CN110623858A - 一种维生素a纳米包裹体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种维生素A纳米包裹体的制备方法及其应用。所述的纳米包裹体具体组成如下:维生素A 1‑10%;甘油2‑70%;磷脂1‑10%;抗氧化剂1‑10%;油脂1‑25%;乳化剂1‑15%,以水补足至100%。本发明所制备的维生素A纳米包裹体、粒径达20‑200nm、水分散性好、稳定性高、透皮吸收好、通过缓慢释放活性物,大大降低了维生素A在化妆品配方中应用的刺激性,可广泛用于化妆品技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域,具体涉及一种维生素A纳米包裹体的制备方法及其应用。
背景技术
随着人们对精神生活追求的不断提高,消费者更加注重皮肤的保养,而化妆品科学的研究发展使得消费者对化妆品功效的需求日益增长,抗衰老护肤成为最主要的消费诉求之一。
衰老(aging,Senescence)又称老化,是指在正常状况下生物体发育成熟后,随年龄增长机体发生的功能性和器质性衰退的渐进过程,一方面受机体基因的调控,另一方面由外环境中各种有害因素所引起。皮肤位于体表是机体衰老过程中最显著的部分,皮肤衰老分为两种类型:自然老化和光老化。自然老化是值由于机体内在因素的作用(主要为遗传因素)引起,见于暴露部位和非暴露部位皱纹和皮肤松弛;光老化则是指皮肤经日光紫外线长期反复照射的结果,表现为皮肤部位粗糙、皱纹加深加粗、结构异常、色素沉着、血管扩张、表皮角化不良等现象。
维生素A属于脂溶性维生素,是保持皮肤上皮组织健康的必需维生素,影响着细胞的代谢过程,有多种活性异构体,包括视黄醇(retinol,A醇)、视黄醛(retinal,A醛)、视黄酸(retinoic acid,A酸),还有几种类胡萝卜素。不管是醇、醛、还是酯,它们最终都会通过皮肤上的内源性酶促反应转化为A 酸。临床上,A酸用于治疗痤疮,光老化的外用药已有30多年的历史,但具有强烈的刺激性,因此仅作为处方药应用于皮肤科的治疗。视黄醇及其衍生物视黄醛、视黄醇棕榈酸酯、氢化视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇亚油酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯同样可以作用于肌肤表皮,加速新陈代谢、维持肌肤正常循环,刺激胶原蛋白生成,减少皱纹,减少色素沉着、增加皮肤的弹性,延缓皮肤的衰老,并且相对于A酸,其具有更低的刺激性,然而它们在应用到化妆品中仍然存在稳定性差,易被氧化,水溶性差,生物利用度低等问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的化妆品原料维生素A(包括视黄醛、视黄醇棕榈酸酯等)在应用过程中存在的技术问题,现有技术当中的维生素A脂质体混悬液存在明显的不足,稳定性不高,水溶液中分散性不佳等问题,本发明提供一种维生素A纳米包裹体,该包裹体具有刺激小、水分散性好、性质稳定、易被皮肤吸收、抗衰效果好等特点。
本发明的另一目的是将该维生素A纳米包裹体用于抗衰类化妆品中,开发出刺激性小、性质稳定、效果良好的抗衰化妆品。
为了实现以上目的,本发明通过如下技术方案来实现:
一种维生素A纳米包裹体,按质量百分比计,其特征在于包括如下组分:
优选地,一种维生素A纳米包裹体,按质量百分比计,其特征在于包括如下组分:
本发明的另一方面,其中所述维生素A为视黄醛、视黄醇棕榈酸酯、氢化视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇亚油酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯中的一种或两种及以上的混合物。所述磷脂为卵磷脂、氢化卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、合成磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱中的一种或两种及以上的混合物。所述抗氧化剂为生育酚乙酸酯、生育酚琥珀酸酯、丁羟甲苯、亚丁香基丙二酸二乙基己酯中的一种或两种及以上的混合物。所述油脂为角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯、甘油三(乙基己酸)酯、异壬酸异壬酯、棕榈酸异辛酯中的一种或两种及以上的混合物。所述的乳化剂为吐温20、吐温60、吐温80、PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、月桂醇聚醚-23、聚甘油2-单硬脂酸酯、硬脂醇聚醚-21、硬脂醇聚醚-2、甘油硬脂酸酯、PEG-60氢化蓖麻油中的一种或两种及以上的混合物。
本发明的另一方面,所述维生素A纳米包裹体的制备方法,其包括如下步骤:
(1)按所述质量配比的磷脂、甘油、选择性加入抗氧化剂、乳化剂在40-60℃水浴中加热,200rpm/min转速下搅拌均匀,得甘油溶液。
(2)步骤(1)所得的甘油溶液开启搅拌200rpm/min转速下选择性地加入油脂 1-25%,持续搅拌均匀,得到淡黄色乳化体;
(3)取去离子水1-40%加热到75-95℃,冷却至60℃,得外水相。
(4)步骤(2)所得的淡黄色乳化体开启搅拌,1000rpm转速搅拌条件下,加入步骤(3)制得的外水相,均质搅拌得到维生素A纳米包裹体。
本发明的另一方面,所述的维生素A纳米包裹体可以应用在抗衰功效的化妆品中。本发明所制备的维生素A纳米包裹体在化妆品应用中的质量百分比为 1-5%,优选用量为2-4%。除了含有上述维生素A纳米包裹体以外,可以根据需要添加适合抗衰功效化妆品中使用的常用成分,如保湿剂、润肤剂、乳化剂、增稠剂等基质成分。
本发明的有益效果是制备的维生素A纳米包裹体,外观呈淡黄色粘稠状,平均粒径可达20-200nm。加到水中制成的水分散液透明度高,可用于透明的化妆品体系中。总之、本发明制备的维生素A纳米包裹体具有刺激小、纳米级粒径、水中分散性好、性质稳定,易被皮肤吸收、抗衰效果好等特点。
具体实施方式
下述结合具体实施例对本发明做进一步描述,但不以任何方式限制本发明。
实施例1:
一种维生素A纳米包裹体的制备方法,采用以下步骤:
(1)称取氢化卵磷脂3g,视黄醛3g,聚甘油2-单硬脂酸酯4g,PEG-60氢化蓖麻油5g,甘油50g,置于60℃水浴中熔化均匀得甘油溶液。
(2)称取亚丁香基丙二酸二乙基己酯0.5g,角鲨烷2g,辛酸/癸酸甘油三酯10g,200rpm/min搅拌条件下加入步骤(1)所得的甘油溶液中。
(3)称取去离子水22.5g水浴加热到90℃,冷却至60℃,得外水相。
(4)步骤(3)中的水相在1000rpm/min搅拌条件下加入步骤(2)中,最后均质得到维生素A纳米包裹体。
经检测所制备的维生素A纳米包裹体平均粒径30nm。所得维生素A纳米包裹体在4℃、25℃、45℃、-18℃、光照条件下存放30天,外观性状和粒径无明显变化。
实施例2:
一种维生素A纳米包裹体的制备方法,采用以下步骤:
(1)称取氢化卵磷脂2g,视黄醇棕榈酸酯3g,聚甘油2-单硬脂酸酯4g,PEG-60 氢化蓖麻油6g,甘油50g,置于60℃水浴中熔化均匀得甘油溶液。
(2)称取亚丁香基丙二酸二乙基己酯0.5g,角鲨烷2g,辛酸/癸酸甘油三酯10g,200rpm/min搅拌条件下加入步骤(1)所得的甘油溶液中。
(3)称取去离子水22.5g水浴加热到90℃,冷却至60℃,得外水相。
(4)步骤(3)中的水相在1000rpm/min搅拌条件下加入步骤(2)中,最后均质得到维生素A纳米包裹体。
经检测所制备的维生素A纳米包裹体平均粒径40nm。
实施例3:
一种维生素A纳米包裹体的制备方法,采用以下步骤:
(1)称取氢化卵磷脂1g,羟基频哪酮视黄酸酯3g,聚甘油2-单硬脂酸酯5g, PEG-60氢化蓖麻油5g,甘油40g,置于60℃水浴中熔化均匀得甘油溶液。
(2)称取亚丁香基丙二酸二乙基己酯0.5g,角鲨烷2g,辛酸/癸酸甘油三酯15g,200rpm/min搅拌条件下加入步骤(1)所得的甘油溶液中。
(3)称取去离子水28.5g水浴加热到90℃,冷却至60℃,得外水相。
(4)步骤(3)中的水相在1000rpm/min搅拌条件下加入步骤(2)中,最后均质得到维生素A纳米包裹体。
经检测所制备的维生素A纳米包裹体平均粒径58nm。
实施例4:一种抗衰美白霜的制备
抗衰修护霜的制备方法如下:①分别称取A相原料加热至80-85℃,溶解搅拌均匀,保温20-30min作为水相备用。②称取B相各原料加热至85℃,溶解均匀作为油相。③搅拌条件下将油相缓缓加入至水相中搅拌均匀,均质2-3min继续加入C相均质2-3min,冷却。④冷却至45℃以下,加入实施例1所制备的维生素A 纳米包裹体和D相剩余原料,搅拌均匀,继续冷却至室温即得抗衰美白霜。
实施例5:一种抗衰精华液的制备
抗衰精华液的制备方法如下:①分别称取A相原料加热至80-85℃,溶解搅拌均匀,保温20-30min作为水相备用。②称取B相各原料加热至85℃,溶解均匀作为油相。③搅拌条件下将油相缓缓加入至水相中搅拌均匀,均质2-3min继续加入C相均质2-3min,搅拌冷却。④冷却至45℃以下,加入实施例1所制备的维生素A纳米包裹体和D相剩余原料,搅拌均匀,继续冷却至室温即得抗衰精华液。
Claims (6)
1.一种维生素A纳米包裹体,按质量百分比计,其特征在于包括如下组分:
所述的乳化剂为吐温20、吐温60、吐温80、PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、月桂醇聚醚-23、聚甘油2-单硬脂酸酯、硬脂醇聚醚-21、硬脂醇聚醚-2、甘油硬脂酸酯、PEG-60氢化蓖麻油中的一种或两种及以上的混合物。
2.如权利要求1所述的维生素A纳米包裹体其特征在于包括如下组分:
3.如权利要求1所述的维生素A纳米包裹体其特征在于所述所述维生素A为视黄醛、视黄醇棕榈酸酯、氢化视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇亚油酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯中的一种或两种及以上的混合物。
4.如权利要求1所述的维生素A纳米包裹体其特征在于所述抗氧化剂为生育酚乙酸酯、生育酚琥珀酸酯、丁羟甲苯、亚丁香基丙二酸二乙基己酯中的一种或两种及以上的混合物。
5.如权利要求1所述的维生素A纳米包裹体其特征在于所述油脂为角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯、甘油三(乙基己酸)酯、异壬酸异壬酯、棕榈酸异辛酯中的一种或两种及以上的混合物。
6.如权利要求1所述的维生素A纳米包裹体可以应用在抗衰功效的化妆品中,其应用质量百分比为1-5%。
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CN (1) | CN110623858A (zh) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111228136A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-06-05 | 湖州浦瑞生物医药技术有限公司 | 抗衰老去皱复合纳米制剂及其制备方法和用途 |
CN111358734A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-07-03 | 上海新高姿化妆品有限公司 | 一种分仓式的抗衰老化妆品组合物 |
CN111544317A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-18 | 珀莱雅化妆品股份有限公司 | 一种抗衰老组合物阳离子纳米脂质体及其制备方法与应用 |
CN111920702A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-11-13 | 上海益好纳米科技有限公司 | 视黄醇纳米脂质体及其制备方法 |
CN111939116A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-11-17 | 东晟源研究院(广州)有限公司 | 一种抗衰老组合物及其制备方法 |
CN112932990A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-06-11 | 广州樊文花化妆品有限公司 | 一种抗衰组合物及其制备方法和应用 |
CN112957276A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-06-15 | 武汉百思凯瑞生物科技有限公司 | 一种多效羟基频哪酮视黄酸酯纳米组合物及其制备方法和应用 |
CN114588067A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-06-07 | 上海世领制药有限公司 | 羟基频哪酮视黄酸酯高油促渗传递体、制备方法及其应用 |
CN114939079A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-08-26 | 上海奥利实业有限公司 | 一种视黄醇及其衍生物包裹体的制备方法及其应用 |
CN115569086A (zh) * | 2022-05-05 | 2023-01-06 | 广州同隽医药科技有限公司 | 一种高稳定性的羟基频哪酮视黄酸酯组合物及其应用 |
CN115645302A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-01-31 | 广州市英朴司生物科技有限公司 | 一种视黄醇包裹物及其制备方法 |
CN115836985A (zh) * | 2022-03-30 | 2023-03-24 | 广东格烯生物科技股份有限公司 | 一种水溶性视黄醇棕榈酸酯组合物及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20050024539A (ko) * | 2003-09-03 | 2005-03-10 | 주식회사 한생화장품 | 나노 에멀젼, 이의 제조 방법 및 이를 함유한 화장료 조성물 |
KR20050091162A (ko) * | 2004-03-11 | 2005-09-15 | 주식회사 화진화장품 | 비타민 에이, 비, 씨이, 이 및 그들의 유도체를 함유한나노에멀전과 리포좀의 제조방법 및 이을 함유한 화장료조성물 |
CN102552058A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 东南大学 | 复合维生素脂质纳米粒及其制备方法 |
CN109453043A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-12 | 诺斯贝尔化妆品股份有限公司 | 一种稳定性良好的纳米乳液 |
-
2019
- 2019-08-28 CN CN201910811369.3A patent/CN110623858A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20050024539A (ko) * | 2003-09-03 | 2005-03-10 | 주식회사 한생화장품 | 나노 에멀젼, 이의 제조 방법 및 이를 함유한 화장료 조성물 |
KR20050091162A (ko) * | 2004-03-11 | 2005-09-15 | 주식회사 화진화장품 | 비타민 에이, 비, 씨이, 이 및 그들의 유도체를 함유한나노에멀전과 리포좀의 제조방법 및 이을 함유한 화장료조성물 |
CN102552058A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 东南大学 | 复合维生素脂质纳米粒及其制备方法 |
CN109453043A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-12 | 诺斯贝尔化妆品股份有限公司 | 一种稳定性良好的纳米乳液 |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111228136A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-06-05 | 湖州浦瑞生物医药技术有限公司 | 抗衰老去皱复合纳米制剂及其制备方法和用途 |
CN111358734A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-07-03 | 上海新高姿化妆品有限公司 | 一种分仓式的抗衰老化妆品组合物 |
CN111544317A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-18 | 珀莱雅化妆品股份有限公司 | 一种抗衰老组合物阳离子纳米脂质体及其制备方法与应用 |
CN111939116A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-11-17 | 东晟源研究院(广州)有限公司 | 一种抗衰老组合物及其制备方法 |
CN111920702A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-11-13 | 上海益好纳米科技有限公司 | 视黄醇纳米脂质体及其制备方法 |
CN112957276A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-06-15 | 武汉百思凯瑞生物科技有限公司 | 一种多效羟基频哪酮视黄酸酯纳米组合物及其制备方法和应用 |
CN112932990A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-06-11 | 广州樊文花化妆品有限公司 | 一种抗衰组合物及其制备方法和应用 |
CN114588067A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-06-07 | 上海世领制药有限公司 | 羟基频哪酮视黄酸酯高油促渗传递体、制备方法及其应用 |
CN115836985A (zh) * | 2022-03-30 | 2023-03-24 | 广东格烯生物科技股份有限公司 | 一种水溶性视黄醇棕榈酸酯组合物及其制备方法 |
CN115569086A (zh) * | 2022-05-05 | 2023-01-06 | 广州同隽医药科技有限公司 | 一种高稳定性的羟基频哪酮视黄酸酯组合物及其应用 |
CN114939079A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-08-26 | 上海奥利实业有限公司 | 一种视黄醇及其衍生物包裹体的制备方法及其应用 |
CN114939079B (zh) * | 2022-05-19 | 2024-04-23 | 上海奥利实业有限公司 | 一种视黄醇及其衍生物包裹体的制备方法及其应用 |
CN115645302A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-01-31 | 广州市英朴司生物科技有限公司 | 一种视黄醇包裹物及其制备方法 |
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