CN110607286B

CN110607286B - 灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用

Info

Publication number: CN110607286B
Application number: CN201910773782.5A
Authority: CN
Inventors: 林俊芳; 余颖豪; 郭丽琼; 廖寒露; 李浩莹
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2039-08-21
Also published as: CN110607286A

Abstract

本发明公开一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用，属于生物合成生物学领域。本发明利用同源比对的方法找出灰树花中可能的麦角硫因合成酶基因Gfegt1、Gfegt2，并利用提取灰树花RNA后反转录成cDNA进行克隆获取。本发明构建利用酵母启动子启动Gfegt1、Gfegt2两个基因表达的载体并转化至酿酒酵母EC1118中，随后通过添加底物让酿酒酵母吸收，在体内反应催化合成麦角硫因，进行提取后通过高效液相色谱(HPLC)检测麦角硫因产物的生成，实现了体内生物合成麦角硫因。本发明为麦角硫因的生产提供一条全新的生物合成途径。

Description

灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用

技术领域

本发明属于生物合成生物学领域，特别涉及一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，简称EGT)是一种抗氧化物质，在细菌和真菌起着维持氧化还原稳态，信号传导，细胞代谢等重要作用。Tanret(1909)首次在麦角菌(Clavicepspurpurea)发现该物质，并为其命名。麦角硫因是组氨酸三甲基甜菜碱的衍生物，在咪唑环上第二个C原子连接着一个巯基，以硫酮的形式存在，其标准还原电势会比以硫醇形式存在的标准还原电势低，因此麦角硫因会比其他硫醇类化合物(如谷胱甘肽)更稳定(Cheah etal.,2012)。

麦角硫因具有在体外和少数体内具有多种抗氧化和保护细胞的功能，包括自由基的清除、抗辐射、抗炎症、修复神经元损伤等(Cheah et al.,2012)，但不能在动物体内合成，只能从细菌或真菌中获取。麦角硫因存在于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)，蓝细菌(Certaincyanobacteria)，甲基杆菌属(Methylobacterium)以及大部分的非酵母真菌，包括粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等丝状真菌(Cumming et al.,2018)。其中，大部分食用菌中含有丰富的麦角硫因，其中美味牛肝菌(Boletus edulis)含量较高，每克干重中有7.27mg麦角硫因(Kalaras et al.,2017)。

由细菌中五个合成酶基因形成的一个基因簇egtABCDE和真菌中两个合成酶基因Egt1、2组成了两个不同的合成途径。细菌合成途径中，egtA催化谷氨酸和半胱氨酸生成γ-半胱酰胺-谷氨酸；egtD催化组氨酸甲基化形成组氨酸甜菜碱；egtB在氧气和亚铁离子的协助下，将γ-半胱酰胺-谷氨酸的硫原子与组氨酸甜菜碱咪唑环上的碳原子结合形成一个含有亚砜结构的化合物；egtC催化组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜上的谷氨酸裂解；egtE则催化CS键的裂解，最终形成麦角硫因。真菌合成途径中，egt1催化甲基化组氨酸，与半胱氨酸形成CS键，形成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜；egt2使前提物的CS键裂解，形成麦角硫因。由此可见，由于只需两个酶参与合成反应，因此真菌的生物合成途径远远简洁于细菌的合成途径，对麦角硫因的生产及应用研究提供更多的便利。

目前，已有报导通过构建含egtABCDE的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌株以大量发酵麦角硫因，产量达到24mg每升发酵液(Osawa et al.,2018)。然而关于真菌类的egt1、2的研究都是以蛋白结构研究为主(Hu et al.,2014,Irani et al.,2018)，而且只是以粗糙脉孢菌为研究基础，目前还没有更多以发酵为主的应用和以食用菌为基础的相关研究。而林俊芳(2018)对金针菇中麦角硫因三个基因进行克隆并验证其活性。因此针对食用菌中egt1、2目的基因的进行研究应用是具有良好前景的。

发明内容

为了克服现有技术中麦角硫因的生物合成途径的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用。本发明只需两个基因即可进行麦角硫因的从头合成。

本发明的另一目的在于提供灰树花麦角硫因基因Gfegt1、Gfegt2。

本发明的另一目的在于提供上述灰树花麦角硫因基因所编码的蛋白质。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用。

优选的，灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在体外联合生物合成麦角硫因中的应用。

进一步优选的，灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在酿酒酵母体内合成麦角硫因中的应用。

优选的，所述的酿酒酵母为酿酒酵母EC1118。

所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。

所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1编码的蛋白质Gfegt1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码上述蛋白质的灰树花麦角硫因基因Gfegt1的核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种灰树花麦角硫因基因Gfegt2编码的蛋白质Gfegt2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

编码上述蛋白质的灰树花麦角硫因基因Gfegt2的核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任意片段的引物。

一种重组表达载体，以pYES2为出发载体，依次***Gfegt2、pPGK、Gfegt1、KanMX4获得；或者，以pRS42k为出发载体，依次***TEF1p、Gfegt1、CYC1t、TEF1p、Gfegt2、CYC1t获得。

一种重组菌，含有上述所述的重组表达载体。

其中，GfEGT1酶能将组氨酸(His)，S-腺苷蛋氨酸(SAM)等底物催化生成组氨酸三甲基内盐，接着后者与半胱氨酸(Cys)，亚铁离子等为底物在GfEGT1酶的催化下生成组氨酸三甲基内盐半胱氨酸亚砜。

GfEGT2酶能将组氨酸三甲基内盐半胱氨酸亚砜在辅酶磷酸吡哆醛(PLP)等底物催化生成麦角硫因。

本发明的机理是：

灰树花(Grifola frondosus)又名舞茸，属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，是一种天然珍稀食药用真菌。灰树花富含蛋白质、维生素等多种营养物质，近年来被开发为新型保健品，和护肤品。我们以粗糙脉孢菌中的Ncegt1(NCU04343)，Ncegt2(NCU11365)，使用NCBI网站的Blast工具，对灰树花数据库中的基因进行比对，找出与已知序列相似度高的未鉴定基因，分别对应命名为Gfegt1(GenBank:OBZ71212.1,OBZ71213.1)(数据库中的两个组合成一个基因)、Gfegt2(GenBank:OBZ72541.1)，并以此设计特异性引物，以提取灰树花中的RNA反转录后的cDNA为模板进行克隆，获得合成麦角硫因途径中的两个基因，在酿酒酵母EC1118体内进行表达，实现了体内生物合成麦角硫因。本发明为麦角硫因的生产提供一条全新的生物合成途径。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)Gfegt1、Gfegt2基因的克隆。利用同源比对的方法找出灰树花中可能的麦角硫因合成酶基因Gfegt1、Gfegt2，并利用提取灰树花RNA后反转录成cDNA进行克隆获取。运用DNAMAN软件进行序列比对分析可知，灰树花麦角硫因基因Gfegt1核苷酸序列与粗糙脉孢菌基因Ncegt1核苷酸序列有41.56％相似度，灰树花麦角硫因基因Gfegt1氨基酸序列与粗糙脉孢菌基因Ncegt1氨基酸序列有32.72％相似度；灰树花麦角硫因基因Gfegt2核苷酸序列与粗糙脉孢菌基因Ncegt2核苷酸序列有46.34％相似度，灰树花麦角硫因基因Gfegt2氨基酸序列与粗糙脉孢菌基因Ncegt2氨基酸序列有32.74％相似度。

(2)Gfegt1、Gfegt2基因的功能验证。构建利用酵母启动子启动Gfegt1、Gfegt2两个基因表达的载体并转化至酿酒酵母EC1118中，随后通过添加底物让酿酒酵母吸收，在体内反应催化合成麦角硫因。进行提取后通过高效液相色谱(HPLC)检测麦角硫因产物的生成。

附图说明

图1是灰树花总RNA电泳图。

图2是灰树花麦角硫因基因Gfegt1、Gfegt2从灰树花cDNA进行RT-PCR扩增后的结果电泳图。

图3是pYES2-Gfegt1-Gfegt2表达质粒图谱。

图4是实施例1中麦角硫因标准品的HPLC的检测结果。

图5是实施例1中野生型酿酒酵母EC1118(WT)发酵后的HPLC的检测麦角硫因结果；其中，a是原有大小，b为放大纵坐标大小。

图6是实施例1中改造型酿酒酵母EC1118(pYES2-Gfegt1-Gfegt2)发酵后的HPLC的检测麦角硫因结果；其中，a是原有大小，b为放大纵坐标大小。

图7是pRS42k-Gfegt1-Gfegt2表达质粒图谱。

图8是实施例2中麦角硫因标准品的HPLC的检测结果。

图9是实施例2中野生型酿酒酵母EC1118(WT)发酵后的HPLC的检测麦角硫因结果。

图10是实施例2中改造型酿酒酵母EC1118(pRS42k-Gfegt1-Gfegt2)发酵后的HPLC的检测麦角硫因结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1.1材料与方法

1.1.1菌株与质粒

灰树花菌种购自北京吉蕈园科技有限公司；pMD18T质粒购自宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)，大肠杆菌DH5α购自上海唯地生物技术有限公司，用于基因克隆；酿酒酵母EC1118和对应的pYES2质粒：酿酒酵母EC1118购自Lallemand公司，pYES2质粒购自Invitrogen公司；pRS42k由Christof Taxis教授和Michael Knop教授馈赠，也有在文献中“System of centromeric,episomal,and integrative vectors based on drugresistance markers for Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechniques 2006,40(1):73-78.”公开，用于基因表达。

1.1.2培养基及试剂配制

PDB培养基：用于灰树花菌丝的培养。土豆(去皮)200g，葡萄糖20g，MgSO₄·7H₂O1.5g，KH₂PO₄ 3g，蒸馏水定容至1L，自然pH，琼脂20g(固体培养基添加)，121℃高压蒸汽灭菌30min。

LB培养基：用于大肠杆菌的培养。胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，pH 7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min。

YPD培养基：用于酵母的培养。蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，自然pH，115℃高压蒸汽灭菌15min。

YPG培养基：用于酵母的诱导培养。蛋白胨20g，酵母提取物10g，半乳糖20g，蒸馏水定容至1L，自然pH，115℃高压蒸汽灭菌15min。

10×STE Buffer：50mM Tris，10mM EDTA，1M NaCl，pH8.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。

3M NaAc：取24.6g CH₃COONa·3H₂O溶于ddH₂O，冰醋酸调pH至5.5，加ddH₂O定容至100mL。121℃高压蒸汽灭菌30min。

酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)：取25mL酚，24mL氯仿，1mL异戊醇混合。

0.1M CaCl₂：取1.11g CaCl₂溶于ddH₂O并容至100mL。121℃高压蒸汽灭菌30min。

50×TAE：取242g Tris，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g溶于800mL ddH₂O，再加入57.1mL冰醋酸，再加ddH₂O定容至1L。

1％琼脂糖凝胶：取0.2g琼脂糖溶于ddH₂O并定容至20mL。

100mg/mL Amp：取0.1g氨苄青霉素(Amp)干粉溶于1mL ddH₂O，0.22μm微孔滤膜过滤。

100mg/mL G418：取0.1g遗传霉素(G418)干粉溶于1mL ddH₂O，0.22μm微孔滤膜过滤。

10×TE Buffer：100mM Tris，10mM EDTA，pH8.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。

1M LiAc：取6.6g LiAc溶于ddH₂O，冰醋酸调pH至8.0，加ddH₂O定容至100mL。121℃高压蒸汽灭菌30min。

50％PEG4000：取50g PEG4000加ddH₂O定容至100mL。

0.5M组氨酸：0.7758g组氨酸溶于10mL ddH₂O中。

1M半胱氨酸盐酸盐：1.750g半胱氨酸盐酸盐溶于10mL ddH₂O中。

0.2M S-腺苷蛋氨酸：0.8000g腺苷蛋氨酸溶于10mL ddH₂O中。

0.1M磷酸吡哆醛：0.2651g磷酸吡哆醛溶于10mL ddH₂O中。

0.1M FeSO₄·7H₂O：0.2780g FeSO₄·7H₂O溶于10mL ddH₂O中。

1.1.3酶与试剂盒

反转录试剂盒TransCript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix(AT311)购自北京全式金生物。

用于扩增目的基因的DNA聚合酶KOD Fx(KFX-101)购自Toyobo，用于构建质粒的DNA聚合酶PrimeStar Max(R045A)购自Takara，用于添加A碱基的DNA聚合酶2×TaqMix购自广州东盛生物科技有限公司。

限制性核酸内切酶Hind III，EcoR I购自Thermo Fisher Scientific。

用于同源重组的试剂盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

用于质粒提取的试剂盒HiPure Plasmid Mini Kit和核酸纯化回收试剂盒HiPureGel Pure DNA Mini Kit购自美基生物。

1.1.4引物序列信息

1.2麦角硫因的生物合成基因的功能研究

1.2.1麦角硫因合成酶基因的获取

采用STE法提取灰树花RNA，具体方法参考税丕容(2008)。将提取得到的总RNA用TransCript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行反转录获取cDNA。以该灰树花cDNA为模板，采用引物Gfegt1-F&Gfegt1-R和Gfegt2-F&Gfegt2-R利用DNA聚合酶KOD Fx分别扩增Gfegt1、Gfegt2目的基因，反应体系和反应参数如下：

PCR反应体系：

灰树花cDNA模板	1μL
		Gfegt1-F&Gfegt1-R或Gfegt2-F&Gfegt2-R	4μL
2×PCR Buffer for KOD FX	25μL
		2mM dNTPs	10μL
KOD FX	1μL
		dd H<sub>2</sub>O	9μL
合计	50μL

PCR反应参数：94℃预变性2min，94℃变性10sec，Gfegt1 55℃退火30sec，68℃延伸2min36sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min；94℃预变性2min，94℃变性10sec，Gfegt2 55℃退火30sec，68℃延伸1min24sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min。

PCR产物经1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定后，采用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit试剂盒进行核酸的回收，步骤详见说明书。

1.2.2克隆载体与目的基因的连接

通过KOD FX扩增出的目的条带为平末端片段，为了能与pMD18T进行连接，需要在片段3′处利用DNA聚合酶2×TaqMix加上A碱基，反应体系和反应参数如下：

加A碱基体系：

Gfegt2或Gfegt1	25μL
		2×TaqMix	25μL
合计	50μL

加A碱基反应参数：70℃孵育30min。

加A碱基片段经1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定后，采用HiPure Gel Pure DNA MiniKit试剂盒进行核酸的回收，步骤详见说明书。

回收加A碱基片段后，与pMD18T进行连接，具体的反应体系和反应参数如下：

pMD18T连接体系：

pMD18T	1μL
		加A碱基片段	4μL
Solution I	5μL
		合计	10μL

pMD18T连接反应参数：16℃孵育2h。

连接后的产物转化进0.1M CaCl₂制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用DNA聚合酶2×TaqMix对菌落进行鉴定，反应体系和反应参数如下：

菌落鉴定反应体系：

2×TaqMix	5μL
		RV-M	1μL
M13-47	1μL
		1个菌落的dd H<sub>2</sub>O	3μL
合计	10μL

菌落鉴定PCR反应参数如下：94℃预变性3min，94℃变性30sec，Gfegt1 55℃退火30sec，68℃延伸2min36sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min；94℃预变性3min，94℃变性30sec，Gfegt2 55℃退火30sec，68℃延伸1min24sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min。

PCR产物经1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定后，选取对应有目的条带的菌落送至天一辉远生物科技有限公司进行测序。对测序结果正确的菌落进行保存备用。

1.2.3表达质粒的构建与转化

1.2.3.1基因片段的添加同源臂

本次构建载体的方法为同源重组法，利用同源重组酶将多片段质粒连接至表达载体pYES2中，添加同源臂采用的是DNA聚合酶PrimeStar Max利用引物pYES2-Gfegt2-F&pYES2-Gfegt2-R/pYES2-Gfegt1-F&pYES2-Gfegt1-R/pYES2-KanMX4-F&pYES2-KanMX4-R/Sc-pPGK-F&Sc-pPGK-R分别扩增带有同源臂目的基因Gfegt1和Gfegt2，带有同源臂的G418抗性基因，带有同源臂的pPGK启动子反应体系和反应参数如下：其中，G418抗性基因KanMX4来源于pRS42k；pPGK启动子的GenBank Acession No.X59720。

带同源臂PCR反应体系：

带同源臂PCR反应参数：94℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃退火15sec，pYES2-Gfegt272℃延伸7sec/pYES2-Gfegt1延伸13sec/pYES2-KanMX4延伸7sec/Sc-pPGK延伸5sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min。

1.2.3.2载体的双酶切

过夜摇菌，用质粒提取的试剂盒HiPure Plasmid Mini Kit提取pYES2质粒。随后用采用FastDigest EcoR I和FastDiest Hind III对质粒进行双酶切，反应体系和参数如下：

双酶切反应体系：

10×FastDigest Buffer	2μL
		EcoR I	1μL
Hind III	1μL
		模板	1μg
dd H<sub>2</sub>O	补至20μL
		合计	20μL

双酶切反应参数：37℃孵育40min，80℃失活5min，4℃冰浴5min。

双酶切产物经1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定后，采用HiPure Gel Pure DNA MiniKit试剂盒进行核酸的回收，步骤详见说明书。

1.2.3.3表达质粒的构建

构建载体的同源重组酶采用的是ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，一个载体片段与多基因片段进行同源重组后，构建成一个环状结构的质粒。具体的反应体系和参数如下：

同源重组反应体系：

2×ClonExpress Mix	5μL
		双酶切pYES2	114ng
pYES2-Gfegt2	42ng
		pYES2-Gfegt1	78ng
pYES2-KanMX4	42ng
		Sc-pPGK	27ng
dd H<sub>2</sub>O	补至10μL
		合计	10μL

同源重组反应参数：50℃孵育30min。

将重组好的质粒转化进0.1M CaCl₂制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用DNA聚合酶2×TaqMix对菌落进行鉴定，步骤参考步骤1.2.2。构建得到表达载体pYES2-Gfegt2-pPGK-Gfegt1-KanMX4，简称为pYES2-Gfegt2-Gfegt1。

1.2.4酿酒酵母的转化与鉴定

本次选用的酿酒酵母是EC1118葡萄酒酿酒酵母，采用的方法是LiAc转化法。具体转化步骤如下：(1)利用YPD培养基培养EC1118酿酒酵母至OD₆₀₀＝0.4～0.6；(2)将菌液离心不用少量LiAc/TE重悬，随后加入质粒pYES2-Gfegt2-pPGK-Gfegt1-KanMX4混合；(3)30℃水浴孵育混合液约半小时；(4)加入2倍混合液体积的50％PEG4000，30℃水浴孵育混合液约半小时后，42℃水浴热激20min；(5)往混合液加入YPD培养基进行复苏，随后在含G418(100mg/mL)的YPD平板上进行涂板，30℃培养。(6)利用DNA聚合酶KOD Fx对酿酒酵母单菌落进行鉴定，酿酒酵母菌落鉴定反应体系和参数如下：

酿酒酵母菌落鉴定反应体系：

2×PCR Buffer for KOD FX	12.5μL
		2mM dNTPs	5μL
pYES2-T7/pYES2-R	2μL
		KOD FX	0.5μL
含有1个菌落的dd H<sub>2</sub>O混合液	5μL
		合计	25μL

酿酒酵母菌落鉴定PCR反应参数：94℃预变性2min，94℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸6min，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min。

1.2.5合成酶功能的鉴定

1.2.5.1改造菌株的诱导发酵

本实验所构建的质粒有两个类型的启动子，Gal启动子对应YPG培养基诱导表达，pPGK启动子对应YPD培养基诱导表达，所以本次发酵培养采取以下培养策略：(1)挑取酿酒酵母EC1118改造菌株至50mL YPD培养基中，摇床培养(30℃，200rpm)，诱导Gfegt1的表达，并富集菌体；(2)培养2天后，离心分离菌体和YPD培养基，加入50mL YPG培养基，摇床培养(30℃，200rpm)，诱导Gfegt2的表达，同时加入底物反应，体系如下所示：

0.5M组氨酸	2mL
		1M半胱氨酸盐酸盐	1mL
0.2M S-腺苷蛋氨酸	1mL
		0.1M磷酸吡哆醛	1mL
0.1M FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	1mL

1.2.5.2麦角硫因产物检测

对7天发酵后的培养液进行离心，取上清液用0.22μm的有机相滤头进行除杂过滤，随后进行HPLC分析。

HPLC条件参考Liu(2016)的方法：

HILIC AmphionⅡ色谱柱(5μm，4.6×250mm)；检测波长为254nm，流速为1mL/min，柱温40℃，进样量20μL，流动相为乙腈：20mM乙酸铵(85：15，pH 6.5)。麦角硫因标准品溶于dd H₂O中。麦角硫因标准品浓度分别为24mg/L、48mg/L、96mg/L、144mg/L、192mg/L、240mg/L。用相同条件制作工作标准曲线并对样品进行测定。

1.3结果与分析

1.3.1灰树花RNA的提取与反转录

本实验采用STE法提取灰树花RNA，结果如图1所示，泳道的28S rRNA是18S rRNA亮度的两倍，用于后续的反转录。反转录的情况只能通过PCR扩增目的基因而显示是否成功。

1.3.2目的基因的扩增

由图2的1号泳道可看到，在2000～3000bp之间出现了相应的条带，且亮度较好，可初步判断为Gfegt1，随后经测序公司测序为一个2580bp完整的阅读框。由图2的2号泳道可看到，在1200～2000bp之间出现了相应的条带，且亮度较好，可初步判断为Gfegt1，随后经测序公司测序为一个1434bp完整的阅读框。

1.3.3工程菌株的构建

利用同组法构建表达载体，构建结果如图3所示，pGAL1为半乳糖启动子，pPGK为磷酸甘油启动子。经测序公司测序后无任何突变。随后热激法转化此质粒至酿酒酵母EC1118中。

1.3.4HPLC检测产物的生成。

麦角硫因标准曲线为：

麦角硫因含量(mg/L)＝0.00003*峰面积-1.1101(R²＝0.9951)；

麦角硫因标品的出峰时间为34.590min(图4)，野生型的发酵培养液在这时间附近并无明显的峰型出现(图5)，而改造菌株则在34.818min处有一个明显的峰(图6)，与标品的出峰时间吻合，说明改造菌株里表达的两个具有酶活性，能使底物转化为麦角硫因。根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出该发酵液中麦角硫因的最终浓度为11.4mg/L。

实施例2

2.1材料与方法(参考1.1材料与方法)

2.2麦角硫因的生物合成基因的功能研究

2.2.1麦角硫因合成酶基因的获取，参照实施例1的1.2.1麦角硫因合成酶基因的获取。

2.2.2克隆载体与目的基因的连接，参照实施例1的1.2.2克隆载体与目的基因的连接。

2.2.3表达质粒的构建与转化

2.2.3.1基因片段的添加同源臂

本次构建载体的方法为同源重组法，利用同源重组酶将多片段质粒连接至表达载体pRS42k中，添加同源臂采用的是DNA聚合酶PrimeStar Max利用引物(1)Sal1-TEF1p-F&TEF1p-Gfegt1-R/(2)Gfegt1-F&Gfegt1-CYC1t-R/(3)CYC1t-F&CYC1t-TEF1p-R/(4)TEF1p-F&TEF1p-Gfegt2-R/(5)Gfegt2-F&Gfegt2-CYC1t-R/(6)CYC1t-F&CYC1t-EcoRI-R分别扩增带有Sal1酶切位点和同源臂的TEF1p启动子，带有同源臂的目的基因Gfegt1，带有同源臂的CYC1t终止子，带有同源臂的TEF1p启动子，带有同源臂目的基因Gfegt2，带有EcoRI酶切位点的CYC1t终止子反应体系和反应参数如下：

带同源臂PCR反应体系：

带同源臂PCR反应参数：94℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃退火15sec，所有片段72℃延伸延伸20sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃终延伸5min。

2.2.3.2载体的双酶切

过夜摇菌，用质粒提取的试剂盒HiPure Plasmid Mini Kit提取pRS42k质粒。随后用采用FastDigest EcoR I和FastDiest Sal I对质粒进行双酶切，反应体系和参数如下：

双酶切反应体系：

10×FastDigest Buffer	2μL
		EcoR I	1μL
Sal I	1μL
		模板	1μg
dd H<sub>2</sub>O	补至20μL
		合计	20μL

双酶切反应参数：37℃孵育40min，80℃失活5min，4℃冰浴5min。

2.2.3.3表达质粒的构建

同源重组反应体系：

2×ClonExpress Mix	5μL
		双酶切pRS42k	114ng
Sal1-TEF1p-Gfegt1	6ng
		Gfegt1-CYC1t	42ng
CYC1t-TEF1p	6ng
		TEF1p-Gfegt2	6ng
Gfegt2-CYC1t	78ng
		CYC1t-EcoRI	6ng
dd H<sub>2</sub>O	补至10μL
		合计	10μL

同源重组反应参数：50℃孵育30min。

将重组好的质粒转化进0.1M CaCl₂制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用DNA聚合酶2×TaqMix对菌落进行鉴定，步骤参考步骤1.2.2。构建得到表达载体pRS42k-TEF1p-Gfegt1-CYC1t-TEF1p-Gfegt2-CYC1t，简称为pRS42k-Gfegt1-Gfegt2。

2.2.4酿酒酵母的转化与鉴定

本次选用的酿酒酵母是EC1118葡萄酒酿酒酵母，采用的方法是LiAc转化法。具体转化步骤如下：(1)利用YPD培养基培养EC1118酿酒酵母至OD₆₀₀＝0.4～0.6；(2)将菌液离心不用少量LiAc/TE重悬，随后加入质粒pRS42k-TEF1p-Gfegt1-CYC1t-TEF1p-Gfegt2-CYC1t混合；(3)30℃水浴孵育混合液约半小时；(4)加入2倍混合液体积的50％PEG4000，30℃水浴孵育混合液约半小时后，42℃水浴热激20min；(5)往混合液加入YPD培养基进行复苏，随后在含G418(100mg/mL)的YPD平板上进行涂板，30℃培养。(6)利用DNA聚合酶KOD Fx对酿酒酵母单菌落进行鉴定，酿酒酵母菌落鉴定反应体系和参数如下：

酿酒酵母菌落鉴定反应体系：

2×PCR Buffer for KOD FX	12.5μL
		2mM dNTPs	5μL
RV-M/M13-47	2μL
		KOD FX	0.5μL
含有1个菌落的dd H<sub>2</sub>O混合液	5μL
		合计	25μL

2.2.5合成酶功能的鉴定

2.2.5.1改造菌株的诱导发酵

本实验所构建的质粒有一个类型的启动子，TEF1p启动子对应YPD培养基诱导表达，不用考虑终止子的类型。(1)挑取酿酒酵母EC1118改造菌株至50mL YPD培养基中，摇床培养(30℃，200rpm)，以富集菌体；(2)培养2天后，加入底物反应，体系如下所示：

2.2.5.2麦角硫因产物检测

对7天发酵后的培养液进行离心，收集所有菌体，加入10mL 50％乙醇，50℃热水浴提取麦角硫因，持续2h，离心后取上清液用0.22μm的有机相滤头进行除杂过滤，随后进行HPLC分析。

HPLC条件参考Liu(2016)的方法：

2.3结果与分析

2.3.1灰树花RNA的提取与反转录

2.3.2目的基因的扩增

2.3.3工程菌株的构建

利用同组法构建表达载体，构建结果如图7所示，TEF1p为翻译延伸因子启动子，CYC1t为细胞色素C终止子。经测序公司测序后无任何突变。随后热激法转化此质粒至酿酒酵母EC1118中。

2.3.4HPLC检测产物的生成。

麦角硫因标准曲线为：

麦角硫因含量(mg/L)＝0.00003*峰面积-1.1101(R²＝0.9951)

麦角硫因标品的出峰时间为30.056min(图8)，野生型的发酵培养液在这时间附近并无明显的峰型出现(图9)，而改造菌株则在30.007min处有一个明显的峰(图10)，与标品的出峰时间吻合，说明改造菌株里表达的两个具有酶活性，能使底物转化为麦角硫因。根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出该发酵液中麦角硫因的最终浓度为6.6mg/L。

参考文献：

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Hu,W.,H.Song,A.Sae Her,D.W.Bak,N.Naowarojna,S.J.Elliott,L.Qin,X.Chenand P.Liu.Bioinformatic and biochemical characterizations of C-S bondformation and cleavage enzymes in the fungus Neurospora crassa ergothioneinebiosynthetic pathway[J].Organic Letters,2014,16(20):5382-5385.

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Liu,Q.,W.Zhang,H.Wang,Y.Li,W.Liu,Q.Wang,D.Liu,N.Chen andW.Jiang.Validation of a HILIC Method for the Analysis of Ergothioneine inFermentation Broth[J].J Chromatogr Sci,2016,54(6):934-938.

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税丕容,郑晓冰,林俊芳,郭丽琼.简便高质量的食用菌总RNA提取方法[J].食用菌学报，2018(15):35-39.

林俊芳,林硕欣,杨雪琴,郭丽琼.金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用,专利申请号201811332635.6,2018

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2580

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt1核苷酸序列

<400> 1

atgtcgaccc tccaggattt cttccatatc gtggaccttc gtgccaacca gccaacactt 60

gcttccagcg tcatccatga acaagttgtt tccggtctct cgcaacctgc gggccagaaa 120

tggcttccca caatgctcct ctacgatgag aggggattga ggctgtacga tgccattacg 180

acagaggcgc ccgaatacta tttgtttccc gccgaggaag agatcctgaa gaaccggtct 240

tccgatattg tgcgggtcat gcatgcgcgg aacgggaatg cagagtcagt tgaagaggtc 300

gtcgttgagc ttggtgctgg tgctttaagg aagacatccc acatcctccg cgctctctca 360

cagcacagta tgtcttccgt ccagtactac gccctcgacc ttgagaagcg cgaactcgaa 420

cgcactctca agacactaca tgactctgaa attggagcag agatcaagga taaggtctct 480

actaagggct tgtgcggaac atatgacgac ggcctcaagt tcatcgccga gggtggcctg 540

gaaggacgca acgatcttga acggatcact actgaagtct ccgagcaata taagctcgag 600

agggttggcg gtgacgattc gcctagatct gcgtcttcct cgaggacacc tacgacggag 660

acagatgtca cacctccatc gacccctggt tttaaccagc cgcttcatat tctcttcctc 720

ggttcatcgc tcggcaactt cactcgtggt gaggatgctg cattcttacg atccttgccg 780

ttgcgacctg gttcaggcga tacattgctc ctgggcctcg accacgacaa tgaagcccat 840

cagattgagc tcgcatataa tgaccccaaa ggtatcacca agaatttcat tatgaacggc 900

ttgaaatgtg caggaagagc tcttggggac gagcacctct ttgatgaaga taaatgggag 960

tatgtcgcga tgtacaacga agaactccgt cgtcatgagg cttactacaa gtcaacgtgt 1020

gagcaaacgg ttgtggacac aaagactaag aagtgtctcc cgttcgaagc agacgagctc 1080

gtccgcatcg aggtttccta caagttctct gagcgagacg cgtacactct ttttactgac 1140

gccaatctcc gccccattca acgctggatg gacagcgctg ggcagtattc tctctggctg 1200

ctagagcgac ctaagttcac gttccctcta ctgcgctcgc cttccgccat tgatgagaag 1260

ggtgtggttt cttctccttt cggcatgcca gcaatggacg agtggcacac aatgtgggcg 1320

gcttgggact ttatcactag acagatgata cccccttcga tgctcttcca gaagccgatc 1380

gatctacgtc atatatgcct gttctattgc gggcatattc ctgcgttcct gtccattcat 1440

atttcgaagc ttcttgagga gccggacacc gaacctgtgg agttcaaata tatttttgaa 1500

cgagggatcg atccaattgt ggatgacccc accaagtgcc accctcactc tgaggttccg 1560

cagcatgacg aggattggcc ttcgctcggg agcattcttg aataccaatc tagggtgcgc 1620

gagcgagtga tgaaattata ccgcgatatc cagtctggga aagttacgct cacgaggaag 1680

atagccagag tcttgtttat gacactcgaa cacgaagctt tccatgctga gacactcttg 1740

tatatgttgt tgcagcgcgc gggcacgggc acattgcctc ctacgggctt cagtccgcca 1800

gtctggtctg tcctcgccga gtcttgggaa cgcctccctg ctccgcatac tcccaccgtg 1860

acgctcggtc cggagacact gacggtcgga catgatgaca gcgaagcgga tgacaatacc 1920

accgacgtgg ctggacatga gtttggctgg gacaacgagc accccaaaag gaccgtgcat 1980

gttccggaat tcaagatcga gtggcgccct gttacgaacg gagagttcta cgagttctac 2040

attggagaag gcaaggaaca agtgcagttg cctgccagct gggtggagat cgacggggag 2100

atgctggtgc gcaccttcta cggaccagtc ccgatgaaag tggcaaaaga ctggccggtc 2160

atcacgtcct acgataatct ctctacctac gccagcgtca agggcggccg catccccacc 2220

gagcctgaac tccgcttgtt cctcgacaag ttcgagtgcg gatacgaagg cggggcaaat 2280

attggcttcc gcaactggca ccctattccg gcgactatgg gcggggtgaa agatggccgg 2340

ggacacaacg gaggtgtctg ggagtggacg tcgacggtgt tcgagaaaca tgacggtttt 2400

gtgccgtcca agctgtatcc gggatattcg atggatttct tcgataccca ccatcaaatt 2460

gtgatcggag gctcctacgc cactattccc cgtctcgcgg agcggcgtac cttgcgtaac 2520

tactaccaac acaactaccc ctacgcgtgg gtcggcgctc ggattgcgta tgatgtgtaa 2580

<210> 2

<211> 859

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt1氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Thr Leu Gln Asp Phe Phe His Ile Val Asp Leu Arg Ala Asn

1 5 10 15

Gln Pro Thr Leu Ala Ser Ser Val Ile His Glu Gln Val Val Ser Gly

20 25 30

Leu Ser Gln Pro Ala Gly Gln Lys Trp Leu Pro Thr Met Leu Leu Tyr

35 40 45

Asp Glu Arg Gly Leu Arg Leu Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Glu Ala Pro

50 55 60

Glu Tyr Tyr Leu Phe Pro Ala Glu Glu Glu Ile Leu Lys Asn Arg Ser

65 70 75 80

Ser Asp Ile Val Arg Val Met His Ala Arg Asn Gly Asn Ala Glu Ser

85 90 95

Val Glu Glu Val Val Val Glu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Lys Thr

100 105 110

Ser His Ile Leu Arg Ala Leu Ser Gln His Ser Met Ser Ser Val Gln

115 120 125

Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Glu Lys Arg Glu Leu Glu Arg Thr Leu Lys

130 135 140

Thr Leu His Asp Ser Glu Ile Gly Ala Glu Ile Lys Asp Lys Val Ser

145 150 155 160

Thr Lys Gly Leu Cys Gly Thr Tyr Asp Asp Gly Leu Lys Phe Ile Ala

165 170 175

Glu Gly Gly Leu Glu Gly Arg Asn Asp Leu Glu Arg Ile Thr Thr Glu

180 185 190

Val Ser Glu Gln Tyr Lys Leu Glu Arg Val Gly Gly Asp Asp Ser Pro

195 200 205

Arg Ser Ala Ser Ser Ser Arg Thr Pro Thr Thr Glu Thr Asp Val Thr

210 215 220

Pro Pro Ser Thr Pro Gly Phe Asn Gln Pro Leu His Ile Leu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Ser Ser Leu Gly Asn Phe Thr Arg Gly Glu Asp Ala Ala Phe Leu

245 250 255

Arg Ser Leu Pro Leu Arg Pro Gly Ser Gly Asp Thr Leu Leu Leu Gly

260 265 270

Leu Asp His Asp Asn Glu Ala His Gln Ile Glu Leu Ala Tyr Asn Asp

275 280 285

Pro Lys Gly Ile Thr Lys Asn Phe Ile Met Asn Gly Leu Lys Cys Ala

290 295 300

Gly Arg Ala Leu Gly Asp Glu His Leu Phe Asp Glu Asp Lys Trp Glu

305 310 315 320

Tyr Val Ala Met Tyr Asn Glu Glu Leu Arg Arg His Glu Ala Tyr Tyr

325 330 335

Lys Ser Thr Cys Glu Gln Thr Val Val Asp Thr Lys Thr Lys Lys Cys

340 345 350

Leu Pro Phe Glu Ala Asp Glu Leu Val Arg Ile Glu Val Ser Tyr Lys

355 360 365

Phe Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Thr Leu Phe Thr Asp Ala Asn Leu Arg

370 375 380

Pro Ile Gln Arg Trp Met Asp Ser Ala Gly Gln Tyr Ser Leu Trp Leu

385 390 395 400

Leu Glu Arg Pro Lys Phe Thr Phe Pro Leu Leu Arg Ser Pro Ser Ala

405 410 415

Ile Asp Glu Lys Gly Val Val Ser Ser Pro Phe Gly Met Pro Ala Met

420 425 430

Asp Glu Trp His Thr Met Trp Ala Ala Trp Asp Phe Ile Thr Arg Gln

435 440 445

Met Ile Pro Pro Ser Met Leu Phe Gln Lys Pro Ile Asp Leu Arg His

450 455 460

Ile Cys Leu Phe Tyr Cys Gly His Ile Pro Ala Phe Leu Ser Ile His

465 470 475 480

Ile Ser Lys Leu Leu Glu Glu Pro Asp Thr Glu Pro Val Glu Phe Lys

485 490 495

Tyr Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Ile Val Asp Asp Pro Thr Lys

500 505 510

Cys His Pro His Ser Glu Val Pro Gln His Asp Glu Asp Trp Pro Ser

515 520 525

Leu Gly Ser Ile Leu Glu Tyr Gln Ser Arg Val Arg Glu Arg Val Met

530 535 540

Lys Leu Tyr Arg Asp Ile Gln Ser Gly Lys Val Thr Leu Thr Arg Lys

545 550 555 560

Ile Ala Arg Val Leu Phe Met Thr Leu Glu His Glu Ala Phe His Ala

565 570 575

Glu Thr Leu Leu Tyr Met Leu Leu Gln Arg Ala Gly Thr Gly Thr Leu

580 585 590

Pro Pro Thr Gly Phe Ser Pro Pro Val Trp Ser Val Leu Ala Glu Ser

595 600 605

Trp Glu Arg Leu Pro Ala Pro His Thr Pro Thr Val Thr Leu Gly Pro

610 615 620

Glu Thr Leu Thr Val Gly His Asp Asp Ser Glu Ala Asp Asp Asn Thr

625 630 635 640

Thr Asp Val Ala Gly His Glu Phe Gly Trp Asp Asn Glu His Pro Lys

645 650 655

Arg Thr Val His Val Pro Glu Phe Lys Ile Glu Trp Arg Pro Val Thr

660 665 670

Asn Gly Glu Phe Tyr Glu Phe Tyr Ile Gly Glu Gly Lys Glu Gln Val

675 680 685

Gln Leu Pro Ala Ser Trp Val Glu Ile Asp Gly Glu Met Leu Val Arg

690 695 700

Thr Phe Tyr Gly Pro Val Pro Met Lys Val Ala Lys Asp Trp Pro Val

705 710 715 720

Ile Thr Ser Tyr Asp Asn Leu Ser Thr Tyr Ala Ser Val Lys Gly Gly

725 730 735

Arg Ile Pro Thr Glu Pro Glu Leu Arg Leu Phe Leu Asp Lys Phe Glu

740 745 750

Cys Gly Tyr Glu Gly Gly Ala Asn Ile Gly Phe Arg Asn Trp His Pro

755 760 765

Ile Pro Ala Thr Met Gly Gly Val Lys Asp Gly Arg Gly His Asn Gly

770 775 780

Gly Val Trp Glu Trp Thr Ser Thr Val Phe Glu Lys His Asp Gly Phe

785 790 795 800

Val Pro Ser Lys Leu Tyr Pro Gly Tyr Ser Met Asp Phe Phe Asp Thr

805 810 815

His His Gln Ile Val Ile Gly Gly Ser Tyr Ala Thr Ile Pro Arg Leu

820 825 830

Ala Glu Arg Arg Thr Leu Arg Asn Tyr Tyr Gln His Asn Tyr Pro Tyr

835 840 845

Ala Trp Val Gly Ala Arg Ile Ala Tyr Asp Val

850 855

<210> 3

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt2核苷酸序列

<400> 3

atgacggcca tagatctagg tgcagcgtct gccgacgaga cccagaagaa cacttatgat 60

gcaacccaaa agccgcctcc tttcggtcat gccttgaagc cttactgggc atttgatcca 120

aaatatgtaa atctaaacca cggctcctat ggatcattgc ctctgcctgt tctattttct 180

tgcacccaga atacgattct cgcagagcgg aatcccgaca aattccaccg cgtcacgtat 240

atgcctatgc tccaggagtc caggaaacgc gtggcagaac tggttggtgc tgaacacgac 300

gagatcgtgc tcgtgcctaa tgccactcac ggcttgaaca ccgtgctcag aaattttgag 360

tggaagcaag gcgacgtcat tattggagca tcgacgacat atggtgccat ctctcgcacc 420

atccaatacc tcgcggatcg atcggaacag ccaagacccg aagcatatag cattcagtat 480

acgttcccca tgtcgcacgc agagatcctc gatgccttcc gtgcacgcgt gcgggagatc 540

aagcagctcc atgcgagcac cgaattcagc gacgcgccgt tggagtcgct gggctacgag 600

gaaggcagga agaagaacaa gttcgtcgca gttatagact cggtgactgc caaccctggg 660

gtcctcatgc cctggaaaga gatggtccgc gtctgcaggg aagaaggcat ctggtctgtt 720

gtagatgctg ctcatagcat cgggcaggaa acggatatca atctcagcga agcgaggcct 780

gatttctgga tatccaactg tcataagtgg ctttacgcaa aacggggctg tgccacctta 840

tatgtgccca aacgtaacca gtatatcatc aagtcttcta ttccgacttc acacgcgtat 900

gtctcgccta ccgacacaga acaggccctg caattccggg atgggtatga cacgaatttc 960

atcctgcagc atgaatggac agggacgatg gacttcattc catacttgag cgtctctgca 1020

gcgctcgact tccgcaactg gctgggaggg gaggccgcca tcaacgggta ctgccacaag 1080

ctcgccatgg ccggcggcga gaggctcgcc agcgtgatgg gcacgaaggt catggacaag 1140

accggcgagc tcacgctcaa catgacgaac gtcctactgc cgctccccgt ggagactacg 1200

aagggcgagg tgtattctgg ggaggtcctg tccgcgattt acagccaact cagggagaag 1260

ctgctgtacg agtggaacac ctacgcggca cactacttcc acgcgggcgg ctggtggtgc 1320

cggtgcagcg cacaggtctg gaacgaggaa tcggactttg agtatctggg aaaggcattc 1380

aatgcaatct gcaaggaaat caaggatacc cttctcgcag agaagcgtaa ttag 1434

<210> 4

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt2氨基酸序列

<400> 4

Met Thr Ala Ile Asp Leu Gly Ala Ala Ser Ala Asp Glu Thr Gln Lys

1 5 10 15

Asn Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Lys Pro Pro Pro Phe Gly His Ala Leu

20 25 30

Lys Pro Tyr Trp Ala Phe Asp Pro Lys Tyr Val Asn Leu Asn His Gly

35 40 45

Ser Tyr Gly Ser Leu Pro Leu Pro Val Leu Phe Ser Cys Thr Gln Asn

50 55 60

Thr Ile Leu Ala Glu Arg Asn Pro Asp Lys Phe His Arg Val Thr Tyr

65 70 75 80

Met Pro Met Leu Gln Glu Ser Arg Lys Arg Val Ala Glu Leu Val Gly

85 90 95

Ala Glu His Asp Glu Ile Val Leu Val Pro Asn Ala Thr His Gly Leu

100 105 110

Asn Thr Val Leu Arg Asn Phe Glu Trp Lys Gln Gly Asp Val Ile Ile

115 120 125

Gly Ala Ser Thr Thr Tyr Gly Ala Ile Ser Arg Thr Ile Gln Tyr Leu

130 135 140

Ala Asp Arg Ser Glu Gln Pro Arg Pro Glu Ala Tyr Ser Ile Gln Tyr

145 150 155 160

Thr Phe Pro Met Ser His Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe Arg Ala Arg

165 170 175

Val Arg Glu Ile Lys Gln Leu His Ala Ser Thr Glu Phe Ser Asp Ala

180 185 190

Pro Leu Glu Ser Leu Gly Tyr Glu Glu Gly Arg Lys Lys Asn Lys Phe

195 200 205

Val Ala Val Ile Asp Ser Val Thr Ala Asn Pro Gly Val Leu Met Pro

210 215 220

Trp Lys Glu Met Val Arg Val Cys Arg Glu Glu Gly Ile Trp Ser Val

225 230 235 240

Val Asp Ala Ala His Ser Ile Gly Gln Glu Thr Asp Ile Asn Leu Ser

245 250 255

Glu Ala Arg Pro Asp Phe Trp Ile Ser Asn Cys His Lys Trp Leu Tyr

260 265 270

Ala Lys Arg Gly Cys Ala Thr Leu Tyr Val Pro Lys Arg Asn Gln Tyr

275 280 285

Ile Ile Lys Ser Ser Ile Pro Thr Ser His Ala Tyr Val Ser Pro Thr

290 295 300

Asp Thr Glu Gln Ala Leu Gln Phe Arg Asp Gly Tyr Asp Thr Asn Phe

305 310 315 320

Ile Leu Gln His Glu Trp Thr Gly Thr Met Asp Phe Ile Pro Tyr Leu

325 330 335

Ser Val Ser Ala Ala Leu Asp Phe Arg Asn Trp Leu Gly Gly Glu Ala

340 345 350

Ala Ile Asn Gly Tyr Cys His Lys Leu Ala Met Ala Gly Gly Glu Arg

355 360 365

Leu Ala Ser Val Met Gly Thr Lys Val Met Asp Lys Thr Gly Glu Leu

370 375 380

Thr Leu Asn Met Thr Asn Val Leu Leu Pro Leu Pro Val Glu Thr Thr

385 390 395 400

Lys Gly Glu Val Tyr Ser Gly Glu Val Leu Ser Ala Ile Tyr Ser Gln

405 410 415

Leu Arg Glu Lys Leu Leu Tyr Glu Trp Asn Thr Tyr Ala Ala His Tyr

420 425 430

Phe His Ala Gly Gly Trp Trp Cys Arg Cys Ser Ala Gln Val Trp Asn

435 440 445

Glu Glu Ser Asp Phe Glu Tyr Leu Gly Lys Ala Phe Asn Ala Ile Cys

450 455 460

Lys Glu Ile Lys Asp Thr Leu Leu Ala Glu Lys Arg Asn

465 470 475

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt1-F

<400> 5

atgtcgaccc tccaggattt cttc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt1-R

<400> 6

ttacacatca tacgcaatcc gagcg 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt2-F

<400> 7

atgacggcca tagatctagg tgc 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt2-R

<400> 8

ctaattacgc ttctctgcga gaagg 25

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-Gfegt2-F

<400> 9

gactcactat agggaatatt aatgacggcc atagatctag g 41

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-Gfegt2-R

<400> 10

aaagcaatta cagtcccggg ctagtggtgg tggtggtggt gattacgctt ctctgcgag 59

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-Gfegt1-F

<400> 11

tacaacaaat ataaaacatt aattaaatgt cgaccctcca ggatttc 47

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-Gfegt1-R

<400> 12

acgaggcaag ctaaacagat ctttagtggt ggtggtggtg gtgcacatca tacgcaatc 59

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-KanMX4-F

<400> 13

tttagcttgc ctcgtccccg ccgggtcacc cggccagcga catggaggcc ca 52

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-KanMX4-R

<400> 14

gatggatatc tgcagaatta gtatagcgac cagcattcac 40

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sc-pPGK-F

<400> 15

actgtaattg cttttagttg tg 22

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sc-pPGK-R

<400> 16

tgttttatat ttgttgtaaa aagtagata 29

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RV-M

<400> 17

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> M13-47

<400> 18

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt2-CYC1t-R

<400> 19

acataactaa ttacatgact agtggtggtg gtggtggtga ttacgcttct ctgcgag 57

<210> 20

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gfegt1-CYC1t-R

<400> 20

gacataacta attacatgat tagtggtggt ggtggtggtg cacatcatac gcaat 55

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TEF1p-Gfegt2-R

<400> 21

acctagatct atggccgtca tggttgttta tgttcgg 37

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TEF1p-Gfegt1-R

<400> 22

gaaatcctgg agggtcgaca tggttgttta tgttcg 36

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sal1-TEF1p-F

<400> 23

ccccctcgag gtcgaccagc gacatggagg ccca 34

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYC1t-EcoRI-R

<400> 24

cccgggctgc aggaattcgc aaattaaagc cttc 34

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYC1t-TEF1p-R

<400> 25

tgggcctcca tgtcgctggc aaattaaagc cttc 34

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TEF1p-F

<400> 26

cagcgacatg gaggcccag 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYC1t-F

<400> 27

tcatgtaatt agttatgtc 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-T7

<400> 28

taatacgact cactataggg 20

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pYES2-R

<400> 29

tcggttagag cggatgtg 18

Claims

1.一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在联合合成麦角硫因中的应用，其特征在于：

所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt1编码的氨基酸如SEQ ID NO:2所示；

所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt2编码的氨基酸如SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在体外联合生物合成麦角硫因中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在酿酒酵母体内合成麦角硫因中的应用。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：

所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的灰树花麦角硫因基因Gfegt2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1编码的蛋白质Gfegt1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.编码权利要求5所述的蛋白质的灰树花麦角硫因基因Gfegt1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.一种灰树花麦角硫因基因Gfegt2编码的蛋白质Gfegt2，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

8.编码权利要求7所述的蛋白质的灰树花麦角硫因基因Gfegt2，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

9.一种重组表达载体，其特征在于：以pYES2为出发载体，依次***权利要求1所述的Gfegt2、pPGK、权利要求1所述的Gfegt1、KanMX4获得；或者，以pRS42k为出发载体，依次***TEF1p、权利要求1所述的Gfegt1、CYC1t、TEF1p、权利要求1所述的Gfegt2、CYC1t获得。

10.一种重组菌，其特征在于：含有权利要求9所述的重组表达载体。