白抗原和稀释液的理论用量，准确称量稀释液和触珠蛋白抗原，配制成触珠蛋白校准品水平6，搅拌均匀，然后用触珠蛋白校准品上一个水平和稀释液依次称量配制出另外5个水平的触珠蛋白校准品。
本实施例提供了一种用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：试剂R1中，NaCl浓度为3％。
实施例3
本实施例提供了一种用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：试剂R1中，NaCl浓度为4％。
实施例4
本实施例提供了一种用于检测α1-抗胰蛋白酶含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：试剂R1中，pH为7.0。
实施例5
本实施例提供了一种用于检测α1-抗胰蛋白酶含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：试剂R1中，试剂R1中，pH为9.0。
实施例6
本实施例提供了一种用于检测α1-抗胰蛋白酶含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：AAT抗体与胶乳微球的质量比为：5:60。
实施例7
本实施例提供了一种用于检测α1-抗胰蛋白酶含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：AAT抗体与胶乳微球的质量比为：9:60。
实施例8
本实施例提供了一种用于检测α1-抗胰蛋白酶含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：微球选用130nm。
实施例9
本实施例提供了一种用于检测α1-抗胰蛋白酶含量的试剂盒，组成如实施例1所示，区别在于：微球选用300nm。
采用实施例1-实施例9提供的试剂盒检测尿液中触珠蛋白含量，检测方法如下所示：
1)校准程序：将触珠蛋白校准品放到仪器指定位置进行多点校准，得到校准曲线。
2)样本检测流程：
将试剂盒R1和R2放入仪器固定试剂位，尿液样本放入固定样本位，点击开始按钮后，仪器自动检测，并根据校准曲线自动计算尿液中触珠蛋白的浓度。
对于检测方法，检测方案在BioSystems BA400、重庆博士泰BA200、重庆博士泰BST300、重庆博士泰BST300U、重庆博士泰BST320、重庆博士泰BST320U全自动特定蛋白分析仪操作手册或仪器软件中提供。利用双试剂固定时间法进行测定，触珠蛋白检测试剂在使用前请轻轻摇匀，尽量不要产生气泡，以免引起取液误差。打开瓶盖，放入对应仪器试剂位。按样本要求处理过的标本放入对应样本位进行测试。样本测试时，选择样本类型为尿液。仪器点击开始，吸样针吸取R1 200μl于反应盘中；再吸取20μl样本，混匀，孵育后，加入R2 30μl，自动检测。仪器检测***将自动检测计算结果。
检测结果如表1-7所示。
表1实施例1提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000051
Figure BDA0003857168290000061
表2实施例2提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000062
表3实施例3提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000063
表4实施例1提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000064
表5实施例2提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000065
Figure BDA0003857168290000071
表6实施例3提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000072
表7实施例1-3提供的试剂盒的线性检测结果
浓度(ng/mL) 4.7 9.4 18.8 37.5 75 150 225 300 R
配方1 0.0061 0.0137 0.0311 0.0693 0.1587 0.3962 0.6745 0.8912 0.9987
配方2 0.0045 0.0116 0.0302 0.0683 0.1663 0.4180 0.7163 0.8208 0.9975
配方3 0.0045 0.0128 0.0270 0.0610 0.1410 0.3266 0.5799 0.7285 0.9945
综上，表1-表7，实施例1提供的检测试剂盒的精密度、灵敏度和线性最好。
表8实施例4提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000073
表9实施例5提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000074
表10实施例4提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000075
Figure BDA0003857168290000081
表11实施例5提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000082
表12实施例4-5提供的试剂盒的线性检测结果
Figure BDA0003857168290000083
表13实施例6提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000084
表14实施例7提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000085
Figure BDA0003857168290000091
表15实施例6提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000092
表16实施例7提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000093
表17实施例6-7提供的试剂盒的线性检测结果
Figure BDA0003857168290000094
表18实施例8提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000095
表19实施例9提供的试剂盒的精密度检测结果
Figure BDA0003857168290000096
Figure BDA0003857168290000101
表20实施例8提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000102
表21实施例9提供的试剂盒的灵敏度检测结果
Figure BDA0003857168290000103
表22实施例8-9提供的试剂盒的线性检测结果
Figure BDA0003857168290000104
本发明采用胶乳增强免疫比浊法，应用兔抗人触珠蛋白(HPT)抗体包被胶乳颗粒，极大提高了检测的灵敏度、准确性和精密度，减少了非特异性反应。
此外，可配合现有的一些检测体系，如采用重庆博士泰全自动特定蛋白分析仪操作，在保证检测结果准确的同时，操作更加方便，快捷，并且可以和其他肾脏疾病标志物一起检测，大批量直接上机操作，可应用于常规实验室。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括：
试剂R1，其pH为7.0-8.5；
试剂R2，其包括乳胶微球和兔抗人触珠蛋白抗体，胶乳微球的粒径为100-300nm；兔抗人触珠蛋白抗体与胶乳微球的质量比为：1:15-1:4；试剂R2的pH为8.5-9.5；
试剂R1和试剂R2用于通过胶乳增强免疫比浊法检测触珠蛋白含量。
2.根据权利要求1所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，
试剂R1，其pH为8.0；
试剂R2，其包括乳胶微球和兔抗人触珠蛋白抗体，胶乳微球的粒径为220nm；兔抗人触珠蛋白抗体与胶乳微球的质量比为：7:60；试剂R2的pH为9.0；
试剂R1和试剂R2用于通过胶乳增强免疫比浊法检测触珠蛋白含量。
3.根据权利要求1所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括缓冲液、生物防腐剂和氯化钠。
4.根据权利要求3所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，浓度为0.05-0.2mol/L。
5.根据权利要求3所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述氯化钠的浓度为10-35g/L。
6.根据权利要求1至5任一项所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，乳胶微球的质量百分含量为0.2-0.6％，和/或兔抗人触珠蛋白抗体的浓度为0.2-0.6mg/mL。
7.根据权利要求1所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中还包括蔗糖和proclin 300。
8.根据权利要求1所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，还包括触珠蛋白标准品。
9.根据权利要求1所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，检测的样本类型包括尿液。
10.根据权利要求9所述的用于检测触珠蛋白含量的试剂盒，其特征在于，尿液触珠蛋白的检测范围是20-300ng/mL，检出限10ng/mL。
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CN117368466A (zh) * 2023-12-08 2024-01-09 安徽惠邦生物工程有限公司 用生化分析仪测定尿结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法

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