CN107287256A - 全细胞催化合成l-2-哌啶甲酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及全细胞催化合成L‑2‑哌啶甲酸的方法。本发明所公开的全细胞生物催化合成L‑2‑哌啶甲酸的方法是以L‑赖氨酸盐酸盐为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及含有Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白编码基因的重组宿主菌、或者含有Pseudomonas veronii CIP104663蛋白编码基因的重组宿主菌或者含有Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白编码基因的重组宿主菌，通过生物催化制备L‑2‑哌啶甲酸。从而克服了目前化学合成法成本高、条件苛刻、转化率低、能耗高、污染大的问题。同时本发明所公开的生物催化***酶活效率高，反应时间短，目标产物ee值高。

Description

全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法。

背景技术

L-2-哌啶甲酸是一种天然存在的非蛋白质构型氨基酸，是重要的手性药物中间体，可用于制备雷帕霉素，抗肿瘤剂VX-710，免疫抑制剂FK506，哌啶生物碱等，具有很高的产业化应用价值。目前的主要生产方法为化学合成，存在产率低，能耗高，污染大等缺点。同时ee值难以控制。

Fujii等利用重组表达L-赖氨酸-6-氨基转移酶和二氢吡咯-5-羧酸酯还原酶的大肠杆菌工程菌，在159小时积累到了3.9g/L产物。后续通过添加lysP赖氨酸透性酶和yeiE，在111小时最高积累到16g/L。该方案主要问题为反应时间过长，产物生成量过少，实际生产成本过高，难以放大生产。

Yasushi Tani等人通过共表达LysR，rAIP，DpkA，GDH等共四个蛋白，实现了从DL-lysine到L-2-哌啶甲酸的转化，46小时产物转化率达到87.4％，但涉及到多个蛋白的共表达，存在菌种构建难度大，重复性差等缺点。

Ying等利用含有pipA基因的大肠杆菌做为全细胞催化剂，并优化NAD浓度，反应温度，反应pH，金属离子以及表达活性剂添加等，最终产物可达到17.25g/L。该方案中pipA酶活不高，导致了使用全细胞量过多(OD＝200)，底物浓度不高(赖氨酸25g/L)，并且需要分批次添加底物才能反应完全。这些因素会导致在放大生产时成本过高等问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是开发一种高效率的生物催化***，以期提高底物投量，缩短反应时间，并能获得高ee值的产物。

为了实现上述的发明目的，本发明的采用的技术方案如下：

全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，以L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及重组宿主菌，通过生物催化制备L-2-哌啶甲酸；其中重组宿主菌为含有Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白编码基因的重组宿主菌、含有Pseudomonasveronii CIP104663蛋白编码基因的重组宿主菌或者含有Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白编码基因的重组宿主菌中的任意一种。其中，所述重组宿主菌为大肠杆菌。

进一步地，反应在pH8.0的磷酸钾缓冲溶液中进行。

优选地，反应温度为20℃-30℃。

同时，我们还优选公开反应在摇床上进行，摇床转速为180rpm。

最后，我们公开了其中重组宿主菌的浓度为50g/L-150g/L。

采用本发明所公开的全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，克服了目前化学合成法成本高、条件苛刻、转化率低、能耗高、污染大的问题。同时本发明所公开的生物催化***酶活效率高，反应时间短，目标产物ee值高。

附图说明

图1为NYPDc的表达质粒图谱

图2为NYPDa，NYPDb，NYPDc，NYPDd，NYPDe的蛋白表达上清、包涵体SDS-PAGE图谱

图3为实施例8中生物转化反应的TLC图谱

图4为实施例8中L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图

图5为实施例8中L-2-哌啶甲酸的MS谱图

图6为SEQ ID NO.10的表达质粒图谱

图7为含有SEQ ID NO.10表达质粒的大肠杆菌的SDS-PAGE图谱。

图8为实施例15中生物转化反应的TLC图谱

图9为实施例15中L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图

图10为实施例15中L-2-哌啶甲酸的MS谱图

图11为SEQ ID NO.13的表达质粒图谱

图12为含有SEQ ID NO.13表达质粒的大肠杆菌的SDS-PAGE图谱。

图13为实施例19中生物转化反应的TLC图谱

图14为实施例19中L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图

图15为实施例19中L-2-哌啶甲酸的MS谱图

具体实施方式

为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。

以下实施例中涉及到的TLC检测中：

展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混匀后放置10min左右。

硅胶板规格：薄层层析硅胶板5*10。

显色剂：茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混匀。

以下实例中涉及到的LC-MS检测条件为：

Prevail C18色谱柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱温：30℃；流动相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)；检测器温度：120℃；载气：氮气(纯度99.9％)；载气流速：4L/min；进样体积：10μL。

实施例1

将Arenimonas donghaensis DSM 18148置于LB培养基中，置于30℃,180rpm培养3-5天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAamp Kit(Qiagen，Germany)提取纯化Arenimonas donghaensis DSM 18148 DNA。

用Pfu高保真酶对Arenimonas donghaensis DSM 18148基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为

NYPD-F 5' ATGACCATGACCCAGCTCACCA 3'

NYPD-R 5' TCAGGCCGCCTGCTTGC 3'

由于Arenimonas donghaensis DSM 18148 DNA片段GC含量接近70％，故在扩增时添加终浓度0.5M的甜菜碱。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA 3'端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海生工生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQ ID NO.1，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2

由于原DNA序列GC含量过高，在宿主菌中培养时难以实现高效转录。故通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.3，命名为NYPDa。

参考图1的方式构建含有NYPDa的表达质粒。

实施例3

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.4，命名为NYPDb。

参考图1的方式构建含有NYPDb的表达质粒。

实施例4

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.5，命名为NYPDc。

按照图1的方式构建含有NYPDc的表达质粒。

实施例5

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.6，命名为NYPDd。

参考图1的方式构建含有NYPDd的表达质粒。

实施例6

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.7，命名为NYPDe。

参考图1的方式构建含有NYPDe的表达质粒。

实施例7

挑取含有NYPDa表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。

按照上述方法，分别制备NYPDb，NYPDc，NYPDd，NYPDe的菌体并进行SDS-PAGE蛋白胶检测，结果见图2。SDS-PAGE蛋白胶显示，其中NYPDc的表达量最高，故做为优选序列进行后续实验。

实施例8

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，150g/L NYPDc菌体，25g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应16小时时，检测结果如图3，结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，检测结果如图4，图5所示。

实施例9

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L NYPDc菌体，74g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mM NAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，测得最终产物浓度达到37g/L。

实施例10

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L NYPDc菌体，100g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，测得最终产物浓度达到66.7g/L。

实施例11

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L NYPDc菌体，150g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mMNAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行LC-MS检测，测得最终产物浓度达到76.9g/L。

实施例12

将Pseudomonas veronii CIP104663置于LB培养基中培养，控制温度为28.0℃，180rpm培养3天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAamp Kit(Qiagen，Germany)提取纯化Pseudomonas veronii基因组DNA。

用Pfu高保真酶对Pseudomonas veronii基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为

Pve-F 5' ATGGTGGCACAGCGAGCAAC 3'

Pve-R 5' TCATGCTAATTTTAAGGTACGGTCG 3'

由于Pseudomonas veronii CIP104663的DNA的GC含量接近50％，故使用Pfu高保真酶直接扩增。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA 3'端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至南京金斯瑞生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQ ID NO.8，相应的氨基酸序列为SEQID NO.9。

实施例13

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用PrimerPremier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10 U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，65℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.10。

按照图6的方式构建含有SEQ ID NO.10的表达质粒。

实施例14

挑取含有SEQ ID NO.10表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。

结果见图7，其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。SDS-PAGE蛋白胶显示，含有SEQ ID NO.10表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。

实施例15

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，65g/L含有SEQ ID NO.10表达质粒的菌体，60g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mM NAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应16小时时，检测结果如图8，结果显示28小时生成大量产物，无底物残余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为48.7g/L。同时取样进行LC-MS检测，检测结果如图9，图10所示。

实施例16

将Streptomyces hirsutus ATCC 19091置于ATCC Medium 196培养基中培养，控制温度为26.0℃，180rpm培养2天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAamp Kit(Qiagen，Germany)提取纯化Streptomyces hirsutus ATCC 19091基因组DNA。

用Pfu高保真酶对Streptomyces hirsutus ATCC 19091基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为

Shi-F 5' ATCTTGCAAGCTGAGCGCACG 3'

Shi-R 5' TCATCGTCGCGCTCCGGC 3'

由于Streptomyces hirsutus ATCC 19091的DNA局部GC含量接近80％，故在扩增时添加终浓度0.5M的甜菜碱。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA 3'端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海杰李生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQ ID NO.11，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.12。

实施例17

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用PrimerPremier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，65℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.13。

按照图11的方式构建含有SEQ ID NO.13的表达质粒。

实施例18

挑取含有SEQ ID NO.13表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。

结果见图12，其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。SDS-PAGE蛋白胶显示，含有SEQ ID NO.13表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。

实施例19

加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，50g/L含有SEQ ID NO.13表达质粒的菌体，55g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mM NAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应16小时时，检测结果如图13，结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为32g/L。同时取样进行LC-MS检测，检测结果如图14，图15所示。

当我们在体系中加入L-赖氨酸的时候，其快速转变为L-赖氨酸盐酸盐，然后按照前述实施例的方式进行反应。

通过使用本发明的新酶蛋白质，以及优化后的基因序列，配合优化后的转化工艺，能够有效地制造做为医药中间体在工业上有用的化合物L-2-哌啶甲酸，工艺简单且得率高。转化所使用的底物为工业上大量生产的L－赖氨酸，且价格低廉，根据2016年1月份的国内赖氨酸市场行情，98％含量赖氨酸报价为8.5-8.6元/公斤左右，仅国内的产量可达120吨，保证了底物的充足供应。技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如氨基酸、维生素生产车间)即可进行投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。对比目前国内生产主要依赖于化学拆分法，有50％的原料被拆分浪费掉，同时生成大量无用的副产物，并且产物的ee值偏低。故本发明具有较强的实用性和推广价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京诺云生物科技有限公司

<120> 全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法

<130> 2016

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> Arenimonas donghaensis

<400> 1

atgaccatga cccagctcac cacccaggac ctgacccaga tcgtcgcgac ccacggcctg 60

ccgaccctgc tcggccgcct ggtggactac ctggaggccg acttccggcg ctgggaggac 120

ttcgacaaga gcccgcgttc ggcggcccac tccccgggcg gcgtgatcga actgatgccg 180

gtcgccgata ccaaggaata cagcttcaag tacgtcaacg gccacccggg caacaccaag 240

ctgggcctgt ccaccgtggt ggccttcggc gtgctcgccg acgtcgatac cggcatgccg 300

accctgatca gcgaactgac cctgaccacc gcgctgcgca ccgccgccac ctcggtgatg 360

gcggccaagc tgctggcgcg caaggattcc aggaccatgg cgctgatcgg caacggcgcc 420

cagagcgagt tccaggcgct ggccttccac cacctgctgg gcatccagga agtgcgtgtg 480

tacgacgtcg acccggccgc caccgacaag ctggtgcgca acctggccgc ggccgcgccg 540

gaactgcgcg tggtgcgcag caccggcgtc gcccaggccg tgcgcggcgc cgacatcgtc 600

accaccgtca ccgcggacaa ggccaatgcc gacatcctga cgccggaaat gatcgagccg 660

ggcatgcacc tcaacgccgt cggcggcgac tgcccgggca agaccgaact ggccacggag 720

gtggtcgcca acgcctcggt gttcgtcgag ttcgagccgc agtcgcgcat cgaaggcgag 780

gtgcagcaga tgcccgccaa ctccccggtc accgaactgt ggcgcgtgct gaccatgcag 840

gccgccggcc gccgcaacat cgccgaggtc accctgttcg actcggtcgg tttcgcgctg 900

gaggattatt cggcgctgcg cctggtgcgc gattgcgcca aggaaatggg cctgggccgc 960

gaagccagcc tcatccccgc cctggccgac ccgaagaacc tgttcggcga gctggccgcg 1020

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<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> Arenimonas donghaensis

<400> 2

Met Thr Met Thr Gln Leu Thr Thr Gln Asp Leu Thr Gln Ile Val Ala

1 5 10 15

Thr His Gly Leu Pro Thr Leu Leu Gly Arg Leu Val Asp Tyr Leu Glu

20 25 30

Ala Asp Phe Arg Arg Trp Glu Asp Phe Asp Lys Ser Pro Arg Ser Ala

35 40 45

Ala His Ser Pro Gly Gly Val Ile Glu Leu Met Pro Val Ala Asp Thr

50 55 60

Lys Glu Tyr Ser Phe Lys Tyr Val Asn Gly His Pro Gly Asn Thr Lys

65 70 75 80

Leu Gly Leu Ser Thr Val Val Ala Phe Gly Val Leu Ala Asp Val Asp

85 90 95

Thr Gly Met Pro Thr Leu Ile Ser Glu Leu Thr Leu Thr Thr Ala Leu

100 105 110

Arg Thr Ala Ala Thr Ser Val Met Ala Ala Lys Leu Leu Ala Arg Lys

115 120 125

Asp Ser Arg Thr Met Ala Leu Ile Gly Asn Gly Ala Gln Ser Glu Phe

130 135 140

Gln Ala Leu Ala Phe His His Leu Leu Gly Ile Gln Glu Val Arg Val

145 150 155 160

Tyr Asp Val Asp Pro Ala Ala Thr Asp Lys Leu Val Arg Asn Leu Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Pro Glu Leu Arg Val Val Arg Ser Thr Gly Val Ala Gln

180 185 190

Ala Val Arg Gly Ala Asp Ile Val Thr Thr Val Thr Ala Asp Lys Ala

195 200 205

Asn Ala Asp Ile Leu Thr Pro Glu Met Ile Glu Pro Gly Met His Leu

210 215 220

Asn Ala Val Gly Gly Asp Cys Pro Gly Lys Thr Glu Leu Ala Thr Glu

225 230 235 240

Val Val Ala Asn Ala Ser Val Phe Val Glu Phe Glu Pro Gln Ser Arg

245 250 255

Ile Glu Gly Glu Val Gln Gln Met Pro Ala Asn Ser Pro Val Thr Glu

260 265 270

Leu Trp Arg Val Leu Thr Met Gln Ala Ala Gly Arg Arg Asn Ile Ala

275 280 285

Glu Val Thr Leu Phe Asp Ser Val Gly Phe Ala Leu Glu Asp Tyr Ser

290 295 300

Ala Leu Arg Leu Val Arg Asp Cys Ala Lys Glu Met Gly Leu Gly Arg

305 310 315 320

Glu Ala Ser Leu Ile Pro Ala Leu Ala Asp Pro Lys Asn Leu Phe Gly

325 330 335

Glu Leu Ala Ala Ala Pro Gln Ala Ala Arg Lys Gln Ala Ala

340 345 350

<210> 3

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaccatga cccagctgac cacccaggac ctgacccaga tcgttgctac ccacggtctg 60

ccgaccctgc tgggtcgtct ggttgactac ctggaagctg acttccgtcg ttgggaagac 120

ttcgacaaat ctccgcgttc tgctgctcac tctccgggtg gtgttatcga actgatgccg 180

gttgctgaca ccaaagaata ctctttcaaa tacgttaacg gtcacccggg taacaccaaa 240

ctgggtctgt ctaccgttgt tgctttcggt gttctggctg acgttgacac cggtatgccg 300

accctgatct ctgaactgac cctgaccacc gctctgcgta ccgctgctac ctctgttatg 360

gctgctaaac tgctggctcg taaagactct cgtaccatgg ctctgatcgg taacggtgct 420

cagtctgaat tccaggctct ggctttccac cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtt 480

tacgacgttg acccggctgc taccgacaaa ctggttcgta acctggctgc tgctgctccg 540

gaactgcgtg ttgttcgttc taccggtgtt gctcaggctg ttcgtggtgc tgacatcgtt 600

accaccgtta ccgctgacaa agctaacgct gacatcctga ccccggaaat gatcgaaccg 660

ggtatgcacc tgaacgctgt tggtggtgac tgcccgggta aaaccgaact ggctaccgaa 720

gttgttgcta acgcttctgt tttcgttgaa ttcgaaccgc agtctcgtat cgaaggtgaa 780

gttcagcaga tgccggctaa ctctccggtt accgaactgt ggcgtgttct gaccatgcag 840

gctgctggtc gtcgtaacat cgctgaagtt accctgttcg actctgttgg tttcgctctg 900

gaagactact ctgctctgcg tctggttcgt gactgcgcta aagaaatggg tctgggtcgt 960

gaagcttctc tgatcccggc tctggctgac ccgaaaaacc tgttcggtga actggctgct 1020

gctccgcagg ctgctcgtaa acaggctgct taa 1053

<210> 4

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgactatga ctcaactgac tactcaagac ctcactcaga ttgttgctac ccatggtctc 60

ccaaccctgc tcggtcgtct ggttgactat ctcgaagcgg acttccgccg ttgggaagac 120

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gttgcggaca ccaaagaata ctctttcaaa tacgtgaacg gtcacccggg caataccaaa 240

ctcggtctct ctactgttgt tgcgttcggt gttctcgcgg atgttgacac tggtatgcca 300

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tacgacgtgg acccagcggc gactgataaa ctggttcgta acctggcggc tgctgcgcca 540

gaactgcgcg ttgttcgttc taccggtgtt gctcaagcgg tgcgtggcgc tgatatcgtt 600

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gctccacaag ctgctcgcaa acaggcggcg taa 1053

<210> 5

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaccatga cccagctgac cacccaggat ctgacccaga tcgttgcgac ccacggtctg 60

ccgaccctgc tgggccgtct ggttgactac ctggaagcgg acttccgtcg ttgggaagat 120

ttcgacaaat ctccgcgttc tgcggcgcac tctccgggtg gcgttatcga actgatgccg 180

gttgcggata ccaaagaata ctctttcaaa tatgttaacg gtcacccggg caacaccaaa 240

ctgggcctgt ctaccgttgt tgcgttcggc gttctggcgg atgttgacac cggtatgccg 300

accctgatct ctgaactgac cctgaccacc gcgctgcgta ccgcggcgac ctctgttatg 360

gcggcgaaac tgctggcgcg taaagactct cgtaccatgg cgctgatcgg caacggtgcg 420

cagtctgaat tccaggcgct ggcgttccac cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtt 480

tatgacgttg atccggcggc gaccgataaa ctggttcgta acctggcggc ggcggcgccg 540

gaactgcgtg ttgttcgttc taccggtgtt gcgcaggcgg ttcgtggtgc ggacatcgtt 600

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ggtatgcacc tgaacgcggt tggtggcgac tgtccgggta aaaccgaact ggcgaccgaa 720

gttgttgcga acgcgtctgt tttcgttgaa ttcgaaccgc agtctcgtat cgaaggcgaa 780

gttcagcaga tgccggcgaa ctctccggtt accgaactgt ggcgtgttct gaccatgcag 840

gcggcgggtc gtcgtaacat cgcggaagtt accctgttcg attctgttgg tttcgcgctg 900

gaagactatt ctgcgctgcg tctggttcgt gattgtgcga aagaaatggg cctgggtcgt 960

gaagcgtctc tgatcccggc gctggcggac ccgaaaaacc tgttcggtga actggcggcg 1020

gcgccgcagg cggcgcgtaa acaggcggcg taa 1053

<210> 6

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaccatga cccagctgac tactcaggac ctgactcaga tcgttgctac ccacggtctg 60

ccgactctgc tgggccgtct ggtggattac ctggaagcgg acttccgtcg ctgggaagac 120

tttgacaaat ccccgcgctc cgcggctcat tctccgggtg gtgttatcga actgatgccg 180

gttgcggaca ccaaagaata ctctttcaaa tacgtgaacg gtcacccggg caacactaaa 240

ctgggtctgt ccaccgtggt tgcgtttggc gttctggctg atgtggatac tggtatgccg 300

accctgatct ctgaactgac tctgaccacc gctctgcgta ccgctgctac ttctgttatg 360

gcggcgaaac tgctggctcg caaagactct cgtaccatgg cgctgatcgg caacggcgct 420

cagtctgaat ttcaggctct ggcttttcat cacctgctgg gtatccagga agttcgtgtg 480

tacgacgttg acccggctgc gaccgacaaa ctggttcgca acctggcggc tgctgctccg 540

gaactgcgtg tggttcgttc taccggtgtg gctcaggctg tgcgtggtgc ggatattgtt 600

accactgtta ccgcggacaa agcgaacgct gatatcctga ccccggaaat gatcgaaccg 660

ggcatgcacc tgaacgcggt tggtggtgat tgtccgggta aaaccgaact ggcgactgaa 720

gttgttgcta acgcgtccgt gtttgttgaa tttgaaccgc agtcccgcat cgaaggtgaa 780

gttcagcaga tgccggcgaa ctccccggtt actgaactgt ggcgtgttct gactatgcag 840

gcggctggcc gtcgtaacat cgcggaagtt actctgttcg attctgtggg cttcgctctg 900

gaagattatt ctgcgctgcg cctggtgcgc gactgtgcga aagaaatggg cctgggtcgt 960

gaagcgtccc tgattccggc gctggcggac ccgaaaaacc tgttcggtga actggctgcg 1020

gctccgcagg ctgcgcgtaa acaggctgct taa 1053

<210> 7

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgactatga cccaactgac tactcaggac ctgactcaga tcgttgcgac ccacggcctg 60

ccgaccctgc tgggccgtct ggtagactac ctggaagcgg acttccgtcg ttgggaagac 120

tttgacaaat ctccgcgttc tgcggcgcac tccccgggtg gcgttatcga actgatgccg 180

gtagcggata ccaaggaata ctctttcaaa tatgttaacg gtcatccggg caacaccaaa 240

ctgggtctgt ctaccgtagt agcgttcggt gttctggcgg acgttgacac tggtatgccg 300

actctgatta gcgagctgac cctgaccacc gcgctgcgta ccgcggcaac ctctgtaatg 360

gcggcaaaac tgctggcgcg caaagactct cgtaccatgg cgctgatcgg caacggtgcg 420

caatctgaat tccaagcgct ggcgttccac catctgctgg gtatccagga ggttcgtgtt 480

tatgacgtgg acccggcagc gaccgataaa ctggttcgta atctggctgc ggctgcaccg 540

gaactgcgcg tagttcgttc tactggcgtg gctcaggctg tgcgtggtgc ggacattgtt 600

accaccgtta ccgctgacaa agcgaacgca gatatcctga ccccggaaat gattgagccg 660

ggtatgcatc tgaacgctgt aggtggtgac tgcccgggta aaaccgagct ggcaactgaa 720

gtggttgcta atgcgtctgt tttcgttgaa ttcgaaccgc agtctcgtat cgaaggcgaa 780

gttcagcaaa tgccggctaa ctctccggtt actgagctgt ggcgtgtact gaccatgcag 840

gcagctggtc gccgtaacat cgcggaagtt accctgtttg acagcgtagg tttcgcactg 900

gaagattatt ctgcactgcg cctggtgcgc gactgtgcaa aagaaatggg cctgggtcgt 960

gaggcaagcc tgatcccggc actggctgat ccgaaaaacc tgttcggcga actggcagcg 1020

gctccgcagg ctgctcgcaa acaagcggca taa 1053

<210> 8

<211> 1116

<212> DNA

<213> Pseudomonas veronii

<400> 8

atggtggcac agcgagcaac tattatcctc tctgaggaaa acattggtga aattgtcgca 60

gcagtcgggc tcgacacttt aatggatgaa acgattgcaa aactacgtga tgccctcaac 120

gtgtttggtg atggccaggt tgaaatacaa ccgcgcaccg gctttgtcta tgaaactccg 180

gaaatggggc tgatagagtt tatgccggct taccgccggg ataaaaatgt cgcgttaaaa 240

gttgttggct accatccggg aaatccgttt aaccggggca tgccgacggt catcgccact 300

aactccctat atgacgtaag ggacggccac cttattgcgg tgatcgatgg tgtatttgca 360

acagcagtac gaacgggcgc agcatccgct gtggcttcga agttgctggc tcatcctgaa 420

agcaaaaccc ttgggctgat cggagctggc gccatggcag tgacccaggc ccatgccctc 480

agtcgaattt atgactttga cgcagtcttg atccacgata ttgaccccgc agtggaaaaa 540

actttcgcca agcgggtatc cgccctggga attacaccga tcatcgcttc caaagacagg 600

gtactggcag agtccgacat catctgtgtt gctacctcca ttggccttga tgcaggcccg 660

gttctccacg ctggcgggat gaaaccacat gtacacatca atgctattgg tgccgacacg 720

ccgcgcaaat atgaattatc aacagagctg ctcaaaagct cgttccttgt cacggattat 780

ctggaacagg ccattaacga aggtgaatgc cagcaattga gtaaagacga atacggctat 840

atcggccctg agttgcacaa aatagtgaaa gagccgcaag cctatatcca atatcagatg 900

aaacagacca tctttgatag caccggtatt tcattggaag atcagataat gaccgaggtc 960

ttgatcgatc aggcggagag actagggctt ggtcagcgga tcctgattga agcgggatgt 1020

gatgacccca tgaacccata tcttttctca aattccgcga acgctcttga taccgtcaag 1080

aatacagtgc acgaccgtac cttaaaatta gcatga 1116

<210> 9

<211> 371

<212> PRT

<213> Pseudomonas veronii

<400> 9

Met Val Ala Gln Arg Ala Thr Ile Ile Leu Ser Glu Glu Asn Ile Gly

1 5 10 15

Glu Ile Val Ala Ala Val Gly Leu Asp Thr Leu Met Asp Glu Thr Ile

20 25 30

Ala Lys Leu Arg Asp Ala Leu Asn Val Phe Gly Asp Gly Gln Val Glu

35 40 45

Ile Gln Pro Arg Thr Gly Phe Val Tyr Glu Thr Pro Glu Met Gly Leu

50 55 60

Ile Glu Phe Met Pro Ala Tyr Arg Arg Asp Lys Asn Val Ala Leu Lys

65 70 75 80

Val Val Gly Tyr His Pro Gly Asn Pro Phe Asn Arg Gly Met Pro Thr

85 90 95

Val Ile Ala Thr Asn Ser Leu Tyr Asp Val Arg Asp Gly His Leu Ile

100 105 110

Ala Val Ile Asp Gly Val Phe Ala Thr Ala Val Arg Thr Gly Ala Ala

115 120 125

Ser Ala Val Ala Ser Lys Leu Leu Ala His Pro Glu Ser Lys Thr Leu

130 135 140

Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ala Met Ala Val Thr Gln Ala His Ala Leu

145 150 155 160

Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Asp Ala Val Leu Ile His Asp Ile Asp Pro

165 170 175

Ala Val Glu Lys Thr Phe Ala Lys Arg Val Ser Ala Leu Gly Ile Thr

180 185 190

Pro Ile Ile Ala Ser Lys Asp Arg Val Leu Ala Glu Ser Asp Ile Ile

195 200 205

Cys Val Ala Thr Ser Ile Gly Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu His Ala

210 215 220

Gly Gly Met Lys Pro His Val His Ile Asn Ala Ile Gly Ala Asp Thr

225 230 235 240

Pro Arg Lys Tyr Glu Leu Ser Thr Glu Leu Leu Lys Ser Ser Phe Leu

245 250 255

Val Thr Asp Tyr Leu Glu Gln Ala Ile Asn Glu Gly Glu Cys Gln Gln

260 265 270

Leu Ser Lys Asp Glu Tyr Gly Tyr Ile Gly Pro Glu Leu His Lys Ile

275 280 285

Val Lys Glu Pro Gln Ala Tyr Ile Gln Tyr Gln Met Lys Gln Thr Ile

290 295 300

Phe Asp Ser Thr Gly Ile Ser Leu Glu Asp Gln Ile Met Thr Glu Val

305 310 315 320

Leu Ile Asp Gln Ala Glu Arg Leu Gly Leu Gly Gln Arg Ile Leu Ile

325 330 335

Glu Ala Gly Cys Asp Asp Pro Met Asn Pro Tyr Leu Phe Ser Asn Ser

340 345 350

Ala Asn Ala Leu Asp Thr Val Lys Asn Thr Val His Asp Arg Thr Leu

355 360 365

Lys Leu Ala

370

<210> 10

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggttgctc agcgtgctac catcatcctg tctgaagaaa acatcggtga aatcgttgct 60

gctgttggtc tggacaccct gatggacgaa accatcgcta aactgcgtga cgctctgaac 120

gttttcggtg acggtcaggt tgaaatccag ccgcgtaccg gtttcgttta cgaaaccccg 180

gaaatgggtc tgatcgaatt catgccggct taccgtcgtg acaaaaacgt tgctctgaaa 240

gttgttggtt accacccggg taacccgttc aaccgtggta tgccgaccgt tatcgctacc 300

aactctctgt acgacgttcg tgacggtcac ctgatcgctg ttatcgacgg tgttttcgct 360

accgctgttc gtaccggtgc tgcttctgct gttgcttcta aactgctggc tcacccggaa 420

tctaaaaccc tgggtctgat cggtgctggt gctatggctg ttacccaggc tcacgctctg 480

tctcgtatct acgacttcga cgctgttctg atccacgaca tcgacccggc tgttgaaaaa 540

accttcgcta aacgtgtttc tgctctgggt atcaccccga tcatcgcttc taaagaccgt 600

gttctggctg aatctgacat catctgcgtt gctacctcta tcggtctgga cgctggtccg 660

gttctgcacg ctggtggtat gaaaccgcac gttcacatca acgctatcgg tgctgacacc 720

ccgcgtaaat acgaactgtc taccgaactg ctgaaatctt ctttcctggt taccgactac 780

ctggaacagg ctatcaacga aggtgaatgc cagcagctgt ctaaagacga atacggttac 840

atcggtccgg aactgcacaa aatcgttaaa gaaccgcagg cttacatcca gtaccagatg 900

aaacagacca tcttcgactc taccggtatc tctctggaag accagatcat gaccgaagtt 960

ctgatcgacc aggctgaacg tctgggtctg ggtcagcgta tcctgatcga agctggttgc 1020

gacgacccga tgaacccgta cctgttctct aactctgcta acgctctgga caccgttaaa 1080

aacaccgttc acgaccgtac cctgaaactg gcttaa 1116

<210> 11

<211> 1095

<212> DNA

<213> Streptomyces hirsutus

<400> 11

atgatcttgc aagctgagcg cacgcacatc gtcgacgccg aagccgtcgc caccatcgtc 60

acgaaggtgg gactggggca actctacgac ctgaccatcg cccgcatgga ggcggctctc 120

accggtggac ccggtgcgcc ggtggagatg aagcagcggg acggtttcct gctggagaca 180

ccgcagttgg gcctgctcga gtggatgccg gcggtccgcc aaggcaccac ggtctccatc 240

aagatggtcg cctacaaccc gcacaatccg gtcaagaacc agctgcccac catcctgtcg 300

acactgtgcg ccttcgacac ggacagcggc caccttcgtg ccgtcgtcga cggcacgttc 360

gccaccgccg tccgtacggg cgcggcgtcc gcactggcca gccgggtgct cgctcgcccg 420

gactccgccg tgctcggcct ggtgggctgc ggtgcccagg cggtcacgca gttgcacgcc 480

ctggcacgcg tcttctcgtt ctccgaggtg ctcgtccacg acaaggacgc gcgggcggag 540

cgatccttcg cggcgagggc ccggatgccc gaggggctgg tgcgcgtcgc gccgctcgcg 600

gaggtggagg agcgggccga cgtgctgtgc accgccacct cggtcggccc ccacgagggg 660

ccggtcatcc ggggcacgtc actcaagccc tgggtgcacg tcaacaccat cggatcggac 720

atgccgggca agacggagct gccgctggac cttctgcgcg cggcggtcgt ctgcccggac 780

cacgtggagc aggcacgggc cgagggtgac tgccagcagc tcgcccccga ggagatcggg 840

gctccgctcc ccgacctgct gcgtgatccg gacgcgcacc gcaggctgtc gccggtcacc 900

accgtgtacg actcgacagg tctcgcgctg caggatctcg tcatggtgga ggtgctggag 960

gagttggcgc gggacctcga cgtcggacac cacgtcttca tcgaggcgac ggccgacgac 1020

ccgcaggacc cgtactcgtt cctccctgcg gaggtcaccc ggtccctggc cggcacggcc 1080

ggagcgcgac gatga 1095

<210> 12

<211> 364

<212> PRT

<213> Streptomyces hirsutus

<400> 12

Met Ile Leu Gln Ala Glu Arg Thr His Ile Val Asp Ala Glu Ala Val

1 5 10 15

Ala Thr Ile Val Thr Lys Val Gly Leu Gly Gln Leu Tyr Asp Leu Thr

20 25 30

Ile Ala Arg Met Glu Ala Ala Leu Thr Gly Gly Pro Gly Ala Pro Val

35 40 45

Glu Met Lys Gln Arg Asp Gly Phe Leu Leu Glu Thr Pro Gln Leu Gly

50 55 60

Leu Leu Glu Trp Met Pro Ala Val Arg Gln Gly Thr Thr Val Ser Ile

65 70 75 80

Lys Met Val Ala Tyr Asn Pro His Asn Pro Val Lys Asn Gln Leu Pro

85 90 95

Thr Ile Leu Ser Thr Leu Cys Ala Phe Asp Thr Asp Ser Gly His Leu

100 105 110

Arg Ala Val Val Asp Gly Thr Phe Ala Thr Ala Val Arg Thr Gly Ala

115 120 125

Ala Ser Ala Leu Ala Ser Arg Val Leu Ala Arg Pro Asp Ser Ala Val

130 135 140

Leu Gly Leu Val Gly Cys Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Leu His Ala

145 150 155 160

Leu Ala Arg Val Phe Ser Phe Ser Glu Val Leu Val His Asp Lys Asp

165 170 175

Ala Arg Ala Glu Arg Ser Phe Ala Ala Arg Ala Arg Met Pro Glu Gly

180 185 190

Leu Val Arg Val Ala Pro Leu Ala Glu Val Glu Glu Arg Ala Asp Val

195 200 205

Leu Cys Thr Ala Thr Ser Val Gly Pro His Glu Gly Pro Val Ile Arg

210 215 220

Gly Thr Ser Leu Lys Pro Trp Val His Val Asn Thr Ile Gly Ser Asp

225 230 235 240

Met Pro Gly Lys Thr Glu Leu Pro Leu Asp Leu Leu Arg Ala Ala Val

245 250 255

Val Cys Pro Asp His Val Glu Gln Ala Arg Ala Glu Gly Asp Cys Gln

260 265 270

Gln Leu Ala Pro Glu Glu Ile Gly Ala Pro Leu Pro Asp Leu Leu Arg

275 280 285

Asp Pro Asp Ala His Arg Arg Leu Ser Pro Val Thr Thr Val Tyr Asp

290 295 300

Ser Thr Gly Leu Ala Leu Gln Asp Leu Val Met Val Glu Val Leu Glu

305 310 315 320

Glu Leu Ala Arg Asp Leu Asp Val Gly His His Val Phe Ile Glu Ala

325 330 335

Thr Ala Asp Asp Pro Gln Asp Pro Tyr Ser Phe Leu Pro Ala Glu Val

340 345 350

Thr Arg Ser Leu Ala Gly Thr Ala Gly Ala Arg Arg

355 360

<210> 13

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgatcctgc aggctgaacg tacccacatc gttgacgctg aagctgttgc taccatcgtt 60

accaaagttg gtctgggtca gctgtacgac ctgaccatcg ctcgtatgga agctgctctg 120

accggtggtc cgggtgctcc ggttgaaatg aaacagcgtg acggtttcct gctggaaacc 180

ccgcagctgg gtctgctgga atggatgccg gctgttcgtc agggtaccac cgtttctatc 240

aaaatggttg cttacaaccc gcacaacccg gttaaaaacc agctgccgac catcctgtct 300

accctgtgcg ctttcgacac cgactctggt cacctgcgtg ctgttgttga cggtaccttc 360

gctaccgctg ttcgtaccgg tgctgcttct gctctggctt ctcgtgttct ggctcgtccg 420

gactctgctg ttctgggtct ggttggttgc ggtgctcagg ctgttaccca gctgcacgct 480

ctggctcgtg ttttctcttt ctctgaagtt ctggttcacg acaaagacgc tcgtgctgaa 540

cgttctttcg ctgctcgtgc tcgtatgccg gaaggtctgg ttcgtgttgc tccgctggct 600

gaagttgaag aacgtgctga cgttctgtgc accgctacct ctgttggtcc gcacgaaggt 660

ccggttatcc gtggtacctc tctgaaaccg tgggttcacg ttaacaccat cggttctgac 720

atgccgggta aaaccgaact gccgctggac ctgctgcgtg ctgctgttgt ttgcccggac 780

cacgttgaac aggctcgtgc tgaaggtgac tgccagcagc tggctccgga agaaatcggt 840

gctccgctgc cggacctgct gcgtgacccg gacgctcacc gtcgtctgtc tccggttacc 900

accgtttacg actctaccgg tctggctctg caggacctgg ttatggttga agttctggaa 960

gaactggctc gtgacctgga cgttggtcac cacgttttca tcgaagctac cgctgacgac 1020

ccgcaggacc cgtactcttt cctgccggct gaagttaccc gttctctggc tggtaccgct 1080

ggtgctcgtc gttaa 1095

Claims (6)

1.全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，其特征是，以L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及重组宿主菌，通过生物催化制备L-2-哌啶甲酸；其中重组宿主菌为含有Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白编码基因的重组宿主菌、含有Pseudomonas veronii CIP104663蛋白编码基因的重组宿主菌或者含有Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白编码基因的重组宿主菌中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，其特征是，所述重组宿主菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，其特征是，反应在pH8.0的磷酸钾缓冲溶液中进行。

4.根据权利要求1或2所述的全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，其特征是，反应温度为20℃-30℃。

5.根据权利要求1或2所述的全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，其特征是，反应在摇床上进行，摇床转速为180rpm。

6. 根据权利要求1或2所述的全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，其特征是，重组宿主菌的浓度为50g/L-150g/L。