CN110564659A

CN110564659A - 耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法

Info

Publication number: CN110564659A
Application number: CN201910878309.3A
Authority: CN
Inventors: 王智文; 李书廷; 陈聪; 陈涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN110564659B

Abstract

本发明公开了耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法，包括如下步骤：将筛选的含有大肠杆菌全局调控因子CRP的第142位氨基酸G被I置换的突变位点的基因，引入野生型大肠杆菌中，得到耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌CRP‑G142I；本发明从大肠杆菌全局调控因子出发，理性设计饱和突变，除了有效节约成本以及避免盲目性之外，充分利用了原核生物调控网络成等级性的特点，实现了微小扰动基因改变操作下完成了宿主菌基因组大范围网络的表达水平的扰动，从而协调不同的生理代谢活动，以使菌体对外界环境的变化做出应答，从而也使得规避了很多基因型表型之间复杂性的麻烦，也解决了因为实验限制而无法获得最优表型的问题。

Description

耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明属于大肠杆菌全局调控因子工程及大肠杆菌耐受性工程的领域，具体涉及一株耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法。

背景技术

为了满足全球对能量的需求以及减少化石燃料对环境带来的负面影响，生物燃料成为石油的潜在替代品，已经成为大家关注的焦点。而高级醇中异丁醇因为本身的高能量密度，低蒸汽压力以及低湿性特点被称为了新一代生物燃料。但利用廉价的木质纤维素生产生物燃料的工业发酵是一个复杂多层面的过程，为了提高产品的浓度，生产速率和得率，需要进一步改进菌株的鲁棒性，其中最主要就是改进菌株对不利条件的耐受性。发酵过程中的不利因素包括对发酵原料木质纤维素预处理中产生的高浓度抑制性产物(如乙酸盐，糠醛)、溶剂型化学品和生物燃料本身(如异丁醇)具有的毒性以及外界环境渗透压，极端pH等，在这些因素中乙酸盐是目前广泛研究的大肠杆菌生长抑制剂之一，不仅是木质纤维素的衍生物，也是很多其他微生物发酵的副产品，其在大肠杆菌发酵液中浓度较高并且有研究证明(chong et al.,2013)在浓度超过5g/L时，会抑制细胞增长，尤其在过量糖存在时，会限制高密度菌株的生长和重组蛋白的产生，对于加强乙酸盐耐受性工程菌对于生物过程是很有价值的；其次，在8g/L就会损害细胞生长的异丁醇对大肠杆菌的毒理与其他高级长链醇是类似的，都体现在改变磷脂组成和细胞膜流动性，降低细胞内pH和ATP的浓度，以致抑制菌体对葡萄糖的摄取，从而限制了高级醇的产量，也是工业化生产关注的热点；最后以渗透压为代表的胞外环境会影响微生物关键酶的最佳活性和代谢，最终导致微生物生产力和生物活性降低。这些因素都是限制达到最优产量的瓶颈。而研究证明这些不利因素往往是同时存在，且具有协同作用，所以提高菌株的多重耐受性是提高菌株发酵性能，最终得到最优产量的重要策略之一。

大肠杆菌的耐受性是由多基因控制的复杂表型，同时进行多基因修饰可以极大地促进高耐受表型的获得，但同时引入多基因修饰的能力非常有限。研究表明，原核生物和真核生物都具有金字塔式的基因表达等级调控网络，而全局调控因子位于金子塔的顶端，是调控水平最高的调控因子。而环腺苷酸受体蛋白质(CRP)是大肠杆菌重要的全局转录调控因子，能够直接调控超过490个基因的表达(Ravcheev et al.,2013)，通过对其他转录调控因子直接或间接调控，CRP可以对大肠杆菌一半左右的基因起到调控作用，故，通过对该调控因子(CRP)的突变，可以实现对大肠杆菌细胞网络的全局扰动，解决同时修饰多个基因的限制，规避了表型与基因型之间复杂的麻烦，以此来协调不同的生理代谢活动，致使菌体细胞对外界环境的变化做出应答(Gottesman et al.,2007)。

而目前现有提高大肠杆菌耐受性方面，对于CRP基因的研究也有很多，包括通过138位氨基酸的突变来获得提高乙酸盐的耐受性菌株，通过179位和199位氨基酸的突变来获得提高异丁醇的耐受性菌株和通过69、130、52、119、74、87、114、43、71等的氨基酸的突变获得具有耐高渗透压的耐受性菌株，但目前对于全局调控因子CRP的142位氨基酸的突变以及工程菌株CRP-G142I，甚至同时提高了乙酸钠，氯化钠和异丁醇耐受性3种耐受性均未有报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌。

本发明的第二个目的是提供一种耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌的构建方法。

本发明的技术方案概述如下：

耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌构建方法，包括如下步骤：将筛选的含有大肠杆菌全局调控因子CRP的第142位氨基酸G被I置换的的突变位点的基因，引入野生型大肠杆菌中，得到耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌CRP-G142I；

所述大肠杆菌全局调控因子CRP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述大肠杆菌全局调控因子CRP的第142位氨基酸G被I置换的突变位点获得的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

权利要求1的方法构建的耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌CRP-G142I。

本发明的优点

本发明的构建的耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌CRP-G142I在乙酸钠(30g/L)条件下较对照的48h生物量提高了1633.96％，最大比生长速率提高了313.82％；在氯化钠(0.6mol/L)中48h生物量提高了35.12％，最大比生长速率提高了75.89％；在异丁醇(8g/L)中36h生物量提高了73.78％，最大比生长速率提高了37.25％。

本发明从大肠杆菌全局调控因子出发，理性设计饱和突变，除了有效节约成本以及避免盲目性之外，充分利用了原核生物调控网络成等级性的特点，实现了微小扰动基因改变操作下完成了宿主菌基因组大范围网络的表达水平的扰动，从而协调不同的生理代谢活动，以使菌体对外界环境的变化做出应答，从而也使得规避了很多基因型表型之间复杂性的麻烦，也解决了因为实验限制而无法获得最优表型的问题。

从大肠杆菌全局调控因子层面结合新兴遗传工程技术进行基因突变可快速获得理想的表型，即达到提高大肠杆菌多重耐受性的目的，也进一步为研究耐受性机理提供依据。

附图说明

图1为不同突变文库重组菌在20g/L乙酸钠浓度下的生物量(48h生物量)。

图2为CRP-G142I在30g/L乙酸钠胁迫条件下的耐受情况。

图3为CRP-G142I在0.6mol/L氯化钠胁迫条件下的耐受性情况。

图4为CRP-G142I在8g/L异丁醇胁迫条件下的耐受性情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用的原始菌株大肠杆菌Escherichia coli str.K-12MG1655是购于ATCC保藏的典型菌株(700926)。以下简称MG1655

本发明中包括两种培养基，LB培养基和M9基本盐培养基。配方分别为(溶剂均为水)：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠10g/L。

M9基本盐培养基：

大量元素：4％碳源(木糖)、NaH₂PO₄·7H₂O 12.8g/L、KH₂PO₄3g/L、氯化钠0.5g/L、NH₄Cl1g/L、MgSO₄0.24g/L、CaCl₂0.011g/L。

微量元素:FeCl₃·6H₂O 3.2mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.4mg/L、CuCl₂·2H₂O 0.2mg/L、ZnCl₂0.4mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.4mg/L、MnCl₂·4H₂O 0.4mg/L H₃BO₃0.1mg/L。

所用乙酸钠，异丁醇和氯化钠等胁迫条件药品均从sigma公司购买。

(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)

实施例1大肠杆菌全局调控因子突变文库的构建

全局调控因子突变文库的构建分为两部分：全局调控因子的设计合成和含有全局调控因子突变的多样性文库菌群。

全局调控因子的设计和合成

基于CRISPR可追踪基因组工程***(CREATE)，包括3组质粒:

***糖诱导Cas9蛋白表达的X2-cas9质粒、

热激诱导表达λ-red重组***的温度敏感型的pSIM5质粒

和gRNA以及供体DNA表达的全局调控因子文库质粒(Garst etal.,2016)。

其中全局调控因子文库质粒是混合质粒，共分为5组，该5组文库质粒是由相应的全局调控因子相应位点的饱和突变所组成，共包含34340个位点饱和突变。该文库质粒的设计合成的过程是：

首先，根据文献调研和调控因子的数据库RegulonDB和EcoCyc的分析，确定拟突变的20个大肠杆菌全局调控因子具体包括：HNS、CspA、ArcA、Fur、NarL、Lrp、Mlc、IHF、CspE、ArgP、CRP、PhoB、CytR、DnaA、RpoS、RpoN、RpoE、FNR、SoxR和FIS。再结合数据库如：NCBI、Uniprot等和蛋白质模拟预测信息软件如：I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)对20个全局调控因子的关键作用位点，如活位点、DNA结合位点、配体结合位点、金属结合为点和二聚体作用位点等上述位点信息进行收集提取并作为饱和突变位点。而后，利用全局调控因子突变文库自动化设计工具Bioverse(http://www.thebioverse.org/)设计突变文库。接着，将设计的文库序列经由美国安捷伦公司(Agilent Technologies)合成，将公司合成的CREATE文库片段，首先经过20轮PCR延伸反应，延伸产物利用6％的PAGE胶分离和纯化。纯化后的产物，再利用设计的携带不同barcode引物进行子文库的扩增(扩增文库引物序列表如表1所示)，最后利用Gibson组装方法连接到全局调控因子突变文库载体质粒，从而得到含有20个全局调控因子的34340个突变的5个不同的全局调控因子的质粒子文库，依据突变位点的功能将其分为5个全局调控因子文库分别为：功能位点为活位点的G1、功能位点为DNA结合位点的G2和G3、功能位点为二聚体的G4和以及预测位点的G5。

表1扩增文库引物序列表

含有全局调控因子突变的多样性文库菌群

除以上质粒之外还有一个空白质粒(nrg)(Garstetal.,2016)后续用来作为空白对照。

首先将X2-cas9和pSIM5质粒通过电转(2.5kv)依次导入MG1655中，得到MGZC(MG1655,harboring psim5,harboring cas9)菌株，而后将5个突变文库质粒和一个对照质粒(nrg)通过电转分别导入MGZC中，30℃，3h,LB培养基复苏，而后转接于50mlLB培养基中，37℃、220rpm,LB培养基中进行过夜培养，然后保菌，获得5个全局突变文库(G1，G2，G3，G4，G5)菌群(以下简称为G1，G2，G3，G4，G5)和一个对照菌株(nrg)，放于-80℃保存备用。

实施例2乙酸钠胁迫条件下不同突变文库重组菌的富集筛选

以实施例1中构建的大肠杆菌全局调控因子突变文库菌群为基础，在10g/L-30g/L的乙酸钠胁迫条件下，通过逐渐提高筛选压力，从而进行正向文库突变菌群的富集。本筛选过程中活化培养基用的是LB培养基，筛选培养基用的是M9基本盐培养基。

首先将-80℃保存的6支菌株(G1、G2、G3、G4、G5、ntg)的1ml融化的菌液全部接于5ml的LB试管(15ml规格的试管)中37℃、220rpm过夜培养，而后6ml菌液全部转接于50ml的LB培养基中(250ml规格的锥形瓶)培养至OD₆₀₀为5-6时，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1为初始OD转接至乙酸钠终浓度为10g/L的M9基本盐培养基中进行筛选，富集正向突变文库菌群。培养过程中待优势菌群长到对数生长中期时，同样以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1为初始OD转接到下一个含有高浓度乙酸钠的M9基本盐培养基中，进行耐受性筛选，本实验共连续转接3次，选取的乙酸钠浓度依次为10g/L、20g/L、30g/L。完成每个胁迫条件筛选后保存菌种，放于-80℃，保存备用。通过测定不同突变文库重组菌在不同乙酸钠浓度下的生物量，得到了不同的突变文库重组菌在不同乙酸钠浓度下的菌体生长情况。图1显示的是不同突变文库重组菌在乙酸钠浓度20g/L下的生物量(48h生物量)。

通过以上耐受性筛选富集正向突变菌群，得到了能够耐受20g/L乙酸钠的文库重组菌群，分别是：G1、G2、G3、G4和G5。

因为借助CREATE技术构建的突变菌群，耐受性筛选后，每个细胞内大肠杆菌全局调控因子突变与其携带的CREATE质粒文库的突变一致。故将得到的这5个优势重组菌群，提取质粒，用于深度测序和适应度分数计算，从而获得适应度较高的突变大肠杆菌全局调控因子突变。

深度测序是利用报道的Golaybarcodes(Hamady et al.,2008)设计Illumina兼容性引物，以混合质粒为模板，经过20轮PCR反应扩增CREATE文库。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后使用试剂盒纯化。根据Illumina测序要求，分配实验测序序列，进行Illumina深度测序。适应度分数又称富集分数，公式如下：

Fx,f是CREATE盒子X在筛选富集后的频率，Fx,i是CREATE盒子X在筛选前的频率，W表示每个突变的绝对适应度，突变的频率是指测序中的每个突变占测序中所有readcounts的比例。通过适应度分数的评价，来评估每个突变在乙酸钠筛选压力条件下的适应度贡献。对实验数据进行分析，每个耐受性筛选富集后的数据达到95％的置信区间估计，推断突变的适应度分数在统计学上是显著的，作为潜在的耐受性正向突变。

综上，本实施例中，获得1个与乙酸钠耐受性相关的潜在的正向突变，是大肠杆菌全局调控因子CRP的142位的氨基酸G(甘氨酸)被I(异亮氨酸)置换，且富集分数为5.0946。

大肠杆菌全局调控因子CRP的第142位氨基酸G被I置换的突变位点获得的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3.突变菌株CRP-G142I的构建

将实施例2获得的CRP潜在耐受性正向突变，利用基于I-Scel的DNA双链断裂基因重组技术，从野生型大肠杆菌MG1655出发，对野生型大肠杆菌MG1655的基因组进行无痕编辑，在基因组上引入目的突变，获得重构菌株。而后将获得的突变重构菌株分别在乙酸钠30g/L的耐受性条件下培养，进一步验证筛选得到的大肠杆菌全局调控因子突变的效应。具体操作如下：

突变重构菌株的构建:

(1).用于crp基因编辑的重组片段的制备

该重组片段的制备共分为3步

第一步,以野生型大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，使用高保真酶Phata MaxSuper-Fidelity DNA聚合酶(以下简称Phata DNA聚合酶)和引物CRP-F1(SEQ ID NO.8)/CRP-142I-L1(SEQ ID NO.9)以及CRP-142I-F2(SEQ ID NO.10)/CRP-L2(SEQ ID NO.11)分别进行PCR扩增获得引入突变的上游(580bp)和下游(554bp)同源臂，分别称为片段Ⅰ(580bp)和片段Ⅳ(554bp)。

第二步，以pTKS/CS质粒((Lin et al.,2014)DNA为模板，使用高保真酶PhataDNA聚合酶和引物CRP142I-tet-F1(SEQ ID NO.12)/Tet-R(SEQ ID NO.15)、Tet-F(SEQ IDNO.14)/CRP142I-tet-L2(SEQ ID NO.13)(分别进行PCR扩增得到四环素抗性基因标签的两个片段(称为片段II和III)，基因片段大小分别约为900bp和800bp，包含有I-SceI识别位点序列和四环素基因启动子序列。

第三步，将前两步得到的片段I、II、III、IV，分阶段进行融合PCR扩增，获得I+II融合片段(使用引物CRP-F1(SEQ ID NO.8)/Tet-R(SEQ ID NO.15))，III+IV融合片段(使用引物Tet-F(SEQ ID NO.14)/CRP-L2(SEQ ID NO.11))，可进一步用引物CRP-F1(SEQ IDNO.8)/CRP-L2(SEQ ID NO.11)PCR扩增获得I+II+III+IV融合片段，扩增酶同样用的是高保真的Phata DNA聚合酶。最终得到的融合片段(I+II+III+IV)是包含有突变的crp基因的上下游同源臂、I-SceI识别位点序列及四环素基因的重组片段。

(2)无痕基因组编辑所用重组片段的电转化，阳性克隆筛选及验证

以已经消化了辅助质粒pTKRED(Kuhlman etal.,2010)的野生型MG1655为出发菌，通过电转(1.8kv)将(1)中第三步得到的融合片段(I+II+III+IV)导入该消化了辅助质粒pTKRED的野生型MG1655中，30℃，220rpm复苏3小时，而后取100μL菌液涂在含有IPTG(2mM)、奇霉素(终浓度为100ug/L)和四环素(终浓度为20ug/L)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物CRP-F1(SEQ ID NO.8)/CRP-L2(SEQ ID NO.11)进行测序验证，挑选正确的引入突变的单菌落于5mlLB培养基(添加终浓度2mMIPTG，0.4％***糖，100ul/ml的奇霉素)的15ml规格试管中，220rpm、30℃培养24h，而后取菌液涂布于含有终浓度2mMIPTG，0.4％***糖，100ul/ml的奇霉素的LB平板上，而后挑取长出的单菌落用引物CRP-F1(SEQ ID NO.8)/CRP-L2(SEQ ID NO.11)进行菌落PCR以及测序验证，得到成功引入突变的重组菌株，命名为CRP-G142I：，并将菌株存于-80℃备用。所用引物如表2所示。

表2菌株构建所用引物序列

实施例4.突变菌株CRP-G142I的乙酸钠耐受性评价

取上述实施例3中构建的突变菌株和野生型菌株MG1655(对照菌)接种于5mlLB培养基的15ml规格的试管中培养12h，而后从试管中取1ml菌液转接于50mlLB培养基的250ml规格锥形瓶子中培养12h以达到活化种子的目的。在将上述活化的种子以初始OD为0.1的初始OD值接种在含有终浓度30g/L乙酸钠的M9基本盐培养基中进行乙酸盐耐受性验证，并以12h测一次OD，得到突变优势重构菌株以及野生型对照菌株的耐受情况如图2所示。

综上，依据生长情况，得到了有利耐受乙酸盐的全局调控因子CRP突变：

crp基因编码的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的G142位，用I置换G；

并且CRP-G142I在乙酸钠(30g/L)条件下较对照的48h生物量提高1633.96％，比生长那个速率提高了313.82％。

实施例5.突变菌株CRP-G142I的氯化钠耐受性评价

同样取上述实施例3中构建的突变菌株CRP-G142I和野生型菌株MG1655(对照菌)用类似于实施例4中的方法在0.6mol/L的氯化钠中进行耐受性评价如图3所示，突变菌株CRP-G142I在整个生长过程中的生长较野生型菌株MG1655(对照菌)均有优势，且在48h生物量，提高了35.12％；且最大比生长速率提高了75.89％。

实施例6.突变菌株CRP-G142I的异丁醇耐受性评价

同样取上述实施例3中构建的突变菌株CRP-G142I和野生型菌株MG1655(对照菌)用类似于实施例4中的方法8g/L异丁醇中进行耐受性评价如图4所示，发现突变菌株CRP-G142I在12h之后较野生型菌株MG1655(对照菌)有明显的生长优势，且在36h的生物量较对照提高了73.78％，且最大比生长速率提高了37.25％。

综上所述，获得了高耐受乙酸钠、渗透压相关氯化钠的和异丁醇的突变菌株CRP-G142I。

参考文献：

[1]Chong H,Yeow J,Wang I,et al.Improving Acetate Tolerance ofEscherichia coli by Rewiring Its Global Regulator cAMP Receptor Protein(CRP)[J].PLOS ONE,2013,8.

[2]Ravcheev D A,Best A A,Sernova N V,et al.Genomic reconstruction oftranscriptional regulatory networks in lactic acid bacteria[J].BMC Genomics,2013,14(1):94-94.

[3]Gottesman,Susan.Bacterial Regulation:Global Regulatory Networks[J].Annual Review of Genetics,1984,18(1):415-441.

[4]Garst A D,Bassalo M C,Pines G,et al.Genome-wide mapping ofmutations at single-nucleotide resolution for protein,metabolic and genomeengineering[J].Nature Biotechnology,2016,35(1):48-55.

[5]Hamady M,Walker J J,Harris J K,et al.Error-correcting barcodedprimers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex[J].NATUREMETHODS,2008,5(3):235-237.

[6]Lin Z,Xu Z,Li Y,et al.Metabolic engineering of Escherichia colifor the production of riboflavin[J].Microbial Cell Factories,2014,13(1).

[7]Kuhlman T E,Cox E C.Site-specific chromosomal integration of largesynthetic constructs[J].Nucleic Acids Research,2010,38(6):e92-e92.

序列表

<110> 天津大学

<120> 耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌及其构建方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 210

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Thr Leu Ile His

20 25 30

Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 2

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcacgctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420

acgattcgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agataaaaaa aatccttagc tttcgctaag gatgatttct ggtcctctgg cggaaagcct 60

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agataaaaaa aatccttagc tttcgctaag gatgatttct ggttcggatc gcaggctgca 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agataaaaaa aatccttagc tttcgctaag gatgatttct ggcctgtctt ggcggacaca 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agataaaaaa aatccttagc tttcgctaag gatgatttct ggaagagcac cgccttcgtc 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agataaaaaa aatccttagc tttcgctaag gatgatttct ggttccagct cgaaggcgat 60

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattaccgtg cagtacagtt gatagcccct tcccag 36

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgttttgcca gattcagcag agtctgtgca atgcgaatcg tcacgtcgag gaacgccag 59

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcattgcac agactctgct gaatctggca aaacaaccag acgctatgac tcacccgga 59

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccaagtacc agcgttaatc cggtcagcaa aaaggg 36

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcattgcac agactctgct gaatctggca aaacataggg ataacagggt aatgtacca 59

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgttttgcca gattcagcag agtctgtgca atgcggccat cattaccctg ttatcccta 59

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtggttcggt tggttagg 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctattcttc ctgccacaa 19

Claims

1.耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌构建方法，其特征是包括如下步骤：将筛选的含有大肠杆菌全局调控因子CRP的第142位氨基酸G被I置换的的突变位点的基因，引入野生型大肠杆菌中，得到耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌CRP-G142I；所述大肠杆菌全局调控因子CRP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述大肠杆菌全局调控因子CRP的第142位氨基酸G被I置换的突变位点获得的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1的方法构建的耐乙酸钠、氯化钠和异丁醇的大肠杆菌CRP-G142I。