CN110734882B

CN110734882B - 一种菲高效降解菌株及其在环境修复中的应用

Info

Publication number: CN110734882B
Application number: CN201911164239.1A
Authority: CN
Inventors: 唐鸿志; 张莉鸽; 许平; 王伟伟; 柳宁; 陶飞
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110734882A

Abstract

本发明公开了一种菲高效降解菌株及其在环境修复中的应用，涉及环境生物技术领域，所述菌株能以菲作为唯一碳源和能源，为鞘脂菌SZ1(Sphingobium sp.SZ1)，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019792，保藏时间为2019年10月10日。本发明提供的鞘脂菌SZ1对于菲、尤其是高浓度(200mg/L～800mg/L)菲均表现出了高效的降解能力，且对于其他多环芳烃类，如萘、芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩，同样具有一定的降解能力，从而可实现高效、清洁、无二次污染的生物环境修复处理效果。同时作为环境修复生物催化剂，具有成本低、操作简便、反应条件温和、节省能源的特点。

Description

一种菲高效降解菌株及其在环境修复中的应用

技术领域

本发明涉及环境生物技术领域，尤其涉及一种菲高效降解菌株及其在环境修复中的应用。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于环境中的有机污染物。PAHs是一类由两个或两个以上苯环组成的碳氢化合物。PAHs总体特征是高溶点、高沸点；不溶于水，易溶于苯、***、氯仿等有机溶剂；随着苯环数量的增加，其水溶性降低，生物可利用性和可降解性也随之降低。

PAHs主要是有机化合物在高温条件下(500℃～800℃)的不完全燃烧或低温处理(100℃～300℃)时的产物。随着经济快速发展，我国的PAHs污染现状十分严峻。据初步估算，我国PAHs每年的排放量超过25000吨，城市的平均排放密度为158kg/km²，农村的局部排放密度高达479kg/km²。上海市PM_2.5样品中16种主要的PAHs的平均含量为34.021ng/m³；苯并(a)芘的平均含量为3.046ng/m³，是国家标准所规定的“每24h的苯并(a)芘最高允许值2.5ng/m³的1.22倍。PAHs具有细胞毒性、免疫毒性、致癌、致畸、致突变特性，进入环境后会通过环境蓄积、生物蓄积、生物转化等方式影响人的健康，甚至导致遗传缺陷。PAHs的毒性已引起世界各国的共同关注。早在1979年，美国国家环保局(EPA)已将16种PAHs列为优先监测的污染物。因此，高效降解环境各介质中的PAHs，消除PAHs污染，对于维护人类健康和环境保护具有重要意义。

目前，PAHs主要修复方法包括物理法、化学法、焚烧法和微生物降解法。物理法和化学法主要有活性炭吸附、絮凝沉淀、光氧化法、超声波氧化法等，焚烧法则是利用高温分解污染物。传统处理方法虽然操作简单，但已经无法应付现如今愈演愈烈的污染问题。这些方法不仅处理效果不显著，而且极易产生二次污染。清洁、高效、无二次污染的微生物降解法已成为环境污染物治理最有效的方法。

菲是多环芳烃中的模式化合物。目前已经发现了众多能以菲为唯一碳源和能源生长的菌株，其中大部分是从污染土壤中分离得到，例如Pseudomonas、Sphingomonas、Mycobacterium、Rhodococcus和Bacillus。但这些菌株基本对高浓度的菲(>200mg/L)不耐受，且生长周期较长，降解速率较慢，实际环境的应用效果相对较差。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种菲高效降解菌株，且能高效降解高浓度菲，并对其他多环芳烃类化合物也具有一定的降解能力，能够实现清洁、高效、无二次污染的环境修复效果。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种菲高效降解菌株，不仅能高效降解高浓度菲，且对其他多环芳烃类化合物具有一定的降解能力，从而实现清洁、高效、无二次污染的环境修复。

为实现上述目的，本发明提供了一种菲高效降解菌株，所述菌株能以菲作为唯一碳源和能源，为鞘脂菌SZ1(Sphingobium sp.)SZ1，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2019792，保藏时间为2019年10月10日。

所述鞘脂菌SZ1为革兰氏阴性菌，其菌体呈短杆状，能运动，无芽孢，且其菌落在基础盐(MSM)培养基上生长呈白色、圆形、边缘光滑。

本发明还提供了一种如上所述的菲高效降解菌株在修复多环芳烃类污染物污染的环境或者在降解多环芳烃类污染物中的应用。

进一步地，所述应用包括去除环境中污染物菲方面的应用，具体包括以下步骤：

步骤一、对所述鞘脂菌SZ1进行培养；

步骤二、将所述步骤一培养的所述鞘脂菌SZ1接种到含有菲的污染样本中，培养去除所述污染样本中的菲。

进一步地，所述步骤一中的培养包括斜面培养和种子培养，其中所述斜面培养采用基础盐固体培养基，以菲蒸汽作为碳源；所述种子培养采用含有菲的基础盐液体培养基。

进一步地，所述基础盐固体培养基由所述基础盐液体培养基和琼脂粉组成，其中所述琼脂粉的质量体积比为1％～2％。

进一步地，所述步骤二中的所述污染样本包括水体样本。

进一步地，所述菌株降解菲的适用底物菲浓度范围为200mg/L～800mg/L。

进一步地，所述菌株降解菲的产物包括3,4-二羟基菲(3,4-dihydroxyphenanthrene)，1-羟基-2-萘甲酸(1-hydroxyl-2-naphthoic acid)，1-萘酚(1-naphthalenol)，水杨酸(salicylic acid)。

进一步地，所述应用还包括降解环境中污染物芴、咔唑、二苯并呋喃和二苯并噻吩。

与现有技术相比，本发明至少具备以下有益的技术效果：

(1)本发明提供的鞘脂菌SZ1，能够以菲作为唯一碳源和能源进行生长，且对于浓度高达200mg/L～800mg/L的菲同样具有高效的降解效果，从而可以实现高效、清洁、无二次污染地降解环境中的污染物菲，达到良好的环境生物修复处理效果；

(2)本发明提供的鞘脂菌SZ1还可对于包括萘、芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩在内的其他多环芳烃类污染物表现出一定程度的降解能力，实现更好的生物修复环境效果；

(3)本发明利用微生物鞘脂菌SZ1对菲进行生物催化，催化剂成本低、操作简便、反应条件温和，节省能源。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的鞘脂菌SZ1菌体形态的扫描电镜图；

图2是本发明的一个较佳实施例的鞘脂菌SZ1经16S rRNA序列分析的进化树图；

图3是本发明的一个较佳实施例的鞘脂菌SZ1在含有不同浓度菲的MSM液体培养基的生长情况数据图；

图4是本发明的一个较佳实施例的鞘脂菌SZ1在含有不同浓度菲的MSM液体培养基的菲降解情况数据图；

图5是本发明的提出的鞘脂菌SZ1对菲的降解途径示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本发明提供了一种能够高效分解代谢菲的新菌株-鞘脂菌SZ1(Sphingobium sp.)SZ1，可在MSM液体培养基中以200mg/L～800mg/L的菲为唯一碳源和能源进行生长。在培养过程中能够检测到菲的降解产物，如3,4-二羟基菲(3,4-dihydroxyphenanthrene)，1-羟基-2-萘甲酸(1-hydroxyl-2-naphthoic acid)，1-萘酚(1-naphthalenol)，水杨酸(salicylic acid)。由此推测，鞘脂菌SZ1代谢菲的途径是先在菲的3，4位双加氧，随后苯环断裂生成1-羟基-2-萘甲酸，先后经过1-萘酚、水杨酸，进入TCA循环，实现对菲的完全矿化(如图5所示)。经过环境模拟，该菌能在浓度高达800mg/L的菲污染水体中生长，并且在3天内可降解80％以上水体中的菲，具有一定的应用前景。

实施例一、鞘脂菌SZ1的筛选分离

1、采取样品

土样采集地点：天津多环芳烃污染石油化工污染场地。

2、菌株的筛选和分离

取5g土样溶解在50mL MSM液体培养基中，在涡旋振荡器上震荡5分钟后获得土壤溶液。取5mL土壤溶液，添加到50mL MSM液体培养基中，加入少量菲固体，于30℃，200rpm恒温摇床中培养5天。取5mL种子液转接入新的MSM培养基以相同条件培养3天后继续进行转接，传代3～4次后，将培养液稀释并涂布在MSM固体培养基上，以菲母液进行蒸汽培养，30℃下培养5～10天。挑取单菌落到新鲜的含有200mg/L菲的MSM液体培养基中，选取生长最快的菌株进行划线分离，重复多次直到获得纯化的单菌。

实施例二、鞘脂菌SZ1的鉴定

1、菌株的菌体及菌落形态特征

如图1所示，所述菌体呈短杆状，长度约为0.6μm，能运动，无芽孢；菌落在基础盐培养基上生长为偏透明的白色，圆形，菌落较小，边缘光滑，易被挑起；所述鞘脂菌SZ1为革兰氏阴性菌，喜好氧气；能以菲作为唯一碳源和能源进行生长。

2、菌株的生理生化特征

菌株为革兰氏阴性菌，喜好氧气，能够以菲作为唯一碳氮源生长。

上述菌学特征与文献(常见细菌鉴定手册，2001)编录的鞘脂菌属的生理生化性状相吻合。菌株经16S rRNA序列的***发育研究，如图2所示，和鞘脂菌属亲缘关系最近。结合以上的生理生化特征和进化树分析，将其鉴定为鞘脂菌SZ1(Sphingobium sp.)SZ1。

实施例三、鞘脂菌SZ1对菲的降解特性

1、菲浓度对菌株培养的影响

将2.5mL种子液接种到50mL含有不同浓度菲(200mg/L，350mg/L，500mg/L，650mg/L和800mg/L)的MSM液体培养基中，比较其在30℃，200rpm的培养条件下菌株的生长和菲的降解情况。可发现，菌株在200mg/L～800mg/L菲的浓度下都能生长(如图3所示)，并能较快地降解菲(如图4所示)。

2、HPLC检测菲的含量

HPLC的检测条件是：Agilent 1100高效液相色谱仪配备Eclipse XDB-C18分析柱；流动相为水：甲醇＝20：80(v/v)，流速为0.8mL/min，紫外检测波长为254nm，柱温为30℃。

使用HPLC定量检测菲浓度，配制不同浓度梯度的菲标准品，测定相应浓度下的峰面积，绘制菲标准曲线。将待测样品稀释到合适浓度后，根据峰的积分面积，由标准曲线换算出菲的浓度。

实施例四、鞘脂菌SZ1降解菲的中间代谢产物分析

1、鞘脂菌SZ1的产物样品制备

将1mL种子液接种到20mL含有200mg/L菲的MSM液体培养基中，于30℃，200rpm条件下培养。在菌株生长过程中定期取菌液20mL，平均分成两份，分别调pH至7和2，各自用10mL乙酸乙酯萃取振荡1min后，收集上层有机相。有机相用过量无水硫酸钠除水后进行浓缩干燥后，用1mL色谱级乙酸乙酯重悬，用于后续GC-MS分析。

2、GC-MS检测条件

气相色谱(Agilent 6850/5975C)进样口和检测器温度为280℃，氦气流量为1mL/min，柱前压力50kPa。升温过程为：初始进样温度75℃，保持1min；以14℃/min升温至300℃，保持8min。

GC-MS可检测到3,4-二羟基菲(3,4-dihydroxyphenanthrene)、1-羟基-2-萘甲酸(1-hydroxyl-2-naphthoic acid)、1-萘酚(1-naphthalenol)、水杨酸(salicylic acid)等中间代谢产物。

实施例五、鞘脂菌SZ1在环境修复中的模拟应用

由于实际污染环境通常较为恶劣，因此，为了模拟鞘脂菌SZ1在废水中去除菲的应用，已测试了菌株对菲浓度的适应范围(200mg/L～800mg/L)。72小时内对不同浓度菲的降解率如表1中数据所示。

通过鞘脂菌SZ1在废水中的模拟应用可知，菌株可在72小时内实现不同浓度菲的78％以上的降解，与其他菌株相比具有较高的耐受浓度和降解速度。

表1鞘脂菌SZ1对含有不同浓度菲的废水的菲降解率

菲浓度	200mg/L	350mg/L	500mg/L	650mg/L	800mg/L
						72h菲降解率	80.0％	94.1％	78.0％	93.3％	83.1％

实施例六、鞘脂菌SZ1对其他多环芳烃的降解性能

环境中多环芳烃的污染往往是多种污染物的复合污染，因此测定了不同多环芳烃对鞘脂菌SZ1培养的影响。

1、鞘脂菌SZ1对不同多环芳烃的利用情况

其他多环芳烃为：萘、芴、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)芘、苯并(a)蒽、二苯并呋喃、二苯并噻吩、咔唑、联苯，共11种。

将2.5mL种子液接种到50mL含有100mg/L多环芳烃的MSM液体培养基中，30℃，200rpm培养。72小时后比较其在不同多环芳烃培养条件下菌株的生长情况。

2、生长情况测定

含有菌体的液体培养基与等体积乙酸乙酯在常温充分萃取，静置片刻后取1mL下层水相，检测其在600nm波长下的吸光值，以其作为菌株生长状态的衡量标准。“+”表示72小时后达到0.2～0.4个光密度，“++”表示72小时后达到0.4～0.8个光密度，“-”表示吸光值与接种前基本无异。

测定结果如表2所示，鞘脂菌SZ1对萘、芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩均有不同程度的利用，对蒽、荧蒽、芘、苯并(a)芘、苯并(a)蒽、联苯没有利用能力，具有较广的底物谱。

表2鞘脂菌SZ1对不同多环芳烃的利用情况

底物	能否生长
		萘	+
芴	+
		咔唑	++
二苯并呋喃	+
		二苯并噻吩	++
蒽	-
		荧蒽	-
芘	-
		苯并(a)芘	-
苯并(a)蒽	-
		联苯	-

实施例七、鞘脂菌SZ1对芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩的降解特性

1、芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩对菌株培养的影响

实施例六中已知鞘脂菌SZ1对芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩具有较好的利用能力，遂进一步检测鞘脂菌SZ1对这四种多环芳烃的具体降解特性。

将2.5mL种子液接种到50mL含有100mg/L多环芳烃的MSM液体培养基，72小时后取含有菌体的液体培养基与等体积乙酸乙酯在常温充分萃取，静置片刻后取上清进行多环芳烃检测。

2、HPLC检测多环芳烃的含量

使用HPLC定量检测底物浓度，配制不同浓度梯度的多环芳烃标准品，测定相应浓度下的峰面积，绘制标准曲线。将待测样品稀释到合适浓度后，根据峰的积分面积，由标准曲线换算出多环芳烃的浓度。

如表3所示，鞘脂菌SZ1能用于降解芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩，且在初始浓度为100mg/L的条件下，72小时可降解45％以上的底物，与其他类似菌株相比具有较高的降解活性。

表3鞘脂菌SZ1对芴、咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩的降解率

底物	芴	咔唑	二苯并呋喃	二苯并噻吩
					72h降解率	54.8％	51.8％	45％	53.3％

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种菲高效降解菌株，其特征在于，所述菌株能以菲作为唯一碳源和能源，为鞘脂菌(Sphingobium sp.)SZ1，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M 2019792，保藏时间为2019年10月10日。

2.一种如权利要求1所述的菲高效降解菌株在修复多环芳烃类污染物污染的环境中的应用，其特征在于，所述多环芳烃类污染物污染的环境中包含萘、芴、咔唑、二苯并呋喃或二苯并噻吩。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括去除环境中污染物菲方面的应用，具体包括以下步骤：

步骤一、对所述鞘脂菌SZ1进行培养；

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤一中的培养包括斜面培养和种子培养，其中所述斜面培养采用基础盐固体培养基，以菲蒸汽作为碳源；所述种子培养采用含有菲的基础盐液体培养基。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基础盐固体培养基由所述基础盐液体培养基和琼脂粉组成，其中所述琼脂粉的质量体积比为1％～2％。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤二中的所述污染样本包括水体样本。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株降解菲的适用底物菲浓度范围为200mg/L～800mg/L。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株降解菲的产物包括3,4-二羟基菲(3,4-dihydroxyphenanthrene)，1-羟基-2-萘甲酸(1-hydroxyl-2-naphthoic acid)，1-萘酚(1-naphthalenol)，水杨酸(salicylic acid)。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用还包括降解环境中污染物芴、咔唑、二苯并呋喃和二苯并噻吩。